季周婧，張麗麗，張 捷

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇 226001）

皮膚鱗狀細(xì)胞癌是一種常見的皮膚惡性腫瘤,發(fā)病率目前在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢[1],其發(fā)病機(jī)理、預(yù)防和治療是研究熱點(diǎn)[2]。siRNA（small interfering RNA）是一種短片段雙鏈RNA 分子,能以同源互補(bǔ)序列的mRNA 為靶目標(biāo)降解特定mRNA,導(dǎo)致相應(yīng)基因沉默。NET-1 屬于四聚體超家族（tetraspanin superfamily）（TM4SF）成員之一,其表達(dá)與多種腫瘤的過度增殖有關(guān)[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),靶向NET-1 的siRNA 真核表達(dá)載體能有效下調(diào)NET-1 基因表達(dá),抑制A431 皮膚鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤,提示NET-1 可能在A431 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲過程的信號傳遞中起關(guān)鍵作用[5-6]。Survivin屬于凋亡抑制蛋白（IAP）家族新成員,是近年來新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因[7]。本課題組前期研究顯示,在皮膚鱗癌形成和發(fā)展中促增殖基因NET-1 和抗凋亡基因Survivin 起重要作用,抑制此兩種基因可起到協(xié)同抗腫瘤作用。本研究構(gòu)建一組同時靶向NET-1和Survivin 基因的一鏈雙靶siRNA,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染A431 細(xì)胞,研究一鏈雙靶siRNA 對皮膚鱗癌細(xì)胞株NET-1 和Survivin 基因的抑制作用以及對細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人皮膚鱗癌細(xì)胞株A431 由西安第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍皮膚病研究所高天文教授惠贈。

1.2 構(gòu)建一鏈雙靶siRNA 在已經(jīng)篩選確定的單靶siRNA 序列基礎(chǔ)上,根據(jù)siRNA 優(yōu)化原理,將NET-1 基因siRNA 靶點(diǎn)序列和Survivin 基因siRNA靶點(diǎn)序列進(jìn)行排列組合,設(shè)計(jì)一條一鏈雙靶siRNA序列,其中正義鏈為連續(xù)的長鏈RNA,反義鏈為不連續(xù)的2 條短鏈RNA。NET-1 和Survivin siRNA 由百奧邁科生物技術(shù)有限公司協(xié)助設(shè)計(jì)與合成。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,合成的siRNA 質(zhì)量佳。siRNA 序列見表1。

表1 siRNA 序列

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將A431 細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)液（美國Invitrogen 公司）中,內(nèi)含10%小牛血清（FCS）、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素,置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后更換細(xì)胞培養(yǎng)液,細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶90%以上進(jìn)行傳代。轉(zhuǎn)染前1 d 將對數(shù)生長期A431 細(xì)胞以2×105個/mL密度接種于6 孔板（Nunc 公司）,待細(xì)胞生長匯合達(dá)到70%時,參照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen 公司）操作說明以50 nmol/L 終濃度加入細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。共分為5 組：第一組轉(zhuǎn)染一鏈雙靶siRNA,第二組轉(zhuǎn)染NET-1 siRNA,第三組轉(zhuǎn)染Survivin siRNA,第四組轉(zhuǎn)染NC siRNA,第五組為未轉(zhuǎn)染組（空白對照組）。于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h,熒光顯微鏡（Olympus BXn）檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.4 細(xì)胞免疫共沉淀 將對數(shù)生長期A431 細(xì)胞以2×105個/mL 密度接種于6 孔板,細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時加入RIPA 細(xì)胞裂解液（含PMSF 蛋白酶抑制劑）,冰上裂解30 min,12 000 r/min 離心30 min 后取上清。取少量上清液用于檢測蛋白表達(dá),其余上清液分成兩管,一管加入1 μg NET-1 抗體和30 μL protein A -beads,另一管不加抗體作為對照,4 °C 緩慢搖晃孵育過夜。免疫沉淀反應(yīng)后,4°C 下3 000 r/min離心15 min,將protein A -beads 離心至管底;小心吸去上清,protein A-beads 用裂解緩沖液洗3 次;加入15 μL 2×SDS 加樣緩沖液,沸水煮10 min。采用Western blot 法檢測蛋白表達(dá),蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入鼠抗人Survivin 抗體（1∶200）一抗4 ℃孵育過夜,洗去一抗后,加入兔抗鼠IgG 抗體（1∶2 000）二抗室溫孵育2 h,ECL 化學(xué)發(fā)光顯影。反向免疫共沉淀操作同上,用Survivin 抗體代替上面的NET-1抗體,Western blot 法檢測蛋白表達(dá)時以NET-1 抗體為一抗,羊抗兔IgG 抗體為二抗。

1.5 qRT-PCR 檢測基因表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后收獲細(xì)胞,TRIzol 法提取各組細(xì)胞總RNA,以mRNA為模板,oligo dT 為引物,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42 ℃30 min,Real-time PCR 反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,green I 0.5 μL,P1（10 μmol/L）0.5 μL,P2（10 μmol/L）0.5 μL,模板4 μL,DEPC 水7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性20 s,58 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,40 個循環(huán)。引物序列見表2。

表2 qRT-PCR 引物序列

1.6 Western blot 法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后加入細(xì)胞裂解液,冰上裂解30 min,12 000 r/min離心15 min,取上清,BCA 法檢測細(xì)胞總蛋白濃度。將40 μg 蛋白質(zhì)與相應(yīng)體積的2×上樣緩沖液混合,煮沸5 min 后上樣,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后采用半干轉(zhuǎn)印儀（Bio-Rad公司）將蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移至PVDF 膜（美國Pharmacia 公司）,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,分別加入兔抗人NET-1 抗體（1∶200）和鼠抗人Survivin 抗體（1∶200）,4 ℃孵育過夜。洗去一抗后,加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體（1∶1 000）和兔抗鼠IgG抗體（1∶2 000）室溫孵育2 h。ECL 化學(xué)發(fā)光顯影,以β-actin 作為內(nèi)參。

1.7 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖活力 取對數(shù)生長期A431 細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化后,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/孔接種于96 孔培養(yǎng)板中。分為5 組,設(shè)3個時間點(diǎn)（24 h、48 h、72 h）,每個時間點(diǎn)作3 個復(fù)孔。每孔加入100 μL 培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2下培養(yǎng),次日進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染,于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h 進(jìn)行CCK-8 檢測。將10 μL CCK-8 和100 μL DMEM 培養(yǎng)液（不含小牛血清）混合后加入各孔,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀測定各孔吸光值。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h 后細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度約1×106個/mL,取1 mL 細(xì)胞懸液用0.01 mol/L PBS 洗滌2 次,2 000 r/min 離心5 min,棄上清。將細(xì)胞重懸于500 μL Binding Buffer 中,先后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,室溫避光反應(yīng)5 min,立即上流式細(xì)胞儀（FACSCallibur,美國BD 公司）檢測。

1.9 細(xì)胞免疫熒光檢測NET-1、Survivin 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞以1×105個/mL 密度接種于鋪有載玻片的6 孔板,待細(xì)胞生長匯合達(dá)到70%時,同前分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h 以4%中性甲醛于4 ℃下固定細(xì)胞2 h,1%Trition 破膜30 min,1%BSA 室溫封閉2 h,加一抗（1∶50）4 ℃過夜。PBS洗3 遍后加入TRITC 和FITC 標(biāo)記的熒光二抗（1∶200）,避光室溫孵育2 h,Hochest（1∶1 000）避光染色30 min,緩沖甘油封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照,用于TRITC 激發(fā)波長為550 nm,FITC 激發(fā)波長為495 nm,Hochest 激發(fā)波長為353.6 nm,計(jì)數(shù)各組表達(dá)NET-1和Survivin 陽性細(xì)胞。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）,多組間比較采用方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞免疫共沉淀證實(shí)NET-1 和Survivin 在A431 細(xì)胞中的相互作用 用鼠抗人Survivin 抗體和A431 細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀,免疫復(fù)合物電泳轉(zhuǎn)膜后用兔抗人NET-1 抗體進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果表明,Western blot 檢測到免疫復(fù)合物中含NET-1 蛋白,證明NET-1 和Survivin 存在相互作用,免疫印跡中出現(xiàn)的條帶與細(xì)胞總蛋白條帶一致（圖1a）,反向免疫共沉淀Western blot 也同樣檢測到免疫復(fù)合物中含Survivin 蛋白（圖1b）,證實(shí)A431細(xì)胞中NET-1 和Survivin 存在相互作用。

圖1 A431 細(xì)胞中NET-1 和Survivin 蛋白表達(dá)

2.2 單靶和一鏈雙靶siRNA 轉(zhuǎn)染后A431 細(xì)胞中NET-1 和Survivin mRNA 和蛋白的表達(dá) A431 細(xì)胞轉(zhuǎn)染各組siRNA 48 h 后,熒光顯微鏡檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%。與siRNA-NC 組和control 組比較,轉(zhuǎn)染NET-1 siRNA 組細(xì)胞中NET-1 mRNA 水平降低57%,蛋白水平降低54%（圖2,圖3）,表明靶向NET-1 的siRNA 能有效下調(diào)NET-1 基因表達(dá)。同樣,與control 組比較,轉(zhuǎn)染Survivin siRNA 組細(xì)胞中Survivin mRNA 水平降低52%,蛋白水平降低58%（圖2,圖3）。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染NET-1 siRNA 組細(xì)胞中Survivin mRNA 水平降低11%（圖2）,蛋白水平降低27%（圖3）,轉(zhuǎn)染Survivin siRNA組細(xì)胞中NET-1 mRNA 水平降低19%（圖2）,蛋白水平降低15%（圖3）,表明干擾NET-1 的信號通路會降低Survivin 表達(dá),同樣干擾Survivin 信號通路會降低NET-1 表達(dá)。與control 組比較,轉(zhuǎn)染一鏈雙靶siRNA 組細(xì)胞中NET-1 mRNA 和蛋白水平分別降低80%（圖2）和85%（圖3）,Survivin mRNA 和蛋白水平分別降低77%（圖2）和82%（圖3）。一鏈雙靶siRNA 組mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯低于各單靶siRNA 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,表明一鏈雙靶siRNA 組基因沉默效果明顯優(yōu)于單靶siRNA組。siRNA-NC 組與control 組細(xì)胞中NET-1 和Survivin mRNA 及蛋白表達(dá)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA 后各組細(xì)胞NET-1和Survivin mRNA 相對表達(dá)量

圖3 轉(zhuǎn)染siRNA 后各組細(xì)胞中NET-1 和Survivin 蛋白表達(dá)

2.3 轉(zhuǎn)染siRNA 后各組A431 細(xì)胞增殖水平 轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h 時一鏈雙靶和單靶siRNA 組細(xì)胞增殖水平較siRNA-NC 組和control 組降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。一鏈雙靶siRNA 組細(xì)胞增殖水平低于siRNA-NET-1 組和siRNA-Survivin 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。單靶siRNA-NET-1 組和siRNA-Survivin 組細(xì)胞增殖水平比較,siRNA-NC組與control 組細(xì)胞增殖水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 CCK-8 法檢測A431 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 后細(xì)胞增殖曲線

2.4 轉(zhuǎn)染siRNA 后各組A431 細(xì)胞凋亡水平 經(jīng)Annexin V 和PI 雙染色流式細(xì)胞儀檢測獲得由4 個象限組成的細(xì)胞散點(diǎn)圖,其中左下象限代表活細(xì)胞,左上象限代表機(jī)械損傷細(xì)胞,右下象限代表凋亡細(xì)胞,右上象限代表晚期凋亡和死亡細(xì)胞。與siRNANC 組和control 組比較,轉(zhuǎn)染NET-1 siRNA 組、Survivin siRNA 組和一鏈雙靶siRNA 組細(xì)胞凋亡水平均明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。一鏈雙靶siRNA 組凋亡率高于NET-1 siRNA 組和Survivin siRNA 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。siRNANC 組與control 組細(xì)胞凋亡率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測A431 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 后細(xì)胞凋亡

2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測NET-1 和Survivin 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 細(xì)胞免疫熒光顯示,NET-1 和Survivin 蛋白表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜中（圖6A）。轉(zhuǎn)染siRNA-NET-1&Survivin、siRNA-NET-1、siRNASurvivin 48 h 后,NET-1 和Survivin 蛋白陽性細(xì)胞百分率較control 組降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。一鏈雙靶siRNA 組NET-1 和Survivin 蛋白陽性細(xì)胞百分率明顯低于siRNA-NET-1 和siRNASurvivin 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。siRNANC 組NET-1 和Survivin 蛋白陽性細(xì)胞百分率與control 組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6B。

圖6 A431 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 各組NET-1 和Survivin 蛋白定位與表達(dá)

3 討 論

NET-1 基因是新近報(bào)道的腫瘤相關(guān)基因,已發(fā)現(xiàn)NET-1 與腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、遷移、浸潤和誘導(dǎo)血管形成密切相關(guān)[8-10],并對判斷預(yù)后有一定價值。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)靶向NET-1 的siRNA 抑制A431 細(xì)胞增殖、遷移和浸潤[11]。Survivin 是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)凋亡抑制因子[7],可能通過抑制正常細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路,使受損細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視而無法清除,從而異常存活、形成優(yōu)勢克隆而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

RNA 干擾技術(shù)在腫瘤基因治療中具有巨大潛力,然而單基因治療的效果不甚理想,向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入多種相關(guān)基因發(fā)揮相互協(xié)同作用,以提高抗腫瘤效果是基因治療的發(fā)展方向。有證據(jù)表明,為了最大限度發(fā)揮shRNA 干擾效率,CHEN 等[12]構(gòu)建同時針對VEGF、hTERT 和Bcl-xl 三種基因的shRNA,然后直接注射到異種移植Hep-2 腫瘤裸鼠體內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF、hTERT 及Bcl-xl mRNA 和蛋白表達(dá)顯著降低,腫瘤生長曲線顯示其腫瘤治療效果明顯優(yōu)于對照組和非轉(zhuǎn)染組。

本研究在已篩選確定的單靶NET-1 siRNA 和Survivin siRNA 序列的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了針對NET-1和Survivin 基因的一鏈雙靶siRNA。在轉(zhuǎn)染一鏈雙靶siRNA 和單靶siRNA 的同時,以siRNA-NC 作為空載體對照組,排除載體轉(zhuǎn)染對細(xì)胞活力的影響,以未轉(zhuǎn)染作為空白對照組,排除試劑對細(xì)胞活力的影響。qRT-PCR、Western Blot 和細(xì)胞免疫熒光檢測表明,一鏈雙靶siRNA 能顯著抑制NET-1 和Survivin mRNA 和蛋白表達(dá),抑制效果明顯優(yōu)于單靶siRNA,提示一鏈雙靶siRNA 能同時關(guān)閉兩個靶基因,從而更有效下調(diào)NET-1 和Survivin mRNA 和蛋白表達(dá)。CCK-8 法和流式細(xì)胞術(shù)顯示,轉(zhuǎn)染一鏈雙靶siRNA后細(xì)胞凋亡率明顯升高,細(xì)胞增殖顯著受到抑制,效果優(yōu)于單靶組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫共沉淀證實(shí)NET-1 和Survivin 存在相互作用,提示NET-1 和Survivin 可聯(lián)合作為皮膚鱗癌的診斷指標(biāo)和治療靶標(biāo)。