周 敏, 趙秋燕, 張 迪, 魏春梅, 陶宇蝶, 黃美娟, 黃海泉

(西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院/國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心/云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心/西南林業(yè)大學(xué)園林園藝花卉研發(fā)中心,云南昆明 650224)

百合(Liliumsp.)是百合屬植物的統(tǒng)稱,因其花姿優(yōu)美、寓意美好而受到眾多消費(fèi)者喜歡。目前市場(chǎng)上主要的百合栽培品種是亞洲百合雜種系(Asiatic hybrids)、東方百合雜種系(Oriental hybrids)、麝香百合雜種系(Longiflorumhybrids)及OT (Oriental×Trumpet hybrids)、LA(Longiflorum×Asiatic)、OA (Oriental×Asiatic )雜交種[1]。亞洲百合開(kāi)花早、花色豐富、種球小且耐貯藏,但不耐高溫,易感灰霉病[2];東方百合及OT百合花朵碩大且芳香,生長(zhǎng)周期長(zhǎng),具有抗灰霉病的特性[3],但其花色不夠豐富;麝香百合花型獨(dú)特,花香清新,但是花色單一,抗病毒病的能力較差[4];LA百合綜合了亞洲百合、麝香百合的特性,其花色豐富,但大多數(shù)無(wú)香。因此,為了培育綜合性狀優(yōu)良的百合新種質(zhì),本研究以花色豐富、花大芳香、抗性作為育種目標(biāo)進(jìn)行百合的近緣、遠(yuǎn)緣雜交育種,探索不同百合品種間交配的親和性規(guī)律,以期培育出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的百合新品種。

雜交育種是獲得百合新品種最主要的途徑,但是百合雜交常表現(xiàn)出種間不親和性,致使雜交失敗。雜交不親和主要包括受精前障礙、受精后障礙,其中受精前障礙主要是由于花柱的長(zhǎng)度不同或是柱頭上部和下部出現(xiàn)抑制作用,導(dǎo)致無(wú)法受精。羅建讓研究發(fā)現(xiàn),延遲多次授粉和蕾期多次授粉對(duì)克服百合自交障礙的效果較好,離體和切割柱頭授粉對(duì)克服百合雜交過(guò)程的受精前障礙較為有效[5]。受精后障礙主要是由胚胎、胚乳及母體組織間遺傳物質(zhì)的不平衡引起的[6]。近年來(lái),研究者對(duì)克服受精后障礙做了大量研究,如劉玉采用胚培養(yǎng)的方法成功獲得了亞洲百合與LA的雜交苗[7]。馬冰研究發(fā)現(xiàn),用授粉第40～50天卷丹百合與亞洲百合雜交的幼胚進(jìn)行整個(gè)種子培養(yǎng)的萌發(fā)率較高[8]。目前已有關(guān)于百合雜交親和性[9-13]、百合雜交障礙克服[14-15]的相關(guān)報(bào)道,但是百合的遺傳背景復(fù)雜,影響其雜交成功的因素諸多,需要進(jìn)一步探究其內(nèi)在機(jī)制。

我國(guó)是世界百合的起源中心,也是全世界百合屬植物的主產(chǎn)地之一[16],但是我國(guó)百合育種工作起步較晚,國(guó)內(nèi)通過(guò)常規(guī)育種的百合新品種非常有限,在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用的仍以國(guó)外品種為主,自主品種微乎其微,對(duì)我國(guó)百合生產(chǎn)的規(guī)模和效益造成了一定影響。因此,本研究用22個(gè)百合品種進(jìn)行雜交,通過(guò)常規(guī)授粉和胚挽救技術(shù),探討雜交親和性并解決受精障礙,以期為創(chuàng)制百合新種質(zhì)奠定理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料購(gòu)自云南滇峰花卉有限公司,于2021年4月栽種于西南林業(yè)大學(xué)樹(shù)木園試驗(yàn)大棚內(nèi)。(1)東方百合雜種系:索邦,花為粉色;所羅門之王,花為玫紅色且有白色花邊;陽(yáng)光冰島,花為黃色;馬提尼克,花為粉色且有白色花邊;西伯利亞,花為白色;八點(diǎn)后,花為粉色且有白色花邊。(2)OT百合雜種系:紫色大理石,花為紫色;羅賓娜,花為玫紅色;桌舞,花為淡粉色;閃點(diǎn),花為白色且中心有玫紅色斑紋;帕拉佐,花為黃色。(3)亞洲百合雜種系:小珍珠,花為粉色;小月亮,花為淺橙色;小火箭,花為紅色;小圖標(biāo),花為淡粉色。(4)麝香百合雜種系:白色海洋,花為白色;卡里,花為白色且中心有粉色斑紋。(5)LA雜種系:帝王黃,花為黃色;眼線,花為白色且有黑色線形花邊;甜蜜贊比亞,花為白粉色且具斑紋;穿梭,花為橙色;愛(ài)馬仕,花中心呈黃色,邊緣為紅色。均采用種植袋(45 cm×50 cm)進(jìn)行種植,每袋放置10個(gè)種球。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 去雄及花粉生活力的測(cè)定 為了避免花朵開(kāi)放后混入其他花粉,在花朵開(kāi)放前1～2 d進(jìn)行去雄套袋,同時(shí)為了防止組合間花期不遇,收集花藥后帶回實(shí)驗(yàn)室,置于室溫下讓其開(kāi)裂,于4 ℃保存花粉。花粉在授粉前均采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法進(jìn)行生活力的測(cè)定。

1.2.2 雜交授粉 采用常規(guī)的授粉方法進(jìn)行雜交:待母本柱頭分泌大量黏液時(shí),將父本花粉涂抹于母本柱頭上,并于授粉當(dāng)天重復(fù)授粉2次,每個(gè)雜交組合授粉10朵,授粉后掛牌并標(biāo)明母本、授粉日期。授粉后第7天開(kāi)始觀察并記錄子房發(fā)育情況,第30天統(tǒng)計(jì)子房膨大數(shù),計(jì)算膨大率,授粉后第60～75天采用油標(biāo)卡尺測(cè)量蒴果大小,并計(jì)算干種子有胚率。子房膨大率=膨大子房數(shù)/授粉花朵數(shù)×100%;有胚率=有胚種子數(shù)/種子數(shù)×100%。

1.2.3 胚挽救技術(shù) 在筆者所在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,經(jīng)過(guò)不斷優(yōu)化,篩選出的培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂,pH值為5.8～6.0。采用2種胚挽救技術(shù):采收雜交后第7～30天停止發(fā)育的子房,進(jìn)行消毒處理后用刀片將其切成2 mm的薄片進(jìn)行子房切片培養(yǎng)(25 ℃暗培養(yǎng)60 d后取愈傷組織進(jìn)行重新轉(zhuǎn)接,進(jìn)行光培養(yǎng),培養(yǎng)基成分不變);采收授粉后60～75 d的子房進(jìn)行幼胚培養(yǎng)(培養(yǎng)條件:光—暗周期為16 h—8 h,溫度為20～25 ℃),60 d后觀察蒴果成活率和生長(zhǎng)狀況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉生活力的測(cè)定

從表1可知,在不同百合品種之間,新鮮花粉生活力差異顯著,其中東方百合所羅門之王的花粉生活力最高,是同雜種系索邦的1.7倍;OT百合紫色大理石的花粉生活力最高,是同雜種系閃點(diǎn)的1.61倍;亞洲百合小火箭的花粉生活力最高,是同雜種系小月亮的1.5倍;LA百合穿梭的花粉生活力最高,是同雜種系眼線的1.15倍。

表1 百合不同品種的花粉生活力

由圖1可以看出,平均花粉生活力表現(xiàn)為麝香百合>東方百合>LA百合>亞洲百合>OT百合,說(shuō)明在雜交育種中,麝香百合、LA百合和東方百合的花粉生活力較高,可以作為良好的父本材料,OT與亞洲百合則可作為母本材料。

2.2 百合同雜種系內(nèi)不同品種雜交親和性的比較與分析

如表2所示,不同百合品種之間系內(nèi)正反交其雜交結(jié)實(shí)情況均存在一定差異。OO雜種系系內(nèi)正反交除馬提尼克×八點(diǎn)后雜交組合未獲得有胚種子外,其他組合均不同程度地獲得了膨大子房及有胚種子,在索邦×所羅門之王組合中,其正交組合的子房膨大率、蒴果大小分別是反交組合的2.73、1.14倍,反交組合的有胚率是正交組合的1.45倍。在索邦×西伯利亞組合中,其反交組合的子房膨大率是正交組合的1.11倍,蒴果大小、 有胚率分別是反交的1.13、2.82倍。將OT雜種系桌舞和羅賓娜進(jìn)行系內(nèi)正反交,發(fā)現(xiàn)其正交組合的子房膨大率、蒴果大小分別是反交組合的3.44、1.71倍, 但是正交組合并未獲得有胚種子,反交組合的有胚率為38.48%。對(duì)AA雜種系小月亮×小珍珠而言,僅正交組合獲得了有胚種子,其反交組合的子房膨大率是正交的2.22倍,且反交組合的蒴果比正交組合小7.5%。在LA雜種系甜蜜贊比亞和眼線系內(nèi)的正反交組合中,僅正交組合獲得了膨大子房,子房膨大率為57.14%,有胚率均為0,說(shuō)明雜交的親和性較差,存在嚴(yán)重的受精后障礙。綜上可知,同雜種系內(nèi)不同品種的雜交親和性各不相同,其中OO雜種的系內(nèi)親和性較好,LA雜種的系內(nèi)親和性較差。

表2 不同品種間的系內(nèi)雜交情況

2.3 百合不同雜種系間雜交親和性的比較與分析

如表3所示,不同雜種系間雜交后,其雜交結(jié)實(shí)情況差異明顯。以東方百合雜種系為母本與亞洲百合、OT系列和LA系列進(jìn)行雜交育種,發(fā)現(xiàn)其子房膨大率、蒴果大小及有胚率均存在一定差異。其中在東方百合雜種系與亞洲百合雜種系的雜交組合中, 索邦×小圖標(biāo)的子房膨大率、蒴果大小分別是馬提尼克×小月亮的2.00、1.21倍,但是有胚率比馬提尼克×小月亮低92.08%。在東方百合雜種系與麝香百合雜種系的雜交組合中,馬提尼克與麝香百合白色海洋、卡里的子房膨大率均為0,未獲得有胚種子,說(shuō)明東方百合與麝香百合之間雜交不親和,存在受精障礙。在東方百合雜種系與OT系列的雜交組合中,所羅門之王×激情月球的子房膨大率、蒴果大小分別是馬提尼克×閃點(diǎn)的2.00、1.58倍,僅所羅門之王×激情月球獲得有胚種子,有胚率為42.42%。以O(shè)T雜種系為母本,與LA、麝香百合、亞洲百合、東方和OT雜種系進(jìn)行雜交育種,發(fā)現(xiàn)其子房膨大率、蒴果大小及有胚率均存在一定差異。在OT系列與LA系列的雜交組合中,紫色大理石×穿梭的子房膨大率是紫色大理石×愛(ài)馬仕的1.49倍,但有胚率比紫色大理石×愛(ài)馬仕低90.71%。在OT系列與東方百合雜種系的雜交組合中,羅賓娜×索邦的子房膨大率是羅賓娜×所羅門之王的3.00倍,蒴果比羅賓娜×所羅門之王小8.97%,僅羅賓娜×索邦獲得有胚種子,有胚率為12.12%。在OT系列與亞洲百合雜種系的雜交組合中,紫色大理石×小火箭的子房膨大率是帕拉佐×小月亮的2.22倍,蒴果比帕拉佐×小月亮小50.94%。索邦×小圖標(biāo)、紫色大理石×穿梭、激情月球×卡里和紫色大理石×小火箭等不同雜交組合雖然都獲得了較高的子房膨大率和蒴果長(zhǎng)寬比,但是有胚種子的獲得率較低,說(shuō)明其可能是胚發(fā)育不完全或受花粉刺激出現(xiàn)的假膨大[17]。馬提尼克×閃點(diǎn)、羅賓娜×所羅門之王和帕拉佐×小月亮的有胚率為0,說(shuō)明存在嚴(yán)重的受精后障礙。由此可見(jiàn),不同雜種系間雜交親和性程度各不相同,其雜交結(jié)實(shí)情況受正反交等諸多因素影響,有待進(jìn)一步研究。

表3 不同品種系間雜交結(jié)果

2.4 不同胚挽救方式對(duì)幼胚成活的影響

由表4可以看出,不同培養(yǎng)方式對(duì)不同雜交組合幼胚的成活率影響較大。子房切片暗培養(yǎng)60 d后,OTOT雜交組合普拉芬多×桌舞與OA雜交組合帕拉左×小月亮的成活率達(dá)到50.00%,是羅賓娜×桌舞的4.55倍,之后將成活的幼胚轉(zhuǎn)接至光下培養(yǎng)60 d左右,僅30 d胚齡的羅賓娜×桌舞、帕拉左×小月亮成活,成活率分別是暗培養(yǎng)的4.55、2.00倍。胚培養(yǎng)60 d左右時(shí),OO雜種系八點(diǎn)后×馬提尼克的萌發(fā)率最高,比所羅門之王×索邦高1.40%,比馬提尼克×八點(diǎn)后高16.67%。AA雜種系中僅小珍珠×小月亮萌發(fā),萌發(fā)率為65.00%。以東方百合雜種系為母本與亞洲百合、OT百合進(jìn)行雜交,結(jié)果顯示,馬提尼克×閃點(diǎn)的萌發(fā)率是馬提尼克×小月亮的2.18倍。

表4 不同培養(yǎng)方式對(duì)胚成活率的影響

由圖2可知,馬提尼克×白色海洋、陽(yáng)光冰島×卡里暗培養(yǎng)60 d左右時(shí),子房經(jīng)過(guò)初期膨大后逐漸褐化死亡;羅賓娜×桌舞和帕拉左×小月亮子房膨大且逐漸生成愈傷組織,之后轉(zhuǎn)至光下培養(yǎng),成功獲得了幼苗。所羅門之王×索邦、馬提尼克×八點(diǎn)后、八點(diǎn)后×馬提尼克、小珍珠×小月亮、馬提尼克×小月亮、馬提尼克×閃點(diǎn)、羅賓娜×索邦經(jīng)胚挽救后均獲得了雜交苗且葉片肥厚、根系粗壯,部分組合胚挽救不成功。綜上可知,不同雜交組合間均存在受精后障礙,胚挽救方式應(yīng)根據(jù)不同雜交組合的胚齡來(lái)選擇。

3 討論與結(jié)論

在百合的雜交育種中,花粉生活力是評(píng)估花粉細(xì)胞活性的重要依據(jù)之一,其測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性決定了雜交育種的成敗[18-19]。本研究結(jié)果顯示麝香百合和東方百合花粉生活力較高,在雜交親本的選配中更適合作父本,但本研究表明,麝香百合作父本僅與OT百合激情月球雜交子房膨大率為85.00%,與東方百合馬提尼克、陽(yáng)光冰島雜交均為0;東方百合作父母本其子房膨大率均等。與花粉生活力測(cè)定結(jié)果不一致,推測(cè)可能是因?yàn)槭诜凼芫粌H需要有正常的雌雄配子體親和,還與花粉發(fā)芽、花粉管生長(zhǎng)等內(nèi)外因子有關(guān),因此在雜交授粉前,應(yīng)先采用TTC染色法來(lái)快速測(cè)定花粉活性,反映花粉的存活狀態(tài),再結(jié)合花粉離體萌發(fā)法[20],以更準(zhǔn)確地選擇授粉親本。

雜交親本的選配是重要的因素之一,本研究對(duì)百合系內(nèi)、系間雜交親和性進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)無(wú)論是系內(nèi)還是系間品種之間的雜交,雜交組合不同其結(jié)果也明顯不同,正反交的子房膨大率和有胚率也存在較大差異。LA雜種系眼線與甜蜜贊比亞系內(nèi)正反交,其正交親和反交不親和,可能與染色體間的差異[6]或細(xì)胞質(zhì)遺傳基因有關(guān)[21],也可能是因?yàn)長(zhǎng)A遺傳復(fù)雜,花粉育性低[17]。東方百合系列與麝香百合系列雜交均不親和,可能是由于花柱長(zhǎng)度及系間雜交雙親生理上的不協(xié)調(diào)造成的[6],也可能是受S基因控制的不親和機(jī)制[22]。因此,在今后的雜交育種工作中,為提高育種成功率,應(yīng)借鑒國(guó)內(nèi)外百合的育種經(jīng)驗(yàn),將親緣關(guān)系與同源性差異相結(jié)合,以更好地進(jìn)行雜交親本的選配。

不同的胚挽救方式對(duì)不同雜交組合幼胚的成活率影響較大[23]。本研究發(fā)現(xiàn)子房切片培養(yǎng)對(duì)于 30 d 胚齡的子房最有效,其在暗培養(yǎng)60 d后生成愈傷組織再進(jìn)行光培養(yǎng)出苗率高達(dá)100.00%,與劉曉麗等對(duì)新鐵炮百合品種和岷江百合雜交授粉 10～20 d的子房進(jìn)行切片培養(yǎng)取材時(shí)間不同,說(shuō)明取材時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同的雜交組合、子房膨大時(shí)間來(lái)選擇[24]。60～75 d胚齡的幼胚進(jìn)行適時(shí)剝離有利于胚吸收營(yíng)養(yǎng),提高萌發(fā)率[23],與邵楊等研究結(jié)果[25]相一致。本研究發(fā)現(xiàn)有部分組合雖獲得有胚種子,但未萌發(fā),與郭朋輝等研究紫斑百合遠(yuǎn)緣雜交親和性結(jié)果[9]相似,推測(cè)其可能是因?yàn)榕吆团呷榘l(fā)育不良,胚挽救時(shí)間、培養(yǎng)基配方等多種因素造成的,但具體原因還需進(jìn)一步探究。

本研究以百合不同雜種系的花色、花型、花香、抗性等方面的特點(diǎn),進(jìn)行雜交親本的選配,無(wú)論是系內(nèi)正反交還是系間不同品種的雜交,組合不同其雜交結(jié)果也明顯不同,不同的胚挽救技術(shù)對(duì)不同雜交組合幼胚的成活率影響也明顯不同。總體來(lái)看,除LA雜種系不親和,其他雜種系系內(nèi)雜交均不同程度親和;東方雜種系與OT雜種系為母本進(jìn)行系間雜交親和性更好;不同胚齡的幼胚需要采用不同的胚挽救技術(shù),幼胚培養(yǎng)比子房切片培養(yǎng)更容易獲得雜交后代,成苗率更快。該研究初步探索了不同百合品種雜交親和性規(guī)律,為今后百合雜交育種提供了理論參考,同時(shí)為創(chuàng)制百合新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。