瞿 峰，胡懿淋，朱 斌，陳 煜

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，江蘇 226001）

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,目前居全球腫瘤發(fā)病率第三位,死亡率居第五位[1-2],在中國(guó)胃癌為公次于肺癌的第二常見惡性腫瘤。胃癌發(fā)病與幽門螺桿菌感染、吸煙、食用腌制食品和高鹽飲食有關(guān)[3]。盡管近年來(lái)手術(shù)結(jié)合放療、免疫治療和靶向治療明顯改善胃癌患者的預(yù)后,但5年生存率仍很低,因此尋找胃癌的有效治療靶點(diǎn)具有重要意義。

WD 重復(fù)結(jié)構(gòu)域27（WD Repeat Domain 27,WDR27）屬于含WDR 結(jié)構(gòu)域超家族,編碼具有多個(gè)WD 重復(fù)的蛋白質(zhì),WDR 結(jié)構(gòu)域由多個(gè)β-螺旋結(jié)構(gòu)組成,通常用作蛋白質(zhì)相互作用的支架,并為多蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝提供平臺(tái),參與廣泛的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò),如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期控制、細(xì)胞骨架組裝和染色質(zhì)修飾等,其中許多與人類疾病有關(guān)[4]。本研究收集2010年1月—12月南通大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科胃癌手術(shù)標(biāo)本150 例,采用qRT-PCR 檢測(cè)胃癌組織及癌旁組織中WDR27 mRNA 的表達(dá),分析WDR27 mRNA 表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 胃癌手術(shù)患者150 例,男性96 例,女性54 例,年齡28～84 歲,平均61.16±11.54 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）手術(shù)標(biāo)本經(jīng)病理確診為原發(fā)性胃癌;（2）術(shù)前未接受過(guò)任何抗腫瘤治療;（3）無(wú)其他部位腫瘤;（4）臨床資料及隨訪資料完整?；颊叱鲈汉筮M(jìn)行隨訪,隨訪截止于2015年8月或患者死亡,隨訪時(shí)間3～67 個(gè)月。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 RNA 提取、cDNA 合成和qRT-PCR 胃癌及癌旁組織用生理鹽水沖洗干凈后迅速放入-80 ℃凍存。使用Trizol 試劑（Invitrogen,美國(guó)）按說(shuō)明書提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（生工生物）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,采用PCR 試劑盒（生工生物）進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),檢測(cè)胃癌及癌旁組織中WDR27 mRNA。以GAPDH 作為內(nèi)參,引物序列為：WDR27：5’-GTGGTTCATCCATCAGGGGG-3’（F）,5’-GGGGATCCCTTTTGAGGAGC-3’（R）。根據(jù)WDR27 mRNA 表達(dá)水平分為高表達(dá)組（癌組織高于癌旁組織）和低表達(dá)組（癌旁組織高于癌組織）。

1.3 線上數(shù)據(jù)庫(kù) 利用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)（https：//cancergenome.nih.gov/）,收集375 例胃癌樣本和32例癌旁樣本數(shù)據(jù),其中27 對(duì)為配對(duì)樣本,分析WDR27 在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。WDR27 與患者年齡、性別、臨床分期等臨床特征間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn),繪制Kaplan-Meier 生存曲線,生存率比較采用Log-rank 檢驗(yàn),預(yù)后因素分析采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織中WDR27 表達(dá) 分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),非配對(duì)樣本或者配對(duì)樣本,胃癌組織中WDR27 表達(dá)均高于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1A,1B）。本研究對(duì)150 例組織樣本進(jìn)行qRT-PCR 檢測(cè)顯示,88 例（58.67%）（高表達(dá)組）胃癌組織中WDR27 mRNA 表達(dá)水平高于癌旁組織,62 例（41.33%）（低表達(dá)組）癌旁組織中WDR27 mRNA 表達(dá)水平高于胃癌組織（圖1C）。

圖1 胃癌組織及癌旁組織WDR27 mRNA 表達(dá)

2.2 胃癌組織中WDR27 表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 WDR27 mRNA 表達(dá)與腫瘤T 分期（P=0.003）、TNM 分期（P=0.001）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.049）有關(guān),而與性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤大小及位置無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見表1。

表1 胃癌組織中WDR27 mRNA 表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 例（%）

2.3 影響胃癌患者預(yù)后的因素分析 單因素Cox回歸模型分析顯示,WDR27 mRNA 表達(dá)、分化程度、腫瘤大小、TNM 分期、T 分期、淋巴轉(zhuǎn)移與胃癌患者預(yù)后相關(guān)。多因素Cox 回歸分析顯示,WDR27 mRNA表達(dá)水平（HR=2.173,95%CI：1.119-4.221,P=0.022）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=5.049,95%CI：1.704-14.962,P=0.003）是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素,見表2。WDR27 mRNA 低表達(dá)胃癌患者總生存期長(zhǎng)于高表達(dá)者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）,見圖2。

圖2 WDR27 mRNA 低表達(dá)組與高表達(dá)組胃癌患者總生存期比較

表2 Cox 回歸分析影響胃癌患者預(yù)后因素

3 討 論

胃癌異質(zhì)性高,具有侵襲能力強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。目前早期胃癌的主要治療方法是手術(shù)和化療,術(shù)后化療的效果影響患者的預(yù)后和生存率[5]。惡性腫瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,患者預(yù)后就較差[6]。因此,有必要尋找新的標(biāo)志物為胃癌診斷和治療提供靶點(diǎn)。

近年來(lái)關(guān)于含WDR 結(jié)構(gòu)域超家族的研究取得較大進(jìn)展。研究顯示,WDR76 與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病密切相關(guān)[7-9]。WDR34 在膠質(zhì)瘤、乳腺癌和肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào),且與患者不良預(yù)后相關(guān),敲除WDR34基因可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力[10-12]。WDR54在結(jié)直腸癌患者中高表達(dá),且是疾病特異性生存的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。在體內(nèi)和體外模型中敲除WDR54可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲性[13]。

為了解WDR27 在胃癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系,本研究對(duì)TCGA 公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)WDR27 在胃癌組織中高表達(dá);采用qRT-PCR 檢測(cè)150 例組織樣本,證實(shí)WDR27 mRNA 在胃癌組織中異常上調(diào),提示該基因可能發(fā)揮促癌作用,一定程度上參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。Cox 回歸模型單因素分析顯示,WDR27 mRNA 表達(dá)、分化程度、腫瘤大小、TNM 分期、T 分期、淋巴轉(zhuǎn)移與胃癌患者預(yù)后相關(guān)。多因素Cox 回歸分析顯示,WDR27 mRNA 表達(dá)水平和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素。WDR27 mRNA 低表達(dá)胃癌患者總生存期長(zhǎng)于高表達(dá)者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明WDR27 異常升高與胃癌惡性程度及疾病分期有關(guān),并預(yù)示患者預(yù)后較差。