朱 俊，姜 云，徐瑩瑩，劉 劍

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院1 心胸外科；2 腫瘤化療科，江蘇 226001）

肺癌是發(fā)病率和致死率較高的惡性腫瘤之一,非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占全部肺癌的80%～85%[1]。盡管NSCLC 綜合治療（包括手術(shù)、放化療、免疫治療和靶向治療等）取得較快進(jìn)展,但患者5年總體生存率仍然很低[2-3]。進(jìn)一步探究NSCLC 生物學(xué)機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。MicroRNA（miRNA）是一類小而短的非編碼單鏈RNA,由19～25 個(gè)核苷酸組成,通過(guò)直接與mRNA 的3'-UTR 區(qū)域結(jié)合抑制mRNA 表達(dá)[4-5]。腫瘤組織中絕大多數(shù)miRNA 是腫瘤抑制因子,但普遍受到抑制[6]。miRNA 表達(dá)水平與患者臨床參數(shù)及預(yù)后密切相關(guān),可作為腫瘤診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物[7]。有研究顯示,miR-383-5p 能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,可作為乳腺癌預(yù)后指標(biāo)和抗腫瘤抑制劑[8]。低表達(dá)miR-335-5p、miR-155-5p、miR-146a-5p 和miR-124-3p 胃癌患者的分期更晚,腫瘤分化更差,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤(rùn)率更高,預(yù)后更差[9]。miR-29a-3p 在淋巴細(xì)胞白血病患者血清及細(xì)胞株中表達(dá)降低,通過(guò)靶向肝癌衍生生長(zhǎng)因子（HDGF）抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡[10]。腎透明細(xì)胞癌中miR-29a-3p 通過(guò)下調(diào)KDM5B 的表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[11]。本研究對(duì)12 例NSCLC 手術(shù)切除癌組織及癌旁正常組織進(jìn)行miR-29a-3p 表達(dá)檢測(cè),研究NSCLC 中miR-29a-3p 的表達(dá)及其對(duì)NSCLC 發(fā)生、進(jìn)展的作用。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 選擇2022年1月—3月我院胸外科行手術(shù)切除的12 例NSCLC 患者,均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí),臨床分期Ⅱ～Ⅲ,其中3 例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,術(shù)前均未進(jìn)行放化療。取癌組織及距腫瘤邊緣約2 cm的正常組織。本研究獲南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 正常支氣管上皮細(xì)胞株BEAS-2B 及NSCLC 細(xì)胞株H1299 和A549（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）用含10%胎牛血清（FBS）（Gibco,美國(guó)）的RPMI-1640 培養(yǎng)液（Gibco,美國(guó)）在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿后用胰酶消化,按5×105/孔加入6 孔板,待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí),根據(jù)Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑（碧云天,中國(guó)）說(shuō)明書操作步驟轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照（NC）和miR-29a-3p mimics,繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 RNA 提取和RT-qPCR 檢測(cè) 采用Trizol 試劑（Invitrogen,USA）提取組織和細(xì)胞中總RNA,取1 μL RNA 樣品,One Drop 2000 超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA 純度及濃度。miRNA 加Poly（A）尾后,將1 μg總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)程序42 ℃、50 min,85 ℃、5 min。最后,采用miRNA 熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒（康為,中國(guó)）進(jìn)行RT-qPCR,反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、10 min,變性95 ℃、15 s,退火/延伸60 ℃、1 min,重復(fù)40 個(gè)循環(huán)。以U6 作為內(nèi)參。miR-29a-3p 引物序列：上游5'-TGCGGACTGATTTCTTTTGG-3';下游5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。U6 引物序列：上游5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3';下游5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-29a-3p 相對(duì)表達(dá)量。

1.4 CCK-8 細(xì)胞增殖活力檢測(cè) H1299 和A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后以每孔1×104個(gè)接種于96 孔板,于37 ℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 和96 h。根據(jù)CCK-8 試劑說(shuō)明書（碧云天,中國(guó)）操作,棄去培養(yǎng)基,加入CCK8 試劑,37 °C 孵育1 h,于酶標(biāo)儀450 nm 處測(cè)量吸光度。

1.5 EdU 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 依照BeyoClickTMEdU 試劑盒（碧云天,中國(guó)）說(shuō)明書操作,H1299 和A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后與50 μmol/L EdU 溶液在37 °C 下孵育2 h,4%多聚甲醛固定15 min,0.2%Triton X-100 通透10 min,在避光條件下分別用點(diǎn)擊反應(yīng)液和Hoechst 染料孵育30 min。熒光顯微鏡（Olympus,日本）觀察并拍照,Image J 軟件計(jì)數(shù)。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn) H1299 和A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用200 μL 移液器吸頭在6 孔板底部垂直劃線,顯微鏡下觀察并拍照。隨后加入含2% FBS 培養(yǎng)基,于37 ℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng),24 h 后顯微鏡下觀察并拍照。使用Image J 軟件分別計(jì)算劃痕的愈合面積。

1.7 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 我們?cè)趍iRDB、RNA22、TarBase、TargetScan 4 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中分別預(yù)測(cè)miR-29a-3p 的靶基因,將這些靶基因作韋恩圖取交集,然后進(jìn)行Gene Ontology（GO）富集分析,探究miR-29a-3p 可能的作用通路。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖。計(jì)量資料以±s表示,配對(duì)資料采用配對(duì)t 檢驗(yàn),兩組間差異性比較采用t 檢驗(yàn),三組間差異性比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC 組織及細(xì)胞中miR-29a-3p 低表達(dá) RTqPCR 檢測(cè)顯示,與正常肺組織相比,NSCLC 組織中miR-29a-3p 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）,見(jiàn)圖1A。H1299 和A549 細(xì)胞中miR-29a-3p 的表達(dá)水平顯著低于正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B（P＜0.05）,見(jiàn)圖1B。

圖1 miR-29a-3p 在NSCLC 組織及細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 miR-29a-3p 抑制NSCLC 細(xì)胞增殖 H1299 和A549 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染NC 和miR-29a-3p mimics 后,RT-qPCR 檢測(cè)顯示,miR-29a-3p mimics 組較NC組miR-29a-3p 的表達(dá)量顯著增高（P＜0.01）,見(jiàn)圖2A,說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。CCK8 實(shí)驗(yàn)表明,miR-29a-3p mimics 組H1299 和A549 細(xì)胞的增殖活力明顯下降（P＜0.01）,見(jiàn)圖2B-2C。EDU 實(shí)驗(yàn)也表明miR-29a-3p mimics 組H1299 和A549 細(xì)胞的增殖能力降低（P＜0.05）,見(jiàn)圖2D。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-29a-3p 對(duì)NSCLC 細(xì)胞增殖的影響

2.3 miR-29a-3p 抑制NSCLC 細(xì)胞遷移 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC 組相比,miR-29a-3p mimics 組H1299 和A549 細(xì)胞的傷口愈合面積均顯著降低（P＜0.05）,見(jiàn)圖3A-B。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 miR-29a-3p 靶基因的GO 富集分析 GO 富集分析顯示,miR-29a-3p 靶基因主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、膠原結(jié)合、含有細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、外部封裝結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織、細(xì)胞外基質(zhì)組織、多肽賴氨酸修飾等相關(guān)通路,見(jiàn)圖4。

圖4 預(yù)測(cè)miR-29a-3p 靶基因及GO 富集分析

3 討 論

既往研究發(fā)現(xiàn),miRNA 在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管生成等過(guò)程中發(fā)揮重要作用,miRNA 表達(dá)模式與腫瘤類型、分期和轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)[12]。miR-451a 在NSCLC 組織和細(xì)胞系中下調(diào),miR-451a 通過(guò)靶向調(diào)節(jié)ATF2,抑制NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲[13];miR-485-5p 在NSCLC 中的表達(dá)下調(diào),NSCLC 過(guò)表達(dá)可通過(guò)靶向RRM2 抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移,增強(qiáng)順鉑的敏感性[14]。因此越來(lái)越多的研究致力于探索miRNA 作為NSCLC 生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的價(jià)值[15]。

miR-29a-3p 在許多腫瘤發(fā)展過(guò)程中具有重要作用,如食管癌中miR-29a-3p 通過(guò)靶向VEGFA/CDC42/PAK1 信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[5];肝細(xì)胞癌中miR-29a-3p 通過(guò)靶向IGF1R 抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[16];甲狀腺癌中miR-29a-3p通過(guò)靶向OTUB2 抑制NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo),抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和侵襲[17]。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC 組織及細(xì)胞系中miR-29a-3p 低表達(dá),miR-29a-3p 能抑制NSCLC 細(xì)胞的增殖和遷移。富集分析顯示miR-29a-3p 與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、膠原結(jié)合、含有細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、外部封裝結(jié)構(gòu)組織,細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織,細(xì)胞外基質(zhì)組織、多肽賴氨酸修飾等相關(guān)通路密切相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn),人支氣管上皮細(xì)胞中miR-29a-3p 通過(guò)抑制SPARC/ERK 信號(hào)通路抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）,最終抑制細(xì)胞遷移[18],因此推測(cè)miR-29a-3p 抑制NSCLC 細(xì)胞遷移可能與EMT有關(guān)。

總之,本研究表明miR-29a-3p 是NSCLC 抑制因子,能抑制NSCLC 細(xì)胞增殖和遷移,其分子信號(hào)通路有待于進(jìn)一步深入研究。miR-29a-3p 可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分抑制NSCLC 細(xì)胞遷移。