楊曼琪 吳鋼 劉韜 崔博 居昊 劉哲宇 任宗力 曹省 顏敏 張帆

室性早搏(PVC)是一種常見的室性心律失常。越來越多的臨床證據(jù)表明有的頻發(fā)性PVC會引起心臟結(jié)構(gòu)和功能變化,引起PVC 心肌病(PVC-ICM)[1],但PVC-ICM 的具體機制尚不完全清楚。線粒體作為人體重要的代謝工廠,其穩(wěn)態(tài)對細胞活性至關(guān)重要[2]。越來越多研究發(fā)現(xiàn),線粒體異常與心臟疾病關(guān)系密切,如心力衰竭、心肌梗死、擴張型心肌病以及糖尿病性心肌病等[3－5]。而線粒體異常是否與PVC-ICM 有關(guān)尚不清楚,筆者通過建立PVC-ICM 犬模型,觀察犬心功能變化及線粒體超微結(jié)構(gòu),以探索PVC-ICM的機制,為臨床PVC-ICM 患者的遠期恢復(fù)尋求新的潛在線索。

1 材料與方法

1.1 動物分組

14只成年比格犬(體重10～12 kg/只)購自武漢大學人民醫(yī)院實驗動物中心,隨機分為對照組(CTL,n＝7)和模型組(PVC-ICM,n＝7)。實驗設(shè)計和實施均通過武漢大學人民醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會審批(WDRM20201007)。

1.2 PVC-ICM 模型的制作

1.2.1 在全身麻醉下,14 只比格犬接受了起搏器的植入。無菌準備后,切開右側(cè)頸部,暴露頸外靜脈,在X 線透視下將兩根雙極起搏電極送入右室。將心房電極置于右室游離壁,心室電極植于右室心尖部(圖1 A)。心房電極與雙腔起搏器(Insync III,Medtronic,Minneapolis,MN)的心房端口(atrial port)相連接,用于感知竇性心室波,心室電極與起搏器心室端口(ventricular port)相連接,用于起搏心室。設(shè)置起搏參數(shù),心室感知5 m V,起搏閾值1 V,起搏電壓設(shè)置為2 V。啟動起搏器,確認成功感知自身竇性心律和起搏右室后,固定電極并關(guān)閉起搏器。將起搏器置于頸外側(cè)囊袋中,縫合頸部傷口。由于起搏器數(shù)量有限,我們分3 批給犬植入起搏器,第一批:3 只CTL組和3只PVC-ICM 組;第二批:3只CTL組和3只PVC-ICM 組;第三批:1只CTL組和1 只PVC-ICM 組。

圖1 安裝起搏器后犬胸部X 線影像側(cè)位圖及PVC程序程控前后犬心電圖的變化

1.2.2 參數(shù)設(shè)置 手術(shù)完成1周后,PVC-ICM 組將起搏器設(shè)置為VDD 模式。電極1感知到竇性心律后,由電極2提前釋放一次早搏刺激,通過這種方式模擬起源于右室心尖的持續(xù)二聯(lián)律PVC。通過調(diào)節(jié)電極1 感知竇性心室波后與電極2 釋放電沖動之間的時間間隔(即起搏器房室延遲時間)來模擬PVC與前次竇性心室波的聯(lián)律間期(CI),CI固定為350 ms。犬基礎(chǔ)心率為120分/次,竇性搏動周長為500 ms,故而設(shè)置CI長度為竇性周長的75%,即350 ms。每2周對犬進行1次心電圖監(jiān)測,觀察心電圖以確定起搏器持續(xù)有效起搏。CTL 組犬起搏器不啟動程序。

1.3 超聲心動圖評估心功能

于基線及PVC 程控起搏開始后每2周對各組動物進行一次超聲心動圖檢查(Vivid E9,GE,US)。測量左室射血分數(shù)(LVEF)、短軸縮短率(FS)、左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)、左室后壁厚度(LVPWT)、舒張末期室間隔厚度(IVST)。每次超聲心動圖檢查前關(guān)閉起搏器至少15 min,以獲得準確的參數(shù)。

1.4 透射電子顯微鏡

犬造模結(jié)束后,注射過量戊巴比妥鈉將犬處死,取部分心室游離壁組織,切割成1 mm3大小的立方體,固定于2.5%的戊二醛中,4℃保存2 h至完全固定,1 mmol/L 的磷酸緩沖液沖洗,1%四氧化俄固定4℃2 h,包埋于環(huán)氧樹脂中,包埋液固化,醋酸鈾染色后于透射電鏡(JEOL JEM1200EX,日本電子公司)下進行拍照分析。使用ImageJ軟件(NIH)測量線粒體的大小、面積和數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計檢驗均使用GraphPad Prism 軟件(La Jolla,CA)進行。計量資料采用均數(shù)±標準差(±s))表示,兩組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料用率表示,采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

整個造模期間,CTL 組犬精神狀況良好,總體情況無明顯變化;PVC-ICM 組在造模后期有5只犬陸續(xù)出現(xiàn)進食減少,活動量少,精神萎靡等癥狀。

2.2 兩組超聲指標的比較

與CTL 組 相 比,PVC-ICM 組 起 搏12 周 后,LVEF和FS顯著降低,LVESD 和LVEDD 增加(P＜0.05),見表1。

表1 12周后2組犬的心臟超聲指標

2.3 線粒體超微結(jié)構(gòu)的比較

與CTL 組比較,PVC-ICM 組起搏12周后,心肌細胞呈不規(guī)則形狀,心肌間質(zhì)有膠原沉積,線粒體形態(tài)不規(guī)則,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)融合,并表現(xiàn)出異常的嵴(圖2);每個顯微視野下線粒體數(shù)量減少[(93.29±6.02)個vs(112.43±11.85)個,P＜0.001],體積增大[(2.42±0.18)μm2vs(1.54±0.19)μm2,P＜0.001],每個視野下線粒體面積增大[(225.63±18.88)μm2vs(171.37±19.64)μm2,P＜0.001]。

圖2 12周后2組犬線粒體超微結(jié)構(gòu)變化的比較

3 討論

本研究通過建立PVC-ICM 犬模型,主要發(fā)現(xiàn):①頻發(fā)性PVC可導(dǎo)致心功能障礙。②頻發(fā)性PVC會導(dǎo)致線粒體超微結(jié)構(gòu)改變,包括線粒體數(shù)量增多,體積增大,線粒體嵴融合。

2011年,Huizar等[6]首次采用右室心外膜起搏方案成功建立PVC-ICM 模型,在他們的研究中,模型組觀察到左室功能障礙,這與本研究結(jié)果一致。除此之外,Huizar等使用Masson染色在光鏡下并未觀察到心肌間質(zhì)纖維化改變,而本研究使用電鏡發(fā)現(xiàn)心肌間質(zhì)有膠原沉積。造成這種差別的原因可能是因為Huizar等采用的觀察儀器是光鏡,而本研究采用電鏡,觀察的結(jié)果更加細微。也有可能是因為Huizar 等的模型采用的是短聯(lián)律間期(CI＝250ms)起搏模式,而本研究的模型采用的是長聯(lián)律間期(CI＝350ms)起搏模式。已有多項臨床研究發(fā)現(xiàn)長CI是PVC-ICM 的危險因素,CI延長,患者患PVC-ICM 的 風 險 越 大[7－8]。2016 年Tanaka等[9]通過心內(nèi)膜起搏方式在豬身上建立CI為320ms的PVC-ICM 模型,除了發(fā)現(xiàn)模型組心功能障礙,還發(fā)現(xiàn)心肌間質(zhì)明顯的纖維化,這與本研究結(jié)果一致。心肌纖維化改變可能是部分患者抑制PVC 后心功能不能恢復(fù)的一個原因。

正常情況下,線粒體通過氧化磷酸化產(chǎn)生三磷酸腺苷,為心肌細胞的正常收縮和代謝提供能量,維持細胞穩(wěn)態(tài)[10],心肌細胞的病理生理學與線粒體的變化有關(guān),包括腫脹、嵴膜喪失、結(jié)構(gòu)變形或心室內(nèi)外空泡[11],故而線粒體形態(tài)和功能的穩(wěn)定性對于維持正常的心臟生理功能尤為重要。Ashrafian等[12]在Dnm1突變的小鼠模型中觀察到與線粒體復(fù)合體水平降低、心臟三磷酸腺鞋苷(ATP)耗盡和心力衰竭相關(guān)的線粒體網(wǎng)絡(luò)延長,首次證明參與線粒體重塑的基因缺陷可能導(dǎo)致心肌病。Abdullah等[13]同樣發(fā)現(xiàn)線粒體異常與心功能障礙有關(guān)。在本研究中,PVC-ICM 組線粒體數(shù)量增多、形態(tài)不規(guī)則、結(jié)構(gòu)紊亂,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)融合,這表明線粒體異常可能是PVC-ICM 的一個原因。

頻發(fā)性PVC 導(dǎo)致心室線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷的機制目前尚不清楚,筆者猜測可能與線粒體Ca2＋超載有關(guān)。Walters等[14]在豬模型中發(fā)現(xiàn),相較于對照組,PVC-ICM 組磷酸化的蘭尼堿受體2(p-RYR2)、鈉鈣交換器-1(NCX-1)、鈣依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca MKⅡ)的蛋白水平均上調(diào)。Ca MKⅡ?qū)π募〖毎鸆a2＋穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,其過度激活可對L 型Ca2＋通道(ICa-L)、Ry R2及受磷蛋白(PLB)等多種Ca2＋運轉(zhuǎn)關(guān)鍵蛋白進行磷酸化修飾[15－16],一方面可引起ICa-L開放時間顯著延長,增加心肌細胞Ca2＋內(nèi)流,另一方面還可引起Ry R2 舒張期異常開放,增加舒張期Ry R2的Ca2＋泄露,這些改變可最終導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)Ca2＋蓄積。而線粒體Ca2＋穩(wěn)態(tài)是線粒體穩(wěn)態(tài)的一個重要方面,在細胞生理和病理過程中發(fā)揮著一系列關(guān)鍵作用,包括能量代謝、細胞凋亡和活性氧(ROS)的產(chǎn)生[17]。Santulli等[18]發(fā)現(xiàn)Ca2＋通過Ry R2從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)泄露導(dǎo)致線粒體內(nèi)Ca2＋超載,在心力衰竭中起關(guān)鍵作用。線粒體Ca2＋超載會導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,m PTP)的打開,允許小于1.5 k Da 的分子自由通過[19]。這會導(dǎo)致線粒體膜電位的破壞、膜通透性的改變、線粒體滲透腫脹、線粒體破裂、ATP 合成減少以及細胞色素C 從膜間釋放[19]。此外,mPTP 的開放和隨后線粒體的解偶聯(lián)還會導(dǎo)致胞漿ATP 的活性水解和胞漿中ATP 含量的減少。綜上所述,線粒體內(nèi)Ca2＋超載可能是頻發(fā)性PVC造成線粒體異常的一個機制,但需要進一步研究證實,明確相關(guān)機制將為臨床PVC-ICM 患者的治療提供理論依據(jù)。