張言言,韓 剛,曹 羽,張 云,張 旭,胡 建,龔航軍

0 引言

目前,晚期結(jié)腸癌主要采用手術(shù)、化療、放療等綜合治療模式,但療效并不理想,且復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高,導(dǎo)致晚期結(jié)腸癌的治療更為棘手[1-2]。近年來,免疫療法取得巨大進展,腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用,T淋巴細胞亞群及細胞因子直接影響抗瘤免疫作用及免疫檢查點抑制劑的療效[3-4]。細胞程序性死亡受體1(Programmed death receptor-1,PD-1)/細胞程序性死亡受體-配體1(Programmed death receptor ligand-1,PD-L1)信號通路介導(dǎo)的免疫逃逸與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),以PD-1、PD-L1為分子靶點的免疫療法有望為晚期結(jié)直腸癌治療開辟新的道路[5]。補腎解毒散結(jié)方經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院驗方,具有補腎解毒、消腫散結(jié)之功,在控制結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面療效顯著,但其免疫相關(guān)機制尚不完全明確[6]。本研究基于PD-1/PD-L1通路,探討補腎解毒散結(jié)方對晚期結(jié)直腸癌患者免疫微環(huán)境的影響,從而為晚期結(jié)直腸癌的臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年12月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院胃腸外科收治的50例晚期結(jié)直腸癌患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①參照《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2020版)》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn),TNM臨床分期為Ⅳ期,且無法手術(shù)切除;②年齡≤80歲,預(yù)計生存期超過3個月;③近期未接受其他臨床研究。其中,男28例,女22例,年齡48～79歲,平均(57.4±6.9)歲;體重指數(shù)(Body mass index,BMI)：21.4～23.8 kg/m2,平均(22.5±2.3)kg/m2;病灶部位：升結(jié)腸18例,橫結(jié)腸8例,降結(jié)腸7例,乙狀結(jié)腸7例,直腸10例;分化程度：高分化9例,中分化18例,低分化23例;病理類型：腺癌29例,黏液腺癌9例,其他12例。按照隨機數(shù)字表法,將所有患者分為研究組和對照組,各25例。兩組年齡、性別構(gòu)成比、病灶部位、BMI、病理類型、分化程度等基本臨床特征比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。研究組年齡(56.9±7.6)歲;BMI(22.3±2.1)kg/m2;病灶部位：結(jié)腸19例,直腸6例;分化程度：高分化4例,中分化7例,低分化14例;病理類型：腺癌14例,黏液腺癌5例,其他6例。對照組年齡(58.1±6.5)歲;BMI(22.6±2.4)kg/m2;病灶部位：結(jié)腸21例,直腸4例;分化程度：高分化5例,中分化11例,低分化9例;病理類型：腺癌15例,黏液腺癌4例,其他6例。本研究符合《赫爾辛基宣言》,經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會審議通過(批號：2019-1174-111-02),研究方案經(jīng)患者或監(jiān)護人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 對照組 對照組給予化療+PD-1抑制劑,具體方法如下：采用mFOLFOX6方案化療：奧沙利鉑(批號：國藥準(zhǔn)字H20093892)85 mg/m2靜脈滴注,大于2 h,第1天;亞葉酸鈣(批號：國藥準(zhǔn)字H20013091)400 mg/m2靜脈滴注,大于2 h,第1天;5-氟尿嘧啶(批號：國藥準(zhǔn)字H12020959)400 mg/m2靜脈推注,第1天;5-氟尿嘧啶1 200 mg/(m2·d)持續(xù)靜脈泵入48 h,第2、3天。每2周為1個周期,連續(xù)12個化療周期。同時,在mFOLFOX6方案的第4天給予派安普利單抗注射液(批號：國藥準(zhǔn)字S20210033)200 mg靜脈推注,每2周為1個周期,與化療同步進行。

1.2.2 研究組 在對照組基礎(chǔ)上給予補腎解毒散結(jié)方內(nèi)服,藥物組成：地黃15 g、女貞子15 g、人參9 g、肉蓯蓉12 g、山慈菇15 g、八月札9 g。中藥生藥均由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院提供并代煎。一貼2袋,每袋200 ml,早晚各溫服1袋,連續(xù)服用2周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 近期臨床療效 治療前、治療4個周期后復(fù)查CT或磁共振,應(yīng)用RECIST評價標(biāo)準(zhǔn)1.1,將臨床療效分為完全緩解(Complete response,CR)、部分緩解(Partial response,PR)、穩(wěn)定(Stable disease,SD)、進展(Progressive disease,PD)。疾病控制率(Disease control rate,DCR)=(CR+PR+SD)/總例數(shù)×100%,客觀緩解率(Objective response rate,ORR)=(CR+PR)/總例數(shù)×100%。將CR、PR和SD患者納入有效組,PD患者納入無效組。

1.3.2 外周血T細胞亞群檢測 治療前、治療4個周期后,采用Beckman Coulter Cytoflex S流式細胞儀檢測外周血T細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)水平,采用HITACHI 7600型全自動生化分析儀檢測血清免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)水平。

1.3.3 外周血PD-1、PD-L1水平檢測 治療前、治療4個周期后,抽取清晨的空腹外周靜脈血3 ml,置于EDTA抗凝管中,1 000轉(zhuǎn)/min高速離心20 min,收集上層清液放置在-80 ℃冰箱中保存。將標(biāo)本樣品、標(biāo)準(zhǔn)樣品及辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體加入預(yù)包裹抗體的微孔內(nèi),孵育并充分清洗。酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清PD-1、PD-L1水平,試劑盒購自迪信泰檢測科技(北京)有限公司(批號：EKHU3727、EKHU3732),酶標(biāo)檢測儀購自Bio-Rad公司,檢測波長450 nm處各孔光密度值(OD450)。

2 結(jié)果

2.1 近期臨床療效比較 研究組的DCR為64.0%,明顯高于對照組36.0%(P<0.05);兩組ORR比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組患者近期臨床療效比較[例(%)]

2.2 治療前后T細胞亞群比較 治療前,研究組和對照組CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);治療后,研究組CD3+、CD4+水平明顯升高(P<0.05),CD8+、CD4+/CD8+較治療前差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),研究組上述T細胞亞群各指標(biāo)均高于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者治療前后T細胞亞群比較

2.3 治療前后體液免疫指標(biāo)比較 治療前,研究組和對照組血清IgA、IgG、IgM水平比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);治療后,兩組各體液免疫指標(biāo)均明顯升高(P<0.05),研究組IgA、IgM水平均高于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者治療前后體液免疫指標(biāo)比較

2.4 治療前后外周血PD-1、PD-L1比較 治療前,兩組外周血PD-1、PD-L1比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);治療后,研究組與對照組外周血PD-1、PD-L1水平均顯著下降(P<0.05),且研究組明顯低于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 治療前后患者外周血PD-1、PD-L1水平比較(pg/ml)

2.5 研究組不同療效組患者免疫功能指標(biāo)及PD-1、PD-L1水平比較 研究組患者中,有效組外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及IgA、IgG、IgM水平明顯升高,PD-1、PD-L1水平明顯下降(P<0.05)。見表5。

3 討論

結(jié)直腸癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤,常伴有癌基因、抑癌基因多發(fā)性突變[8-9]。研究發(fā)現(xiàn),PD-1/PD-L1信號通路介導(dǎo)的免疫抑制微環(huán)境是結(jié)直腸癌細胞的生存基礎(chǔ),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及免疫監(jiān)視逃逸中發(fā)揮重要作用[10-11]。

表5 研究組不同療效患者免疫功能指標(biāo)及PD-1、PD-L1水平比較

近年來,隨著免疫檢查點抑制劑的逐步應(yīng)用,晚期結(jié)直腸癌進入免疫治療時代[12]。PD-1表達于結(jié)直腸癌變組織周圍CD8+T淋巴細胞表面,PD-L1異常高表達于癌變細胞表面,二者特異性結(jié)合后,可抑制CD8+T淋巴細胞的正常功能,誘導(dǎo)活化的CD8+T細胞凋亡和耗竭,從而介導(dǎo)癌變細胞逃避T淋巴細胞的殺傷。PD-1/PD-L1抑制劑可阻斷PD-1與癌變細胞PD-L1結(jié)合,重新激活T淋巴細胞殺傷作用,增強免疫應(yīng)答,識別并殺傷癌變細胞[13-14]。研究證實,PD-1和PD-L1抑制劑能夠顯著改善部分結(jié)直腸癌預(yù)后,且聯(lián)合化療可能進一步提高治療效果,但此類研究仍以實驗研究為主,臨床研究較少,且不良反應(yīng)發(fā)生率較高[15]。

結(jié)直腸癌歸屬于“積聚”、“癥瘕”、“腸癖”等范疇,其病位在腸,病本在腎,為本虛標(biāo)實之證,脾腎虛弱為本,痰瘀、濕熱為標(biāo),病機在于正氣不足,余毒伏居,濕熱蘊結(jié),通降失司,積聚成形[16]?！毒霸廊珪しe聚》記載,凡脾腎不足、虛弱失調(diào)之人多有積聚之病。根據(jù)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院李琦教授前期研究,補腎解毒散結(jié)方具有補腎填精、清熱利濕解毒之功,有助于降低腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,改善預(yù)后[17]。本方以地黃滋陰補腎為君藥,女貞子、肉蓯蓉溫陽填精為臣藥,人參補益元氣為佐使,八月札、山慈菇清熱解毒、理氣散結(jié),全方標(biāo)本兼顧、攻補兼施,共奏補腎解毒散結(jié)之效。本研究結(jié)果顯示,雖然兩組ORR無顯著性差異,但研究組的DCR為64.0%,明顯高于對照組36.0%,表明補腎解毒散結(jié)方有助于進一步改善晚期結(jié)直腸癌患者化療臨床療效。

化療藥物屬于攻邪藥物,導(dǎo)致脾胃受損、臟腑氣血陰陽失調(diào),免疫功能抑制。近年來,PD-1抑制劑聯(lián)合中藥治療愈發(fā)引起重視,中醫(yī)藥作為結(jié)直腸癌綜合治療的重要組成,可有效緩解化療、免疫治療所致毒副作用,增強免疫力,改善預(yù)后。前期實驗及臨床研究均表明,補腎解毒散結(jié)方可抑制結(jié)直腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移,但具體作用機制尚不明確[18-19]。由于晚期結(jié)直腸癌患者獲取組織標(biāo)本不易,本研究通過外周血檢測患者治療前后T淋巴細胞亞群及PD-1/PD-L1表達變化,結(jié)果顯示,研究組CD8+、CD4+/CD8+較治療前差異無統(tǒng)計學(xué)意義,CD3+、CD4+及IgA、IgG、IgM水平則明顯升高,且T細胞亞群各指標(biāo)及IgA、IgM均優(yōu)于對照組,與馮媛媛等[20]研究結(jié)果相符,同時外周血PD-1和PD-L1水平明顯降低,表明補腎解毒散結(jié)方有助于調(diào)節(jié)和提高結(jié)直腸癌患者化療、免疫治療期間免疫微環(huán)境,并抑制PD-1/PD-L1的表達。

對研究組進一步分析發(fā)現(xiàn),有效組外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+及IgA、IgG、IgM水平明顯升高,PD-1、PD-L1水平明顯降低,表明補腎解毒散結(jié)方聯(lián)合化療、免疫治療的療效與PD-1、PD-L1水平密切相關(guān)。研究表明,中藥可通過調(diào)節(jié)CD4+、CD8+T細胞及細胞表面的PD-1介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境[21]。補腎清毒湯藥能夠促進成熟樹突狀細胞(DC)表面分子PD-L2表達,下調(diào)表面分子PD-L1表達水平,從而改善DC功能并影響PD-1/PD-L1信號通路[22]。Zhou等[23]研究發(fā)現(xiàn),補腎中藥肉蓯蓉提取物可上調(diào)p53、Bax等抑癌基因表達,通過抑制腫瘤細胞惡性增殖、加速腫瘤細胞凋亡,阻斷大腸癌裸鼠移植瘤的生長。

綜上所述,補腎解毒散結(jié)方可調(diào)節(jié)晚期結(jié)直腸癌患者的免疫微環(huán)境,改善臨床療效,其作用機制可能與其通過抑制PD-1/PD-L1信號通路,激活免疫細胞活性,增強機體內(nèi)源性抗腫瘤免疫效應(yīng)密切相關(guān),為晚期結(jié)直腸癌的臨床治療提供必要的依據(jù)。