劉王靜,孫端陽,王興枝子,龍喜帶,趙志文,黃炳臣

(1. 右江民族醫(yī)學院研究生學院,廣西 百色 533000;2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科,廣西 百色 533000)

胃癌是起源于黏膜上皮或腺上皮的具有高度異質性的消化道常見惡性腫瘤之一,在我國胃癌的發(fā)病率和死亡率僅次于肺癌[1-2]。細胞信號轉導通路的異常激活或抑制與胃癌細胞的惡性增殖密切相關。出核因子(chromosome maintenance region1,CRM1),也稱輸出蛋白1(XPO1),是多種腫瘤抑制蛋白和致癌蛋白進行核輸出載體蛋白,其異?？梢鸺毎フ９δ懿⑴c腫瘤性轉化相關。細胞因子信號傳導抑制因子1(SOCS1),參與JAK/STAT信號通路發(fā)揮抑制作用,JAK/STAT信號通路可以被多種細胞因子、激素及生長因子刺激誘導,刺激SOCS1的表達,繼而又對細胞因子信號轉導進行反饋抑制,SOCS1也可直接抑制STAT的受體與相應的結合位點結合,參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究以免疫組織化學方法檢測低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變、進展期胃癌及對應癌旁組織中CRM1、SOCS1的表達變化,分析其與患者臨床病理特征的關系及預后。

1 資料與方法

1.1病例 選擇右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院2019年4月至2020年8月期間胃鏡下活檢取材低級別上皮內瘤變胃組織標本27例、高級別上皮內瘤變組織標本26例、胃癌組織標本67例及對應癌旁胃黏膜組織標本67例( 距胃癌組織≥5cm)。67例胃癌患者中,男性44例,女性23例,年齡范圍29～79歲,平均年齡(55.67±11.92)歲,<60歲44例,≥60歲23例;腫瘤最大直徑≥5 cm有40例,<5 cm有27例;T分期:T1期12例,T2期14例,T3期29例,T4期12例;淋巴結轉移51例,無淋巴結轉移16例;HP感染陽性12例,陰性55例;Laurén分型:腸型22例,彌漫型40例,混合型5例。所有病例術前均未接受放化療、生物治療或靶向治療,不伴有其他嚴重內科疾病或惡性腫瘤,研究經倫理委員會審查。

1.2隨訪 所有患者均通過電話進行術后總生存時間(overall survival,OS)隨訪,以月為單位并記錄相應的生存時間。以胃癌確診時間為起點,觀察終止時間為患者死亡日期或腫瘤復發(fā)轉移或失訪,隨訪時間范圍為0.36～37.98個月,中位生存11.96個月,失訪患者有19例,11例死亡,37例存活。

1.3方法 內鏡小活檢標本離體30 min內經10%中性福爾馬林固定6～12 h,手術切除標本離體30 min內切開固定24～36 h,常規(guī)石蠟包埋,3 μm連續(xù)切片,HE染色后于鏡下觀察;免疫組織化學染色采用EnVision法,鼠抗人CRM1和SOCS1單克隆抗體、免疫組化顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術有限公司,具體操作均嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.4結果判讀 CRM1和SOCS1陽性為腫瘤細胞胞核和/或胞漿著色。以腫瘤細胞胞漿或胞核染色強度計分: 0分不著色;1分淡黃色;2分棕黃色;3分棕褐色。任取10個高倍視野(HPF),按陽性表達的腫瘤細胞占所有腫瘤細胞百分比計分: 0分為陰性;1分為陽性細胞數≤25%;2分為26%～50%;3分為51%～75%;4分為陽性腫瘤細胞≥76%。最后兩項記分相乘得分≤3分為低表達,>3分為高表達。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析。癌組織與癌旁組織間CRM1、SOCS1表達情況的比較使用配對χ2檢驗,CRM1、SOCS1表達情況與臨床病理特征的關系采用χ2檢驗或連續(xù)性校正χ2檢驗。采用Kaplan-Meier Plotter繪制生存曲線圖,多因素Cox分析胃癌CRM1及SOCS1表達與患者生存期之間的關系。

2 結果

2.1CRM1在癌旁組織、低級別瘤變、高級別瘤變和胃癌中的表達 細胞核和/或胞漿著色呈淡黃、棕黃及棕褐色為CRM1陽性表達,見圖1。CRM1在癌旁組織、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變及胃癌組織中的高表達率分別為7.46%(5/67)、62.96%(17/27)、73.08%(19/26)和64.18%(43/67),CRM1在低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變及胃癌組織中的高表達率均明顯高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計學意義(分別為χ2=33.068,P<0.001;χ2=42.118,P<0.001;χ2=46.874,P<0.001),而在低級別、高級別上皮內瘤變和癌組織中的高表達率組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

注:A.CRM1在癌旁組織中的上皮細胞核及胞漿未見表達;B.CRM1在低級別上皮內瘤變細胞核及胞漿呈淡黃色表達;C.CRM1在高級別上皮內瘤變細胞核及胞漿黃色表達;D.CRM1在胃癌組織中細胞核及細胞漿棕黃色表達。

表1 胃癌不同演進階段的CRM1、SOCS1表達情況

2.2SOCS1在癌旁組織、低級別瘤變、高級別瘤變和胃癌中的表達 細胞核和/或胞漿著色呈淡黃、棕黃及棕褐色為SOCS1陽性表達,見圖2。SOCS1在癌旁組織、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變及胃癌組織中的高表達率分別為68.66%(46/67)、59.26%(16/27)、50.00%(13/26)和29.85%(20/67),SOCS1在癌組織中的高表達明顯低于在癌旁組織和低級別瘤變中的表達,差異具有統(tǒng)計學意義(分別為χ2=20.184,P<0.001;χ2=7.043,P=0.008),見表1。

注:E.SOCS1在癌旁組織中細胞核及細胞漿棕褐色表達;F.SOCS1在低級別上皮內瘤變細胞核及細胞漿呈黃色表達;G.SOCS1在高級別上皮內瘤變中部分細胞核及細胞漿淡黃色表達;H.SOCS1在胃癌組織中細胞核及細胞漿表達極低或不表達。

2.3胃癌組織中CRM1及SOCS1的表達與患者臨床病理參數的關系 結果顯示,T1+T2期和T3+T4期的高表達率分別為42.31%(11/26)和78.05%(32/41),CRM1在T3+T4期組的高表達率明顯高于T1+T2組的高表達率(χ2=8.841,P=0.003),有淋巴結轉移和無淋巴結轉移的高表達率分別為76.47%(39/51)和25.00%(4/16),CRM1在有淋巴結轉移的高表達率明顯高于無淋巴結轉移組(χ2=14.035,P<0.001)。與患者年齡、性別、腫瘤大小、是否HP感染及Laurén分型臨床病理參數無關(P>0.05),見表2。

2.4胃癌組織中CRM1表達與SOCS1表達的相關性 胃癌組織中CRM1與SOCS1共同低表達22例、共同高表達3例、CRM1高表達而SOCS1低表達40例、SOCS1高表達而CRM1低表達2例,Spearman相關分析顯示,CRM1與SOCS1表達無相關性(R=-0.025,P=0.842)。

表2 胃癌組織CRM1及SOCS1的表達患者臨床病理特征的關系

2.5胃癌組織中CRM1及SOCS1表達與患者生存預后相關 對67例胃癌患者進行隨訪,CRM1低表達患者中位生存期為21.31個月,高表達患者中位生存期為8.31個月,Kaplan-Meier Plotter生存分析結果表明CRM1高表達胃癌患者生存時間明顯低于低表達胃癌患者(χ2=4.198,P=0.040),說明CRM1高表達意味預后不良,見圖3。SOCS1低表達患者中位生存期為13.73個月,高表達患者中位生存期為7.62個月,SOCS1高表達胃癌患者與低表達胃癌患者生存時間無明顯差異(χ2=1.042,P=0.307),見圖4。以預后狀態(tài)為因變量,賦值0=生存,1=死亡,將各項臨床病理特征、CRM1表達及SOCS1表達納入單因素Cox分析,賦值情況:性別:0=男性,1=女性;年齡:0=≤60歲,1=>60歲;腫瘤大小:0=≤5 cm,1=>5 cm;浸潤深度:0=T1～T2期,1=T3～T4期;HP感染:0=否,1=是;淋巴結轉移:0=無,1=有;CRM1:0=低表達,1=高表達;SOCS1:0=低表達,1=高表達。結果發(fā)現性別(P=0.044,HR=0.123,95%CI:0.016～0.948)、腫瘤大小(P=0.005,HR=6.044,95%CI:1.701～21.470)、浸潤深度(P=0.009,HR=7.794,95%CI:1.667～36.434)具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。將以上P<0.05的變量納入多因素Cox回歸分析,得出腫瘤大小具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),是影響預后的危險因素,見表3。

3 討論

多數胃癌伴有上皮內瘤變的異常增生階段,從低級別到高級別瘤變和癌形成伴隨眾多基因的參與并表現為形態(tài)、功能的一系列改變,分子表型和生物學行為均具有明顯異質性。CRM1也稱為核輸出蛋白1(XPO1),是由XPO1基因編碼的染色體區(qū)域維持蛋白1,其主要功能是促進包括腫瘤抑制蛋白在內的分子從細胞核輸出到細胞質從而使其失活的主要蛋白體。在真核細胞中介導特定蛋白質從細胞核到細胞質的轉運,細胞內的核蛋白運輸對于引導重要蛋白質和RNA在細胞核和細胞質之間的運輸至關重要,蛋白質從細胞核的輸出主要受CRM1基因調控,由于旺盛的代謝需求,惡性腫瘤細胞對蛋白質的核質運輸具有更高的依賴性,在腫瘤中CRM1活性增高,CRM1對關鍵抑制因子和致癌蛋白細胞內定位的失調有利于腫瘤的發(fā)展和進展。文獻報道[3-7],CRM1在多種人類腫瘤如膠質瘤、胰腺癌、卵巢癌及大細胞淋巴瘤中均表達上調,且CRM1高表達與預后不良相關,CRM1突變可能是B細胞淋巴瘤和B細胞白血病的驅動因子[8]。

圖3 CRM1表達與術后總生存期的關系 圖4 SOCS1表達與患者總生存期的關系

表3 67例GC患者單因素和多因素Cox分析

PIK3/AKT信號通路可提高腫瘤生長速度和侵襲能力[9],PAN L J等[10]應用神經母細胞瘤研究verdinexor(KPT-335)的體外抗腫瘤作用中發(fā)現,verdinexor抑制劑抑制CRM1后,細胞P13K/AKT信號通路受到抑制,進而抑制FOXO1和RB1在神經母細胞核內積累,抑制神經母細胞瘤的增殖、誘導細胞凋亡,并通過激活P53功能,誘導G0/G1細胞周期阻滯,高表達CRM1的神經母細胞瘤與患者的惡性進展有關。以上研究結果提示,CRM1可能參與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,在促進腫瘤增殖、侵襲和轉移等生物學行為發(fā)揮重要生物學作用。本研究結果顯示,在低級別、高級別上皮內瘤變和胃癌組織中的CRM1的表達均顯著高于癌旁組織,提示CRM1蛋白高表達可能參與胃黏膜上皮瘤變和癌變過程,在對CRM1表達的觀察中,胃癌組織的染色陽性強度比低級別瘤變的腺體更強呈棕黃色,而在低級別瘤變和高級別瘤變普遍呈淡黃色或黃色,這種染色的增強,說明CRM1基因表達增強和蛋白含量的增加,可能有助于病理醫(yī)師識別胃黏膜小活檢組織中對于上皮內瘤變和胃癌識別。CRM1在胃癌組織中高表達與浸潤深度、淋巴結轉移呈明顯相關,Kaplan-Meier Plotter生存分析顯示,高表達CRM1患者的中位生存期為8.31個月,低表達患者中位生存期為21.31個月,前者生存時間更短。單因素及多因素Cox回歸分析顯示腫瘤大小是影響胃癌患者預后的因素。

SOCS1是SOCS蛋白家族中的一員,具有N末端區(qū)域、SH2區(qū)和SOCS盒結構域,參與信號蛋白的磷酸化和靶蛋白的泛素-蛋白酶體途徑,是細胞內負性調節(jié)信號傳導的關鍵蛋白之一,主要調控JAK /STAT和TLR信號傳導途徑,JAK-STAT途徑是調節(jié)基因表達、細胞活化、增殖和分化的細胞因子的重要通路,SOCS1可以靶向結合未磷酸化的JAK,阻止JAK的磷酸化而抑制信號傳導[11]。甲基化、突變等各種原因導致SOCS1表達減少或抑制SOCS1可促進JAK/STAT信號通路的持續(xù)激活,并啟動與增殖和侵襲相關基因的轉錄;作為泛素化過程的參與蛋白,SOCS1介導泛素化底物的降解和調節(jié)細胞的生長,異常DNA甲基化造成的SOCS1沉默有助于各種腫瘤的發(fā)生。文獻報道,SOCS1在子宮頸癌、卵巢癌、肝癌表達下調[12-14]。王興等[15]應用免疫組織化學檢測正常子宮內膜、子宮內膜增生和子宮內膜癌中SOCS1的表達研究中發(fā)現,子宮內膜癌組中SOCS1陽性表達率較增生組和正常組降低,其表達的缺失與腫瘤肌層浸潤、淋巴結轉移和高Ki67增殖指數相關。胃癌是與炎癥相關密切的腫瘤,有研究表明,幽門螺桿菌感染胃癌患者的SOCS1啟動子區(qū)CpG島異常甲基化顯著增高[16]。本實驗結果顯示,癌組織SOCS1陽性表達率顯著低于癌旁組織,在胃黏膜的低級別和高級別上皮內瘤變向進展期癌演進過程中,SOCS1表達水平逐漸降低,提示其可能作為胃癌的抑癌基因,由于SOCS1是細胞因子和生長因子的重要調節(jié)因子,缺失會激活致癌信號通路[17]。體外研究證實,沉默SOCS1基因后的食管癌細胞凋亡減少,而細胞增殖、遷移和侵襲能力明顯增強[18]。本實驗結果并未發(fā)現SOCS1表達缺失與胃癌患者臨床病理特征及預后存在相關性,這可能與本組研究的病例較少和隨訪時間短有關,需擴大樣本量深入研究。

綜上所述,CRM1及SOCS1在胃癌組織及癌旁組織中表達具有顯著性差異,CRM1高表達與浸潤深度、淋巴結轉移及預后具有相關性,腫瘤大小是影響胃癌患者預后的危險因素;SOCS1在低級別上皮內瘤變及胃癌組織中的表達有差異,本次研究表明二者對于胃癌的診斷有一定的臨床價值,CRM1與SOCS1的表達無相關性,提示兩者在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能不存在相互調控關系,其在胃癌進展過程中的機制仍需進深入研究。