王 濤,李秀璋,2,陳建博,梁 靜,唐楚煜,李玉玲,2

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,西寧 810016;2.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,西寧 810016)

【研究意義】冬蟲夏草(Cordycepssinensis)是冬蟲夏草菌(Ophiocordycepssinensis)侵染寄主蝙蝠蛾幼蟲致死形成幼蟲尸體(菌核)與真菌子座的復(fù)合體[1]。冬蟲夏草是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材,與人參、鹿茸并稱‘中藥三大寶’[2-3]。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值普遍受到消費(fèi)者認(rèn)可,需求量逐年增加[4],青藏高原冬蟲夏草的蘊(yùn)藏量逐年降低[5],供需矛盾促使冬蟲夏草及其替代品成為研究熱點(diǎn)。【前人研究進(jìn)展】20世紀(jì)70年代始,學(xué)者們從冬蟲夏草中分離出多種菌種,但國(guó)家衛(wèi)生與健康委員會(huì)(原衛(wèi)生部)公布的“從冬蟲夏草中分離的可用于保健品的微生物名錄只有蝙蝠蛾擬青霉和蝙蝠蛾被毛孢可用于保健食品”[6]。1982年,蝙蝠蛾擬青霉被戴如琴等[7]分離并鑒定命名,其人工發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生多種活性物質(zhì),含量與種類和天然冬蟲夏草接近[8-11]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),蝙蝠蛾擬青霉菌絲體多糖、蟲草素、腺苷、甘露醇等具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血壓及降血糖多方面生物活性和功效[12-15],使得該菌已成為人工蟲草發(fā)酵生產(chǎn)制品的重要無(wú)性型菌株[16];但在其連續(xù)多代傳代發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該菌種出現(xiàn)退化現(xiàn)象。退化菌株形態(tài)表現(xiàn)出菌絲生物量減少、菌絲生長(zhǎng)速率緩慢、長(zhǎng)勢(shì)稀疏、子實(shí)體原基的產(chǎn)生減少、無(wú)性孢子的產(chǎn)能大幅度降低等[17-20];代謝產(chǎn)物如多糖、蟲草素、腺苷、粗蛋白等具有藥理活性物質(zhì)的產(chǎn)能下降等。因此,為了獲得具有優(yōu)勢(shì)性狀的菌株,需要對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)壯。常用的復(fù)壯方法為啟用該菌株的原始菌株多次轉(zhuǎn)管活化、退化菌株的人工栽培分離子實(shí)體的單孢子、組織等,將菌株重新接種到寄主上進(jìn)行侵染[21-22],劉小霞[23]、崔曉等[24]也嘗試從真菌原生質(zhì)體和改變培養(yǎng)基碳氮源的角度進(jìn)行復(fù)壯,但僅延緩了菌種的退化。實(shí)踐證明以上方法仍然面臨以下問(wèn)題:菌種保存困難導(dǎo)致原始菌株出現(xiàn)不同程度的退化[25],有些菌株的單孢子分離十分困難且耗費(fèi)人力,如冬蟲夏草菌是否為多菌復(fù)合體一直是學(xué)術(shù)界討論的熱點(diǎn)問(wèn)題之一[26-27],由于侵染率較低(自然條件下僅有3%～5%),即使人工干預(yù)也難以得到理想的復(fù)壯菌株[28-29]。因此,結(jié)合物理學(xué)方法進(jìn)行退化菌株的紫外誘變成為現(xiàn)代菌株復(fù)壯的新方法,物理誘變常用的誘變劑是紫外線(UV),原理是紫外線的光譜與核酸的吸收光譜一致,可以引起 DNA 結(jié)構(gòu)的變化,如鏈的斷裂、胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用、胸腺嘧啶二聚體的形成等。紫外誘變中最常用且比較有效的誘變劑為UVB(280～315 nm)與UVC(200～280 nm)[30],蝙蝠蛾擬青霉在與青藏高原高紫外環(huán)境的相互適應(yīng)中對(duì)紫外輻射有著較好的耐受性[31-32],因此需要選取更強(qiáng)的UVC才有可能誘變成功。【本研究切入點(diǎn)】本文對(duì)青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院草原研究所冬蟲夏草研究室已有的蝙蝠蛾擬青霉菌株YS-01進(jìn)行UVC紫外誘變,以期獲得菌絲速率、生物量、產(chǎn)孢量、多糖、粗蛋白、腺苷、甘露醇等含量綜合最優(yōu)的菌株?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究可為蝙蝠蛾擬青霉的人工利用提高優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 出發(fā)菌株 出發(fā)菌株為是青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院冬蟲夏草研究室保存的蝙蝠蛾擬青霉YS-01,經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定為Paecilomyceshepiali(圖1)。

T為模式菌株,YS-01為下劃線字體菌株。 T is the type strain,and YS-01 is an underlined font strain.圖1 基于部分TEF1、RPB2、SSU、ITS及LSU序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis based on partial sequences of TEF1, RPB2, SSU, ITS and LSU

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面、平板、液體培養(yǎng)基均為加富PDA培養(yǎng)基。1 L培養(yǎng)基含馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,磷酸二氫鉀1.5 g,硫酸鎂1 g,瓊脂18 g(液體培養(yǎng)基不加)。

1.2 試驗(yàn)預(yù)處理

1.2.1 菌液稀釋濃度的確定 將活化培養(yǎng)15 d的菌株用打孔器從平板取面積為0.25 cm2的菌量至裝液量250 mL的500 mL搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d(培養(yǎng)條件:恒溫18 ℃,150 r/min),將培養(yǎng)15 d的液體培養(yǎng)菌絲體連同培養(yǎng)基放置在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?使菌絲體斷裂,再用經(jīng)無(wú)菌水潤(rùn)洗的4層無(wú)菌紗布將培養(yǎng)基等雜質(zhì)過(guò)濾掉[33]。吸取50 mL菌絲體懸濁液,搖勻,濃度記為1,用無(wú)菌水依次稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的菌液(體積均為10 mL),取各稀釋度10 mL菌液涂布平板,每個(gè)平板3個(gè)重復(fù),18 ℃培養(yǎng)10 d,觀察培養(yǎng)皿上菌落的生長(zhǎng)情況,以菌落密度鋪滿平板的80%確定最佳的菌絲體懸浮液,稀釋濃度為10-3。

1.2.2 紫外強(qiáng)度與距離的確定 用功率為30 W紫外燈(λ=220 nm),預(yù)熱20 min穩(wěn)定波長(zhǎng),在13、27、39、50、62 cm處用HPL紫外輻射傳感器測(cè)定紫外強(qiáng)度值,作紫外強(qiáng)度和距離的回歸曲線(表1)。吸取10 mL稀釋10-3的菌液放入滅菌培養(yǎng)皿底部,對(duì)菌絲體進(jìn)行誘變?？紤]到紫外燈管產(chǎn)熱加速菌絲體懸濁液水分蒸發(fā),因此選擇距離紫外燈20、25、30、35、40、45 cm的距離輻射誘變30 s,每個(gè)水平做3次重復(fù),各距離吸取10 mL涂布于培養(yǎng)基平板上,置恒溫培養(yǎng)箱中18 ℃培養(yǎng)15 d,并以未經(jīng)紫外線處理的10-3菌絲體懸濁液涂布培養(yǎng)基作對(duì)照,待對(duì)照平板上菌落鋪滿平板80%停止培養(yǎng)。

表1 UVC誘變與代謝物回歸方程Table 1 UVC mutagenesis and regression equation of metabolites

致死率=[(未紫外誘變的菌落數(shù)-紫外誘變后的菌落數(shù))/未紫外誘變的菌落數(shù)]×100%

(1)

正突變率=[紫外誘變后的菌落數(shù)/未紫外誘變的菌落數(shù)]×100%

(2)

從表2可知,在照射距離為30 cm處致死率和正突變率較好。

表2 誘變距離與正突變率和致死率Table 2 Mutation distance and positive mutation rate and mortality diameter

1.2.3 紫外誘變時(shí)間的確定 吸取10 mL稀釋10-3的菌液放入到滅菌培養(yǎng)皿底部,對(duì)菌絲體進(jìn)行誘變。分別于30 cm處照射20、40、60、80、100、120、140 s,每個(gè)水平3次重復(fù),測(cè)定正突變率、致死率與輻射時(shí)間的回歸曲線(表1)。各照射時(shí)間吸取10 mL涂布于培養(yǎng)基平板上,置恒溫培養(yǎng)箱中18 ℃培養(yǎng)15 d,并以未經(jīng)紫外處理的菌懸液涂布培養(yǎng)基作對(duì)照,待平板上長(zhǎng)出一定菌落,計(jì)算致死率與正突變率。比較正突變變率和致死率,40 s時(shí)致死率和正突變率較好[34](表3)。

表3 照射時(shí)間與正突變率和致死率Table 3 Irradiation time and positive mutation rate and fatality rate

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的篩選 從誘變菌株中初步選擇表型較優(yōu)20株菌株保種(表4),并依次命名為YS-A、YS-B、YS-C、YS-D、YS-E、YS-F、YS-G、YS-H、YS-I、YS-J、YS-K、YS-L、YS-M、YS-N、YS-O、YS-P、YS-Q、YS-R、YS-S、YS-T。首先,采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法分別對(duì)21株菌株的3個(gè)生物量指標(biāo)(干重、鮮重、菌落生長(zhǎng)速率)和4個(gè)代謝物質(zhì)指標(biāo)(多糖、粗蛋白、甘露醇、腺苷)進(jìn)行評(píng)價(jià),篩選出具有最優(yōu)生物量產(chǎn)量的菌株和最優(yōu)代謝物含量的菌株,最后將生物量、代謝物指標(biāo)視為一個(gè)整體進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),篩選出生物量產(chǎn)量和代謝物產(chǎn)量綜合最優(yōu)的菌株[35]。各指標(biāo)測(cè)定值相差較大,不易比較,須進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[36]。采用均值化法先分析各指標(biāo)之間的相關(guān)性(表6),正相關(guān)用各測(cè)定值除以參考數(shù)列相應(yīng)的期望指標(biāo),負(fù)相關(guān)取其倒數(shù)得到均值化新數(shù)列Mi。選擇干重、鮮重、菌落生長(zhǎng)速率、多糖、粗蛋白、甘露醇、腺苷進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),不同菌株用N表示,指標(biāo)用k表示,各菌株在指標(biāo)處的值構(gòu)成比較數(shù)列Nk,選擇各指標(biāo)最大值組成母序列N0。使用以下公式計(jì)算關(guān)聯(lián)度系數(shù)、等權(quán)關(guān)聯(lián)度、權(quán)重系數(shù)及加權(quán)關(guān)聯(lián)度。ρ為分辨系數(shù),一般取ρ=0.5。

表4 菌落表面質(zhì)地Table 4 Surface texture of colonies

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

式中,xi(k)為原始數(shù)據(jù),x0(k)為母序列,min(i)min|x0(k)-x1(k)|為2個(gè)層次的最小差;max(i)max|x0(k)-xi(k)|為2個(gè)層次的最大差;Mi為原始數(shù)據(jù)均值化后的數(shù)列值;ξi(k)為關(guān)聯(lián)度系數(shù);γi為等權(quán)關(guān)聯(lián)度;ωi為權(quán)重系數(shù);γi′為加權(quán)關(guān)聯(lián)度。

1.3.2 鮮重、干重的測(cè)定 各菌株用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d將菌落帶培養(yǎng)基一起取下,60 ℃熱水洗去培養(yǎng)基得到干凈完整的菌落,濾紙吸去菌落表面殘留水分,稱取菌落鮮重。50 ℃烘干20 min稱量1次,直至質(zhì)量不再變化為止,以最后一次記錄結(jié)果為菌落干重。以上試驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)平行,記錄鮮重、干重、菌落生長(zhǎng)速率。

1.3.3 菌絲體代謝物測(cè)定 采用硫酸苯酚法測(cè)定多糖含量[37-39];采用Bradford蛋白濃度試劑盒法測(cè)定粗蛋白含量;采用高錳酸鉀比色法測(cè)定甘露醇含量[40];采用高效液相色譜法測(cè)定腺苷含量[41-42],分別得到回歸方程(表1)。

1.3.4 誘變菌株的綜合評(píng)價(jià)與遺傳特性分析 由于經(jīng)過(guò)紫外誘變的菌株會(huì)在自身的修復(fù)作用下產(chǎn)生回復(fù)突變,需要分析菌株的遺傳穩(wěn)定性,對(duì)得到的選育菌株進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵10代的傳代試驗(yàn)(135 r/min、18 ℃培養(yǎng)15 d,4000 r/min離心),評(píng)價(jià)選育菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2019進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的錄入及表格制作,采用SPSS 23.0對(duì)菌株各指標(biāo)進(jìn)行多重比較,結(jié)果以Mean±SE表示,顯著性水平為P<0.05,最后分析各指標(biāo)之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 21株菌株生物量及代謝物含量的比較

YS-A菌株菌絲體干重、鮮重、菌落生長(zhǎng)速率、腺苷均最優(yōu)于其它菌株(P<0.05),其菌絲體干重、鮮重、菌落生長(zhǎng)速率、腺苷產(chǎn)量較YS-01分別增長(zhǎng)21.94%、30.36%、85.83%、51.57%;可用于以菌絲體干重、鮮重、菌落生長(zhǎng)速率和腺苷產(chǎn)量為目的的菌株選育。YS-B菌株腺苷、粗蛋白和甘露醇含量均優(yōu)于其它菌株(P<0.05),其腺苷、粗蛋白和甘露醇含量較YS-01分別增長(zhǎng)52.61%、83.60%、48.52%;可用于以腺苷、粗蛋白和甘露醇產(chǎn)量為目的的菌株選育。YS-C的多糖含量最優(yōu)(P<0.05),較YS-01增長(zhǎng)53.61%,可用于以多糖產(chǎn)量為目的的菌株選育(表5)。

表5 菌株生物量及代謝物含量的比較Table 5 Comparison of biomass and metabolite content of strains

續(xù)表5 Continuedtable 5

2.2 21株菌株生物量及代謝產(chǎn)物的相關(guān)性分析

21株菌株的生長(zhǎng)速率、鮮重、腺苷、甘露醇與干重呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),表明干重越重的菌株其生長(zhǎng)速率、鮮重、腺苷和甘露醇含量越高;鮮重、腺苷、甘露醇與生長(zhǎng)速率呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),表明生長(zhǎng)速率越快的菌株其鮮重、腺苷和甘露醇含量越高;腺苷、甘露醇、粗蛋白與鮮重呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),表明鮮重越重的菌株其腺苷、甘露醇和粗蛋白含量越高;甘露醇與多糖呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),表明多糖越多的菌株其甘露醇含量越高;甘露醇、粗蛋白與腺苷呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),表明腺苷越多的菌株其甘露醇和粗蛋白含量越高;粗蛋白與甘露醇呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),表明甘露醇含量越高的菌株其粗蛋白含量也較高(表6)。

表6 各指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of each index

2.3 21株菌株生物量產(chǎn)量的灰色關(guān)聯(lián)度評(píng)價(jià)

在灰色關(guān)聯(lián)分析中,關(guān)聯(lián)度大小反映了各因子重要性的差異,關(guān)聯(lián)度越大該因子的作用越大。該關(guān)聯(lián)度為等權(quán)關(guān)聯(lián)度,即假定各種指標(biāo)都同等重要,對(duì)指標(biāo)重要性進(jìn)行評(píng)價(jià)。但菌絲體中各指標(biāo)對(duì)綜合評(píng)價(jià)的貢獻(xiàn)率不同,為了更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)各菌株的優(yōu)劣,需采用加權(quán)關(guān)聯(lián)度,將求得的各關(guān)聯(lián)系數(shù)應(yīng)用公式(4)求出對(duì)應(yīng)的權(quán)重,賦予各指標(biāo)不同的權(quán)重,用公式(5)計(jì)算加權(quán)關(guān)聯(lián)度。等權(quán)關(guān)聯(lián)度排序和加權(quán)關(guān)聯(lián)度排序結(jié)果一致,其結(jié)果更能真實(shí)反應(yīng)各個(gè)菌株品質(zhì)的優(yōu)劣。YS-A菌株生物量綜合評(píng)價(jià)最好(表7),表明YS-A具有最高的生物量產(chǎn)量,可用于以生物量產(chǎn)量為目的的菌株選育。

表7 各菌株生物量指標(biāo)關(guān)聯(lián)度及排序Table 7 Correlation and ranking of biomass indexes of strains

2.4 21株菌株代謝物產(chǎn)量的灰色關(guān)聯(lián)度評(píng)價(jià)

21株菌株中,采用灰色關(guān)聯(lián)度法對(duì)其代謝物含量綜合評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),等權(quán)排序和加權(quán)排序結(jié)果基本相似,表明試驗(yàn)結(jié)果可信度高;其中YS-B菌株綜合表現(xiàn)最優(yōu)(表8),表明YS-B代謝物產(chǎn)量最高,可用于以代謝物產(chǎn)量為目的的菌株。

表8 各菌株代謝物指標(biāo)關(guān)聯(lián)度及排序Table 8 Correlation and ranking of metabolites indexes of strains

續(xù)表8 Continuedtable 8

2.5 21株菌株生物量及代謝物含量的灰色關(guān)聯(lián)度綜合評(píng)價(jià)

菌株指標(biāo)綜合關(guān)聯(lián)度的大小順序?yàn)?粗蛋白>多糖>干重>鮮重>腺苷>甘露醇>生長(zhǎng)速率(表9)。YS-B菌株的綜合評(píng)價(jià)最好,表明YS-B菌株的綜合產(chǎn)量最高,可用于以綜合產(chǎn)量為目的的菌株選育。YS-A、YS-C、YS-D、YS-H、YS-E綜合評(píng)價(jià)較好,其余菌株誘變效果綜合評(píng)價(jià)一般,但均優(yōu)于YS-01(表10)。

表9 各指標(biāo)關(guān)聯(lián)系數(shù)及排序Table 9 Correlation coefficient and ranking of index

表10 各菌株關(guān)聯(lián)系數(shù)及排序Table 10 Correlation coefficient and sequencing of strains

續(xù)表10 Continuedtable 10

2.6 YS-C、YS-A和YS-B的遺傳穩(wěn)定性分析

10代傳代培養(yǎng)過(guò)程中YS-C菌株的多糖、YS-A菌株的干重、鮮重、菌絲體生長(zhǎng)速率均無(wú)顯著變化(P>0.05),且顯著高于YS-01菌株(P<0.05),表明YS-C菌株10代內(nèi)多糖產(chǎn)量遺傳穩(wěn)定性良好(表11),YS-A菌株10代內(nèi)干重、鮮重、菌絲體生長(zhǎng)速率遺傳穩(wěn)定性良好(表12)。

表11 YS-C多糖10代傳代試驗(yàn)Table 11 Analysis of YS-C Polysaccharose 10 generations passage test

表12 YS-A生物量10代傳代試驗(yàn)Table 12 Analysis of YS-A biomass 10 generations passage test

YS-B菌株10代傳代培養(yǎng)過(guò)程中菌絲體生長(zhǎng)速率和甘露醇無(wú)顯著變化(P>0.05),且顯著高于YS-01菌株(P<0.05),菌絲體生長(zhǎng)速率和甘露醇產(chǎn)量遺傳穩(wěn)定性良好;干重、鮮重和腺苷在第10代顯著降低(P<0.05),干重、鮮重和腺苷9代內(nèi)遺傳較穩(wěn)定;多糖和粗蛋白在第9代顯著降低(P<0.05),多糖和粗蛋白8代內(nèi)遺傳較為穩(wěn)定(表13)。

3 討 論

變異是一切生物的共有屬性,蝙蝠蛾擬青霉也是如此,由于其全基因組相對(duì)較小,在人工保種和繼代傳代培養(yǎng)中,菌株發(fā)生變異的可能性更大[43]。當(dāng)這種變異促使菌株的生物量產(chǎn)量、代謝物產(chǎn)量增加時(shí),認(rèn)為發(fā)生了正突變,而當(dāng)菌株的表觀屬性、形態(tài)特征趨于變差時(shí)則是發(fā)生了負(fù)突變。菌株突變是由堿基變化引起,如堿基對(duì)的替換、缺失、基因漂移等,而堿基突變完全隨機(jī),試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)正突變的概率遠(yuǎn)小于負(fù)突變[44],本試驗(yàn)從100個(gè)培養(yǎng)皿中也僅僅篩選出3株可以用于具有較好生產(chǎn)性能的菌株。因此,誘變條件是提高菌株正突變率的關(guān)鍵因素之一。紫外誘變是選育高產(chǎn)量真菌的有效途徑之一,在綠僵菌、桑黃產(chǎn)業(yè)中一直被使用。韋云[45]對(duì)綠僵菌的紫外誘變?cè)囼?yàn)發(fā)現(xiàn),誘變時(shí)間為40 min時(shí)具有最高的代謝活性物產(chǎn)量;曲德輝[46]對(duì)桑黃進(jìn)行紫外輻射時(shí),在紫外燈功率15 W、照射距離20 cm、照射時(shí)間8 s條件下,桑黃的生物量、多糖和黃酮含量均顯著增加。而本試驗(yàn)在之前研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步完善,分別對(duì)紫外種類、紫外燈光功率、照射距離、紫外強(qiáng)度進(jìn)行了更多研究,結(jié)果顯示蝙蝠蛾擬青霉最佳紫外誘變劑量為:紫外燈光功率30 W、照射距離30 cm、照射時(shí)間40 s、紫外線種類UVC。這也是由于青藏高原高紫外輻射的特殊地理位置,蝙蝠蛾擬青霉在與環(huán)境的協(xié)同進(jìn)化中獲得了更好的紫外抗性,因此本研究的紫外誘變劑量更高。在此劑量下誘變菌株YS-A較YS-01菌株的干重、鮮重、菌落生長(zhǎng)速率、腺苷含量分別提升17.99%、23.29%、46.19%、34.18%,YS-B較YS-01菌株的腺苷、粗蛋白和甘露醇含量分別提升34.47%、45.53%、32.67%,YS-C的多糖含量提升34.9%。

本研究中,照射距離與菌落正突變率呈先增大后減小的關(guān)系,在30 cm處正突變率最大,誘變菌株菌落生長(zhǎng)速率均優(yōu)于出發(fā)菌株。與王宏民等[47]對(duì)玫煙色擬青霉 Pf9606 菌株的紫外誘變?cè)囼?yàn)結(jié)果相似,照射距離在一定范圍內(nèi),隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng),菌落生長(zhǎng)速率明顯降低。紫外照射時(shí)間也會(huì)顯著影響菌落的誘變生長(zhǎng),李春麗等[34]對(duì)蛹蟲草的紫外誘變顯示,隨著紫外照射時(shí)間增加,菌落致死率升高;本研究也發(fā)現(xiàn),照射時(shí)間在40 s左右最佳,短時(shí)間處理正突變率偏低,較長(zhǎng)時(shí)間處理菌落的死亡率偏高。照射時(shí)間在0～40 s,照射時(shí)間與蝙蝠蛾擬青霉死亡率曲線變化劇烈,表明蝙蝠蛾擬青霉對(duì)這一劑量范圍較敏感,在這一范圍內(nèi)誘變處理可能使之發(fā)生較大變異,40 s后死亡率趨于平緩[48-50],周麗紅等[51]研究也發(fā)現(xiàn),食用菌致死率在50%時(shí)可保證菌體發(fā)生突變并偏向正向突變,而致死率在70%～80%時(shí),菌體發(fā)生正向突變的幾率高等類似結(jié)論。

4 結(jié) 論

菌絲體干重、鮮重、生長(zhǎng)速率和腺苷最優(yōu)菌株均為YS-A;多糖產(chǎn)量最高的菌株為YS-C;腺苷、粗蛋白、甘露醇產(chǎn)量最高的菌株均為YS-B。生物量產(chǎn)量最高的菌株為YS-A,代謝物產(chǎn)量和綜合產(chǎn)量最高的菌株均為YS-B。YS-A菌株10代內(nèi)的干重、鮮重、菌絲體生長(zhǎng)速率遺傳穩(wěn)定性良好;YS-C菌株10代內(nèi)的多糖產(chǎn)量遺傳穩(wěn)定性良好。因此,YS-A菌株可用于以菌絲體干重、鮮重、生長(zhǎng)速率、腺苷和生物量產(chǎn)量為目的的菌株;YS-C可用于以多糖產(chǎn)量為目的的菌株;YS-B可用于以腺苷、粗蛋白、甘露醇、代謝物產(chǎn)量、綜合產(chǎn)量為目的的菌株。