黃均慧，王 峰，王 華

（1 南通大學醫(yī)學院，江蘇 226001；南通大學附屬醫(yī)院2 甲乳外科，3 檢驗科）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率仍在不斷上升[1-2]。促紅細胞生成素產生肝細胞激酶（erythropoietin producing hepatocytekinase,Eph）受體是受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase,RTK）家族的最大亞類,Eph 受體及其Ephrin 配體參與人類多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[3]。已有研究表明,EphB3 在非小細胞肺癌、結直腸癌和卵巢粘液性癌等腫瘤中異常表達[4-6]。本研究收集2015—2016年南通大學附屬醫(yī)院甲乳外科80 例乳腺癌患者的手術標本,測定乳腺癌組織及其癌旁組織中EphB3 受體表達水平,分析EphB3 受體與乳腺癌臨床病理學參數以及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 女性乳腺癌患者80 例,均行乳腺癌改良根治手術,術前未接受過其他抗腫瘤治療,經病理證實為原發(fā)性腫瘤。手術切取乳腺癌組織及其周圍5 cm 處正常組織,隨即置于-80 °C 冰箱保存待測。本研究經過南通大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準,患者簽署知情同意書。

1.2 RNA 提取和濃度測定 組織標本置于冰上,每例標本約取50 mg,剪碎后放入EP 管中,加入1 mL Trizol 試劑（Invitrogen 公司,美國）和3 顆研磨珠,研磨機（KZ-III-F）研磨后移至新EP 管中,進行瞬時離心。加入0.2 mL 三氯甲烷,震蕩混勻后在4 ℃、12 000 r/min 離心15 min。取最上層透明液體0.5 mL移至新EP 管中。加0.5 mL 異丙醇沉淀RNA,離心,保留白色膠狀沉淀。加入1 mL 75%酒精洗滌,再次4 ℃、7 500 r/min 離心10 min,留下白色沉淀。置于50 ℃烘箱中15 min,使白色沉淀變?yōu)橥该鳌＜尤?0 μL DEPC 水,再次于60 ℃烘箱中5 min,獲得RNA 原液。采用紫外線光譜儀測定RNA 濃度,置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3 逆轉錄 提取的RNA 置于冰上,依照逆轉錄試劑盒說明書依次添加各種試劑。采用C1000 基因擴增儀,25 °C 300 s,42 °C 3 600 s,70 °C 300 s,4°C至結束。結束后加入DEPC 水,將逆轉錄的cDNA 稀釋6 倍,震蕩搖勻后放入-80 °C 冰箱中保存。

1.4 實時熒光定量PCR 依次向八連管中加入熒光染料10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、反轉錄產物cDNA 8 μL,以U6 作為內參,每例樣本設置3 個復孔。采用Cobas z 480 型全自動熒光PCR 分析儀（羅氏公司,瑞士）,反應設置：95 °C 10 min,95 °C 15 s,60 °C 30 s,72 °C 30 s,循環(huán)45 次。結束后以2-△△CT值計算EphB3 相對表達水平。EphB3 及U6 引物序列按相關文獻獲得[7-8],U6 上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',U6 下游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3';EphB3上游引物：5'-GGC CATAGCCTATCGGAAGT-3',EphB3 下游引物：5'-TCCCAGTAGGGTCGCTCTC-3'。所用引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5 病理參數 患者病理參數包括年齡、腫瘤直徑、淋巴結轉移、組織學分級、TNM 分期、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、Ki67、人表皮生長因子受體-2（HER-2）表達、分子分型和病理類型。乳腺癌組織學分級分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級[9],按第八版乳腺癌AJCC分期體系作為TNM 分期依據[10]。Ki67 表達＞20%為陽性[11];三陰性乳腺癌定義為ER、PR 和HER-2 均陰性的乳腺癌;HER-2 陽性定義為免疫組織化學結果為3+或ISH 檢測陽性。原位癌包括導管內癌和小葉原位癌。

1.6 統計學處理 應用SPSS 26.0 和GraphPad-Prism 8.0 軟件進行數據分析和圖片繪制。計量資料以±s表示,組間比較采用t 檢驗和方差分析;計數資料以頻數和率表示,組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EphB3受體在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的表達 EphB3 受體在乳腺癌組織中的表達水平高于對應癌旁正常組織,差異具有統計學意義（P＜0.001）。見圖1。

圖1 EphB3 受體在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的表達

2.2 EphB3 受體表達與臨床病理參數的關系 EphB3受體在乳腺癌中的表達與患者年齡、腫瘤直徑、TNM分期、ER、PR、HER-2、Ki67 表達及分子分型無相關性（P＞0.05）,與淋巴結轉移、組織學分級及病理類型有關（P＜0.05）。見表1。

表1 EphB3 表達與臨床病理參數的關系 例

2.3 EphB3 受體表達與乳腺癌患者預后的關系 患者術后出院通過電話和門診隨訪60 個月,復發(fā)或轉移26 例,無復發(fā)轉移54 例。Kaplan-Meier 生存曲線分析顯示,乳腺癌組織EphB3 高表達患者無進展生存期較低表達患者更短（P=0.019）,差異有統計學意義。見圖2。

圖2 Kaplan-Meier 生存曲線

2.4 影響無進展生存期相關因素 采用Cox 比例風險回歸模型進行單因素和多因素分析,結果顯示,EphB3 受體高表達、HER-2 陽性、分子分型三陰性以及淋巴結轉移是影響乳腺癌患者無進展生存期的獨立危險因素（P＜0.05）。見表2。

表2 乳腺癌無進展生存期影響因素分析

3 討 論

乳腺癌為高度異質性惡性腫瘤,個體化治療尤為重要[12]。Eph 受體家族通過受體與配體、適配器蛋白和觸發(fā)下游信號通路的相互作用產生影響,不公影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,而且為新的癌癥靶向策略提供基礎[13]。在非小細胞肺癌中EphB3 受體以一種不依靠激酶的通路促進腫瘤細胞增殖、轉移和種植,可能成為治療非小細胞肺癌的有效治療靶點。

本研究結果顯示,乳腺癌組織EphB3 受體表達水平顯著高于對應癌旁正常組織,差異具有統計學意義（P＜0.01）,提示EphB3 受體在乳腺癌中發(fā)揮促瘤作用,有望成為乳腺癌新的治療靶點。文獻報道,EphB3 受體在結直腸癌和卵巢漿液性癌中的表達顯著降低,其過表達預示患者更好的預后[4-6],這與本研究結果矛盾,說明EphB3 受體在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用依賴于腫瘤類型。

EphB3 受體與多種人類癌癥的進展和預后有關。本研究結果顯示,EphB3 受體表達與乳腺癌組織學分級、淋巴結轉移及病理類型密切相關,組織學分級越高、發(fā)生淋巴結轉移和病理類型為浸潤性癌的患者EphB3 受體表達越高。EphB3 受體高表達患者無進展生存期顯著縮短,Cox 比例風險回歸模型表明EphB3 受體高表達、HER-2 陽性、分子分型三陰性以及發(fā)生淋巴結轉移是乳腺癌不良預后的獨立危險因子。與預期相反的是,本研究中不同TNM 分期和分子分型乳腺癌中EphB3 受體表達無顯著差異,這可能與樣本量小有關。

綜上所述,EphB3 受體在乳腺癌組織中表達水平明顯增高,EphB3 受體高表達是影響乳腺癌患者預后的獨立危險因素。本文為回顧性研究,患者臨床分期較好,大部分為浸潤性癌,少部分為原位癌,不同手術方法和術后輔助治療可能影響患者預后,需要進一步研究。今后應增大樣本量,開展細胞實驗,分析EphB3 受體對乳腺癌細胞轉移和增殖的作用,進一步探索EphB3 受體促進乳腺癌進展的分子機制。