謝澤碧,梁子寧,李 斌

(廣西中醫(yī)藥大學(xué),南寧 530001)

【研究意義】?jī)擅驷榌Zanthoxylumnitidum(Rox.) DC]是廣西地道藥材,為蕓香科花椒屬植物[1-3],具有鎮(zhèn)痛活絡(luò)、祛瘀活血和驅(qū)散風(fēng)邪等功效[4-5]。兩面針富含多種抗腫瘤活性成分,如氯化兩面針堿[1]、白屈菜紅堿[6]、別隱品堿、鹽酸血根堿和芝麻素等,具有較高的抗菌、抗炎、抗氧化和鎮(zhèn)痛活性[7]。其中,氯化兩面針堿已被中國(guó)藥典收錄[1]。近年來(lái),隨著農(nóng)林產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的不斷調(diào)整,毀林開(kāi)荒種植經(jīng)濟(jì)果林活動(dòng)日益頻繁,兩面針的生境受到嚴(yán)重破壞,加上被過(guò)度采挖導(dǎo)致資源急劇下降,嚴(yán)重影響以其為原料的中成藥及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn),而由于兩面針為多年生植物,人工栽培面積暫時(shí)未能滿足市場(chǎng)需求[8]。最新研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)生菌菌肥可維持和提高土壤肥力、改善土壤結(jié)構(gòu)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育及提升抗病害能力[9]。兩面針?lè)N植時(shí)間長(zhǎng),易受環(huán)境污染影響,但經(jīng)濟(jì)附加價(jià)值較高,應(yīng)用微生物菌肥進(jìn)行兩面針提質(zhì)增效將是兩面針增產(chǎn)增收的有效手段。因此,分析內(nèi)生菌肥對(duì)促進(jìn)兩面針生長(zhǎng)和品質(zhì)提升的影響,對(duì)提高兩面針?biāo)幉牡木C合效益具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】?jī)?nèi)生菌菌肥在植物抗病蟲(chóng)害、保產(chǎn)和增質(zhì)方面具有突出效果,在中藥材栽培中已得到廣泛應(yīng)用。林燕青等[10]研究發(fā)現(xiàn),利用從木麻黃(CasuarinaequisetifoliaForst.)各組織器官中分離與純化得到的內(nèi)生真菌制作的水培苗浸泡菌液,能顯著增加苗木的平均抽梢量,促進(jìn)水培苗生長(zhǎng),其中,菌株18處理下苗木的平均抽梢量為54.85 cm,是對(duì)照苗木的7.62倍。熊春霞等[11]研究表明,含細(xì)黃鏈霉菌的激抗菌968對(duì)提升延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)生長(zhǎng)發(fā)育、單株產(chǎn)量和單株有效藥用生物堿延胡索乙素含量的效果最佳。夏偉等[12]研究表明,分離自地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.ex Fisch.et Mey.)不同部位內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子可促進(jìn)懷地黃組培苗生長(zhǎng),并提高其次生代謝產(chǎn)物含量。伍曉麗等[13]研究認(rèn)為,從青蒿(ArtemisiaannuaL.)側(cè)枝中分離獲得的內(nèi)生真菌(深綠木霉)液體發(fā)酵菌絲體在4—5月對(duì)青蒿幼苗生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用,因此,深綠木霉可作為青蒿苗肥及與化肥配合施用于成株。遲惠榮等[14]從多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)的根、莖、葉內(nèi)分離出具有拮抗作用的內(nèi)生菌株ZJU-3,通過(guò)溫室栽培試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)多花黃精具有顯著促生效果。何嘉等[15]探究不同微生物菌劑處理對(duì)枸杞(LyciumbarbarumL.)樹(shù)體生長(zhǎng)發(fā)育及果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的影響,結(jié)果顯示,各處理枸杞果實(shí)內(nèi)含物多糖、甜菜堿和總黃酮含量分別較對(duì)照顯著提高4.55%～25.00%、25.50%～43.67%和12.50%～58.00%,胡蘿卜素含量提高達(dá)2.8～3.6倍,提升了果實(shí)品質(zhì)。【本研究切入點(diǎn)】目前,雖有大量研究結(jié)果顯示微生物菌肥在中藥材增產(chǎn)和品質(zhì)提升方面表現(xiàn)出優(yōu)良特性,但尚未見(jiàn)微生物菌肥尤其是兩面針內(nèi)生真菌Y118在兩面針?lè)N植管理中應(yīng)用的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以兩面針和其內(nèi)生真菌Y118(Phomopsissp.)為試驗(yàn)材料開(kāi)展盆栽試驗(yàn),分析其株高、鮮重、莖基寬和根的產(chǎn)量等生長(zhǎng)指標(biāo),測(cè)定其根部的氯化兩面針堿和白屈菜紅堿含量,綜合評(píng)價(jià)內(nèi)生真菌Y118對(duì)兩面針品質(zhì)和產(chǎn)量的影響,以期為微生物肥料在兩面針及其他藥材種植上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年4月至2022年6月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)植物培養(yǎng)室進(jìn)行。盆栽試驗(yàn)用兩面針材料為廣西中醫(yī)藥大學(xué)梁子寧研究課題組經(jīng)組培、煉苗獲得的幼苗。兩面針內(nèi)生真菌Y118為半知菌亞門(mén)擬莖點(diǎn)眉屬真菌,由廣西中醫(yī)藥大學(xué)梁子寧研究課題組前期從廣西產(chǎn)兩面針原植物葉片分離得到[16]。

主要儀器與試劑:Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)、ES2220M分析天平[(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)]、KQ5200B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、氯化兩面針堿對(duì)照品(批號(hào)為MUST-21101707,純度≥99.81%,成都曼思特生物科技有限公司)、白屈菜紅堿對(duì)照品(批號(hào)為RP200514,純度≥99.77%,成都麥德生科技有限公司)、三乙胺(色譜級(jí),上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、磷酸(色譜級(jí),天津市科密歐化學(xué)試劑)及乙腈和甲醇[色譜級(jí),賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)]等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固體發(fā)酵培養(yǎng)基制作 參考秦秀麗等[17]的方法,固體培養(yǎng)基按一定配方比例組成(以麥片和大米為載體,加入一定量的麥芽糖、蛋白胨和KH2PO4等,料水比為1∶1),內(nèi)生真菌Y118經(jīng)PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)3～4 d,每60 g固體培養(yǎng)基接入1塊直徑約1.5 cm的菌餅,25 ℃發(fā)酵培養(yǎng)40 d,制作成固體發(fā)酵培養(yǎng)基,備用。

1.2.2 菌苗共培養(yǎng) 選擇統(tǒng)一株高(約5.0 cm)、葉片數(shù)3～5片的兩面針幼苗,移栽于內(nèi)徑15.5 cm、高14.0 cm的塑料花盆,每盆用基質(zhì)土(廣西中醫(yī)藥大學(xué)松樹(shù)林下疏松泥土)種植1株。移栽后10～15 d,幼苗生長(zhǎng)穩(wěn)定后開(kāi)始設(shè)置真菌Y118處理和對(duì)照(CK)2個(gè)處理,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)10盆。其中,真菌Y118處理每株施加25 g固體發(fā)酵培養(yǎng)基,CK每株施加25 g未加菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。移栽后澆透水,養(yǎng)護(hù)過(guò)程中每天定時(shí)澆水,濕度保持在80%左右。

1.2.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法 產(chǎn)量測(cè)定:觀察兩面針幼苗生長(zhǎng)情況并于培養(yǎng)3、6、9和12個(gè)月時(shí)隨機(jī)選取不同處理的兩面針樣品測(cè)量其生長(zhǎng)指標(biāo);每次取樣后,用自來(lái)水沖洗兩面針植株表面殘余的土壤,最后用紗布吸干水分,測(cè)量其株高、鮮重、根重等生長(zhǎng)指標(biāo);進(jìn)行兩面針樣品烘干時(shí),將其地上和地下部分離,置于60 ℃烘箱中烘干至恒重,記錄樣品干重。樣品烘干后用于分析生物量。

主要活性成分含量測(cè)定:分別將培養(yǎng)3、6、9和12個(gè)月干燥后的兩面針根部粉碎過(guò)60目(0.3 mm)篩,采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定其氯化兩面針堿和白屈菜紅堿含量。

相關(guān)分析:對(duì)兩面針幼苗4個(gè)培養(yǎng)時(shí)期的各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析,比較活性有效成分含量和生長(zhǎng)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行整理,以SPSS 23.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌Y118對(duì)兩面針幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

2.1.1 菌苗共培養(yǎng)3個(gè)月的生長(zhǎng)指標(biāo) 由表1可知,在促生培養(yǎng)滿3個(gè)月時(shí),真菌Y118處理兩面針幼苗的鮮重、株高、莖基寬和莖中寬分別為34.76 g、34.47 cm、6.54 mm和4.25 mm,分別是CK的7.08、3.10、2.40和1.29倍,與CK間均存在極顯著差異(P<0.01,下同);根鮮重和莖鮮重分別為8.18和7.53 g,分別是CK的12.39和8.56倍,與CK間存在極顯著差異;葉鮮重為16.99 g,是CK的6.34倍,與CK間存在顯著差異(P<0.05,下同);根干重、莖干重和葉干重分別為2.08、2.59和5.32 g,分別是CK的12.24、10.79和8.06倍,與CK間存在極顯著差異。可見(jiàn),施用內(nèi)生真菌Y118可極顯著促進(jìn)兩面針幼苗根、莖、葉生長(zhǎng)(株型和根系形態(tài)見(jiàn)圖1)。

A.株型生長(zhǎng)形態(tài);B.根生長(zhǎng)形態(tài)。A.Plant-type growth pattern;B.Root growth pattern.圖1 菌苗共培養(yǎng)3個(gè)月的兩面針幼苗生長(zhǎng)形態(tài)Fig.1 Growth morphology of the Z.nitidum vaccine after co-culture for 3 months

表1 菌苗共培養(yǎng)3個(gè)月的兩面針幼苗生長(zhǎng)情況Table 1 Growth of the Z.nitidum vaccine after co-culture for 3 months

2.1.2 菌苗共培養(yǎng)6個(gè)月的生長(zhǎng)指標(biāo) 由表2可知,當(dāng)培養(yǎng)滿6個(gè)月時(shí),真菌Y118處理兩面針幼苗的鮮重和株高分別為68.33 g和47.85 cm,分別較CK極顯著增加53.17%和31.02%;莖中寬為5.10 mm,較CK顯著增加12.33%;莖基寬與CK無(wú)顯著差異(P>0.05,下同);根鮮重、莖鮮重和葉鮮重分別為17.34、14.35和31.83 g,分別較CK極顯著增加89.92%、65.51%和45.34%;根干重、莖干重和葉干重分別為4.20、6.39和10.57 g,分別較CK極顯著增加51.08%、68.16%和35.51%。

表2 菌苗共培養(yǎng)6個(gè)月的幼苗生長(zhǎng)情況Table 2 Growth of the Z.nitidum vaccine after co-culture for 6 months

2.1.3 菌苗共培養(yǎng)9個(gè)月的生長(zhǎng)指標(biāo) 由表3可知,當(dāng)培養(yǎng)滿9個(gè)月時(shí),真菌Y118處理兩面針幼苗的鮮重、株高和莖基寬分別為73.80 g、49.22 cm和9.79 mm,分別較CK極顯著增加60.64%、68.04%和20.72%;莖中寬與CK無(wú)顯著差異;根鮮重和莖鮮重分別為18.54和16.91 g,分別較CK顯著增加33.86%和94.82%;葉鮮重為36.26 g,較CK極顯著增加73.74%;根干重、莖干重和葉干重分別為5.74、8.33和13.43 g,分別較CK極顯著增加56.40%、103.67%和 82.72%。

表3 菌苗共培養(yǎng)9個(gè)月的兩面針幼苗生長(zhǎng)情況Table 3 Growth of the Z.nitidum vaccine after co-culture for 9 months

2.1.4 菌苗共培養(yǎng)12個(gè)月的生長(zhǎng)指標(biāo) 由表4可知,當(dāng)培養(yǎng)滿12個(gè)月時(shí),真菌Y118處理兩面針幼苗的鮮重為78.71 g,較CK極顯著增加54.58%;株高、莖基寬和莖中寬與CK無(wú)顯著差異;莖鮮重和葉鮮重分別為10.06和39.78 g,分別較CK極顯著增加10.31%和77.43%;根鮮重與CK無(wú)顯著差異;根干重、莖干重和葉干重分別為6.12、8.54和13.56 g,分別較CK極顯著增加47.12%、88.94%和73.62%。

表4 菌苗共培養(yǎng)12個(gè)月的幼苗生長(zhǎng)情況Table 4 Growth of the Z.nitidum vaccine after co-culture for 12 months

綜合以上4個(gè)培養(yǎng)階段的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),施用內(nèi)生真菌Y118后盡管在不同培養(yǎng)階段兩面針生長(zhǎng)速度不同,但內(nèi)生真菌Y118均可明顯促進(jìn)其幼苗根、莖和葉的生長(zhǎng)。

2.2 兩面針根部氯化兩面針堿和白屈菜紅堿含量測(cè)定

從圖2可看出,菌苗共培養(yǎng)滿3個(gè)月和6個(gè)月時(shí),真菌Y118處理兩面針根部的氯化兩面針堿含量與CK相比雖明顯增加,但差異不顯著;菌苗共培養(yǎng)滿9個(gè)月時(shí),真菌Y118處理兩面針根部的氯化兩面針堿含量為0.783 mg/g,較CK顯著增加42.11%;菌苗共培養(yǎng)滿12個(gè)月時(shí),真菌Y118處理兩面針根部的氯化兩面針堿含量為0.904 mg/g,較CK顯著增加44.18%。從圖3可看出,菌苗共培養(yǎng)滿3個(gè)月和6個(gè)月時(shí),真菌Y118處理兩面針根部的白屈菜紅堿含量均高于CK,但無(wú)顯著差異;菌苗共培養(yǎng)滿9個(gè)月時(shí),真菌Y118處理兩面針根部的白屈菜紅堿含量為3.704 mg/g,較CK顯著增加40.73%;菌苗共培養(yǎng)滿12個(gè)月時(shí),真菌Y118處理兩面針根部的白屈菜紅堿含量為4.201 mg/g,較CK顯著增加26.57%。綜上所述,施用真菌Y118在一年期內(nèi)可促進(jìn)兩面針活性成分氯化兩面針堿和白屈菜紅堿含量積累,提高其藥材品質(zhì)。

圖柱上不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),下同。Different lowercase letters on the bar represented significant difference(P<0.05),the same as below.圖2 不同培養(yǎng)階段兩面針根部的氯化兩面針堿含量比較Fig.2 Comparison of nitidine chloride content in different culture stages in the root of Z.nitidum

圖3 不同培養(yǎng)階段兩面針根部的白屈菜紅堿含量比較Fig.3 Comparison of chelidonine content in different culture stages in the root of Z.nitidum

2.3 兩面針根部有效活性成分生物堿含量與生長(zhǎng)指標(biāo)的相關(guān)分析

對(duì)兩面針幼苗4個(gè)培養(yǎng)時(shí)期的各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析,結(jié)果(表5)表明,兩面針根部有效活性氯化兩面針堿含量與各生長(zhǎng)指標(biāo)均呈顯著或極顯著正相關(guān),相關(guān)密切程度排序?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間(0.996)>根干重(0.982)>莖基寬(0.960)>葉鮮重(0.959)>莖干重(0.955)>葉干重(0.953);白屈菜紅堿含量與根干重呈極顯著正相關(guān),與培養(yǎng)時(shí)間、莖基寬、莖干重、葉干重、葉鮮重和莖中寬呈顯著正相關(guān),相關(guān)密切程度排序?yàn)楦芍?0.995)>培養(yǎng)時(shí)間(0.983)>莖基寬(0.981)>莖干重(0.977)>葉干重(0.976)>葉鮮重(0.973)>莖中寬(0.956)。說(shuō)明通過(guò)增加培養(yǎng)時(shí)間、根干重、莖基寬、葉鮮重、莖干重和葉干重均可顯著或極顯著提高兩面針根部的氯化兩面針堿和白屈菜紅堿含量。

表5 兩面針根部有效活性生物堿含量與生長(zhǎng)指標(biāo)相關(guān)分析Table 5 Correlation analysis between the content of active alkaloids and growth indexes in the root of Z.nitidum

3 討 論

兩面針為亞灌木植物,生長(zhǎng)周期長(zhǎng),一般栽培3～5年甚至更長(zhǎng)年限才能以根入藥[8]。近年來(lái)毀林開(kāi)荒現(xiàn)象逐年嚴(yán)重,兩面針野生資源不斷減少[18],為了提高兩面針?biāo)幉牡木C合效益,需通過(guò)模擬自然條件探索內(nèi)生真菌對(duì)其生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果表明,接種內(nèi)生真菌Y118可促進(jìn)兩面針幼苗茂盛生長(zhǎng),接種后兩面針幼苗4個(gè)培養(yǎng)階段(3、6、9和12個(gè)月)植株的形態(tài)均發(fā)生明顯變化,其中,生長(zhǎng)參數(shù)(鮮重、株高、莖寬、根鮮重、莖鮮重、葉鮮重、根干重、莖干重和葉干重)在4個(gè)培養(yǎng)階段均顯著增加,在培養(yǎng)3個(gè)月時(shí)的促生長(zhǎng)效果尤其明顯,可能是因?yàn)樵?月施加菌肥時(shí)正值廣西南寧的春季,溫度和光照適宜,是最佳施肥期;而培養(yǎng)6和9個(gè)月時(shí)分別是廣西南寧的10月和次年1月,這2個(gè)時(shí)期的植株剛好分別經(jīng)歷炎熱的夏季和寒冷干旱的秋冬季,故生長(zhǎng)緩慢;在培養(yǎng)的第6～9個(gè)月時(shí)間段,兩面針生物量的積累速度比培養(yǎng)第3～6個(gè)月時(shí)間段減慢,一方面是因?yàn)榍罢哂汕锶攵?環(huán)境的溫度、濕度和光照等不利于兩面針生長(zhǎng),另一方面是內(nèi)生真菌Y118固體發(fā)酵培養(yǎng)基逐漸代謝,被逐漸消耗,對(duì)兩面針生長(zhǎng)的促進(jìn)作用降低,同時(shí)溫度過(guò)低不利于菌絲生長(zhǎng),這與陳龍[16]研究獲得25 ℃時(shí)Y118菌株的菌絲生長(zhǎng)快、菌絲質(zhì)地均勻、色澤鮮亮,溫度過(guò)低或過(guò)高菌絲生長(zhǎng)緩慢的結(jié)果相符。

氯化兩面針堿和白屈菜紅堿是兩面針根部的主要活性成分,均為衡量?jī)擅驷標(biāo)幉钠焚|(zhì)的重要指標(biāo)[19-20]。其中,氯化兩面針堿具有消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌等功效[21],對(duì)抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡具有顯著作用[22];白屈菜紅堿作為一種天然存在的苯并菲啶類生物堿,在抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛及抑制寄生蟲(chóng)生存等方面發(fā)揮著良好的生物活性作用[23]。本研究利用內(nèi)生真菌Y118與兩面針植株進(jìn)行共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)Y118菌株通過(guò)促生作用明顯有利于兩面針根部氯化兩面針堿和白屈菜紅堿活性成分積累,且當(dāng)培養(yǎng)滿9和12個(gè)月時(shí),氯化兩面針堿和白屈菜紅堿含量均較CK顯著增加,與任建國(guó)等[24]對(duì)太子參[Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Pax)]的研究結(jié)論相似。因此認(rèn)為,對(duì)于生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)的兩面針,在其人工種植過(guò)程中可利用內(nèi)生真菌Y118進(jìn)行促生栽培。后續(xù)將開(kāi)展接種內(nèi)生真菌Y118在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)兩面針高產(chǎn)、提升藥材活性成分含量以提高藥材品質(zhì)的大田試驗(yàn),以及對(duì)減少化肥農(nóng)藥使用量影響等研究,為生產(chǎn)上利用內(nèi)生真菌Y118提高兩面針的綜合效益提供更確切的依據(jù)。

4 結(jié) 論

接種內(nèi)生真菌Y118可顯著或極顯著提高兩面針幼苗的鮮重、株高、莖基寬和莖中寬,有利于促進(jìn)兩面針幼苗生長(zhǎng)發(fā)育,提高兩面針根部主要活性成分氯化兩面針堿和白屈菜紅堿含量,提升兩面針?biāo)幉牡木C合效益。