王瑞鵬, 劉 茜, 楊智強, 張博昆, 黃 姿, 牛向麗

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

類胡蘿卜素是植物體重要的色素次生代謝產(chǎn)物。在植物類胡蘿卜素的生物合成途徑中,兩分子的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)在八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase,PSY)的催化下形成八氫番茄紅素,后者在八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase,PDS)、ξ-胡蘿卜素脫氫酶(ξ-carotene desaturase,ZDS)、類胡蘿卜素異構酶(carotenoid isomerase,CRTISO)等的作用下脫氫、異構形成反式番茄紅素。番茄紅素在不同環(huán)化酶(lycopene cyclase,LCY)作用下,分別生成α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素,這是類胡蘿卜素合成途徑中的一個關鍵分支點。此后兩者經(jīng)過連續(xù)羥化分別形成不同的含氧類胡蘿卜素(Xanthophylls)[1]。這種羥化反應包括由細胞色素P450家族類胡蘿卜素羥化酶(cytochrome P450-type monooxygenase 97,CYP97)和亞鐵血紅素依賴型β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotenoid hydroxylase,CHYB)催化的2種路徑,兩者同屬于類胡蘿卜素羥化酶家族[2]。其中,CYP97家族負責具有ε環(huán)的α-胡蘿卜素的羥基化,簡稱為CHYE,而具有β環(huán)的β-胡蘿卜素的羥基化則由CHYB家族完成,通過羥基化最終分別合成葉黃素(Lutein)、玉米黃素(Zeaxanthin)等重要植物色素,與番茄紅素等共同組成植物的天然類胡蘿卜素功能成分[3]。植物中類胡蘿卜素的生物合成途徑保守存在,但不同植物物種在各自生存環(huán)境的適應進化過程中,由于相關合成途徑基因及其表達水平的差異最終積累不同含量的色素組分,呈現(xiàn)豐富多變的色澤。

萬壽菊(TageteserectaL.)是菊科萬壽菊屬草本植物,原產(chǎn)于墨西哥,因其花形大、色彩絢麗、易于栽培,常作為園藝花卉在世界各地栽培種植[4]。由于萬壽菊花中富含類胡蘿卜素,尤其是葉黃素,而這些色素成分是維持人體健康所必需的營養(yǎng)素,具有抗氧化、防止退行性視力疾病、抗癌、抗輻射等重要功能[5-6],但在人體內(nèi)無法合成,必須從膳食中攝取或補充[7]。葉黃素是類胡蘿卜素合成途徑中α分支的終產(chǎn)物,作為含氧類胡蘿卜素家族的重要成員之一,既有多種生物活性又具有增色作用,因此在醫(yī)藥、化妝品、飼料等領域被廣泛應用[8]。富含葉黃素的萬壽菊花也因此成為用于提取天然色素成分的主要植物資源,但目前對其類胡蘿卜素合成途徑基因的克隆和分析報道較少。本課題組通過萬壽菊轉(zhuǎn)錄組高通量測序獲得了萬壽菊CHYE(TeCHYE)基因的組裝推測序列,在本文中進一步從花中克隆分離該基因,通過生物信息學分析以及在萬壽菊葉片和不同發(fā)育時期花組織中的表達水平測定,對其功能進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料

萬壽菊(TageteserectaL.)栽培品種‘Juwang’種植于合肥工業(yè)大學植物培養(yǎng)室。分別采集生長約70 d萬壽菊植株的葉片(L)、花蕾(F1)、未盛開花(F2)、盛開后3 d的花(F3)組織,用于RNA提取、葉黃素質(zhì)量比測定。

1.1.2 試劑藥品

TRIzol購于Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒均購于北京全式金生物技術有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒均購于天根生化科技有限公司;引物設計采用Primer Premier 5.0軟件,引物合成和測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成;其他試劑均為國外原裝或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 載體與菌株

pEASY-Blunt克隆載體購于北京全式金生物技術有限公司;大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α由本實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 萬壽菊RNA提取與cDNA合成

將采集的萬壽菊組織樣品液氮研磨,利用TRIzol提取總RNA,并以Nanodrop 2000超微量分光光度計檢測RNA的純度、濃度;然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將所提取RNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA,保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 萬壽菊TeCHYE基因的擴增

基于本課題組萬壽菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),獲得萬壽菊TeCHYE基因組裝序列,并據(jù)此序列設計的基因克隆引物CHYEF/R見表1所列。

表1 本實驗所用引物

以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,利用巢式PCR對TeCHYE基因進行擴增。PCR反應程序如下:

預變性(98 ℃、2 min);變性(98 ℃、10 s), 退火(55 ℃、20 s),延伸(72 ℃、90 s),重復30個循環(huán);最后延伸(72 ℃、5 min)。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測擴增產(chǎn)物。

1.2.3TeCHYE基因的克隆

利用DNA純化試劑盒對擴增產(chǎn)物進行純化,然后將純化后擴增產(chǎn)物與克隆載體pEASY-Blunt進行連接。連接產(chǎn)物通過熱休克法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞,涂布于含有卡那霉素的固體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)16 h。然后挑取單克隆進行培養(yǎng),以引物CHYEF2、CHYER2進行菌落PCR鑒定。取陽性克隆菌液進行質(zhì)粒提取、送樣測序,并比對測序結果。

1.2.4TeCHYE基因生物信息學分析

利用蛋白組學分析平臺(ExPASy,https://www.expasy.org/)ProtParam和ProtScale對TeCHYE編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析,使用同源建模方法(SWISS-MODEL)對TeCHYE蛋白三維結構進行預測,并運用RasWin軟件對其進行注釋優(yōu)化。將TeCHYE基因序列在美國國家生物技術信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)數(shù)據(jù)庫進行對比,利用MEGA 7.0軟件,使用鄰接法(Neighbor Joining)構建進化樹進行進化分析,并對保守性較高的蛋白用Espript 3.0(https://espript.ibcp.fr/)在線軟件進行氨基酸序列比對分析。

1.2.5TeCHYE基因表達分析

以萬壽菊‘Juwang’的葉片和不同發(fā)育階段花組織樣品提取RNA、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。依據(jù)TeCHYE克隆測序結果設計定量檢測引物CHYERTF/R(分別位于編碼序列第1 017堿基和第1 124堿基處),內(nèi)參為萬壽菊TIF6基因[9],相應引物TIF6F/R序列見表1,對其進行實時熒光定量PCR,該反應體系(20 μL)如下: 2×PerfectStart Green qPCR SuperMix 10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,模板cDNA(1∶30稀釋)4 μL,無菌雙蒸水5.2 μL。擴增程序(兩步法)如下:94 ℃、30 s;94 ℃、5 s,60 ℃、30 s,40個循環(huán)。在Bio-Rad CFX96 Real-time PCR系統(tǒng)運行,利用2-ΔΔCt方法對實時熒光定量PCR 結果進行分析。

1.2.6 萬壽菊不同組織葉黃素質(zhì)量比測定

將萬壽菊葉、花組織采樣后45 ℃烘干。置于研缽中加入液氮迅速研磨成粉末。稱取0.1 g置于試管中,先后加入0.1% BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)-乙醇0.8 mL、50% KOH 0.2 mL,渦旋振蕩混勻,然后50 ℃水浴鍋水浴1 h,每隔20 min渦旋1次。水浴完成待冷卻后,加入1 mL丙酮超聲提取1 h,吸取10 μL提取液濾液,利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法測定葉黃素質(zhì)量比。色譜條件如下:色譜柱Symmetry C18(5 μm,4.6 mm×250 mm);柱溫30 ℃;流動相為乙腈、二氯甲烷、甲醇,三者體積比為7∶2∶1;流速為1 mL/min;檢測波長[10]為445 nm 。根據(jù)標準曲線計算樣品中葉黃素的質(zhì)量比。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

本實驗所測得數(shù)據(jù)均采用SPSS 22軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結果分析

2.1 TeCHYE基因克隆結果分析

以萬壽菊花cDNA為模板,利用特異巢式PCR引物CHYEF/R對TeCHYE基因進行2輪擴增,將第2輪PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,結果如圖1a所示。圖1a中:M代表DNA Marker;1代表TeCHYE基因擴增產(chǎn)物。

由圖1a可知,本實驗獲得了與預期大小(1 656 bp)基本一致的目的條帶,且條帶清晰,沒有其他明顯的非特異擴增產(chǎn)物。將此擴增產(chǎn)物純化后與pEASY-Blunt克隆載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。

利用基因特異引物CHYEF2/R2對卡那霉素抗性平板上生長的單克隆進行PCR鑒定,結果如圖1b所示。

圖1 TeCHYE基因克隆載體的構建

圖1b中:M代表DNA Marker;1～4代表單克隆編號;+代表正對照,為TeCHYE基因擴增產(chǎn)物;-代表負對照,為pEASY-Blunt空載體擴增產(chǎn)物。

從圖1b可以看出,單克隆1～3可能連接有TeCHYE基因。然后將鑒定為陽性的單克隆進行測序驗證。測序結果表明,本研究獲得了萬壽菊TeCHYE基因全長編碼序列,其與轉(zhuǎn)錄組組裝序列僅有少數(shù)堿基的差異,進一步說明組裝結果較為準確。

2.2 TeCHYE基因生物信息學和表達分析結果

通過蛋白組學分析平臺(ExPASy)對TeCHYE編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析。分析結果顯示,TeCHYE含有552個氨基酸,相對分子質(zhì)量為62 125.21;理論等電點為6.62;不穩(wěn)定系數(shù)為35.79,屬于穩(wěn)定蛋白;親水性平均值為-0.174,屬于親水性蛋白。

通過同源建模方法進一步對TeCHYE的三級結構進行預測,并采用軟件優(yōu)化模型,所具有的α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角等結構如圖2所示。圖2中:粉色表示α螺旋;黃色表示β折疊;淡藍色表示轉(zhuǎn)角;白色表示其他結構;方框標注為亞鐵血紅素的識別結合。

圖2 TeCHYE蛋白三級結構預測

利用植物CHYE基因序列所構建的系統(tǒng)進化樹如圖3所示。圖3中:Te(Tageteserecta,萬壽菊);Ha(Helianthusannuus,向日葵XM022130222.2);Cc(Cynaracardunculus,大薊XM025127352.1);Ls(Lactucasativa,萵苣XM02390889 6.1);Cm(Chrysanthemummorifolium,杭菊KX85384 9.1);Cs(Cucumissativus,黃瓜XM 004143239.3);Ps(Papaversomniferum,罌粟XM026562158.1);Nt(Nicotianatabacum,煙草XM016580209.1);Sl(Solanumlycopersicum,番茄NM001247129.2);Rc(Ricinuscommunis,蓖麻XM015719409.2);Jc(Jatrophacurcas,麻風樹XM020682561.2);Hb(Heveabrasiliensis,橡膠樹XM0 21821728.1);Pm(Prunusmume,梅花XM008243131.1);Pa(Prunusavium,甜櫻桃XM021947619.1);Zj(Ziziphusjujuba,棗XM016043092.2);Cs(Cannabissativa,大麻XM030652736.1);Eg(Eucalyptusgrandis,巨按XM010 052026.3);Bo(Bixaorellana,紅木KT359009.1);Cs(Crotonstellatopilosus,巴豆HG917436.1);Vr(Vitisriparia,河岸葡萄XM034837759.1);Vv(Vitisvinifera,釀酒葡萄XM019221707.1);Cq(Chenopodiumquinoa,藜麥XM021859450.1)。

圖3 TeCHYE基因系統(tǒng)進化分析

數(shù)據(jù)庫比對結果表明CHYE基因在植物中普遍存在,其中萬壽菊TeCHYE與藜麥(Chenopodiumquinoa)同源基因相似性最低,為73.66%,而與同科植物向日葵(Helianthusannuus)的同源性最高,為87.53%。與TeCHYE同源性較高的不同植物物種CHYE蛋白的氨基酸序列比對結果如圖4所示。

‘Juwang’葉片(L)以及不同發(fā)育時期(F1、F2、F3)的花組織如圖5a所示,對各組織中TeCHYE基因的表達水平進行實時熒光定量PCR檢測,結果如圖5b所示,圖5b中不同字母表示有顯著差異(P<0.05),下同。由圖5b可知,TeCHYE基因在葉片和各發(fā)育時期的花中均有表達,但在發(fā)育階段的未盛開花(F2)中表達水平最高。

圖4 不同植物的CHYE蛋白氨基酸序列比對

圖5 TeCHYE基因表達量分析

2.3 葉黃素質(zhì)量比分析

對上述萬壽菊組織中的葉黃素進行提取,利用HPLC方法對葉黃素質(zhì)量比進行檢測,結果如圖6所示。圖6中,箭頭所指為葉黃素色譜峰。由圖6可得萬壽菊‘Juwang’葉黃素質(zhì)量比如圖7所示,由圖7可知,萬壽菊葉片(L)、花蕾(F1)、未盛開花(F2)、盛開后3 d花(F3)中葉黃素質(zhì)量比分別為10.62、44.49、79.32、57.01 μg/g,不同發(fā)育階段花組織中葉黃素質(zhì)量比均明顯高于葉片,是葉片的5～10倍。萬壽菊花組織是合成積累葉黃素的主要部位,且隨著發(fā)育程度加深,花中葉黃素質(zhì)量比顯著增加,但在完全盛開后略有下降,表明在成熟后期葉黃素可能通過代謝途徑轉(zhuǎn)化為其他次生物質(zhì)。

圖6 葉黃素標準品和‘Juwang’樣品的HPLC譜圖

圖7 萬壽菊‘Juwang’葉黃素質(zhì)量比分析

3 討 論

萬壽菊顏色多樣,有明黃、橙黃、橘黃、橘紅,色彩深淺不一[11]。但無論顏色深淺,葉黃素均為萬壽菊花中主要色素成分,因此這種顏色差異主要取決于葉黃素的含量[12-13]。本實驗所選用橙色萬壽菊品種‘Juwang’,其花中葉黃素質(zhì)量比也顯著高于葉片,是合成積累以及用于天然葉黃素提取的組織。但目前對萬壽菊葉黃素合成途徑相關基因的克隆報道并不多,本文對催化α-胡蘿卜素形成葉黃素的α-胡蘿卜素ε環(huán)羥化酶基因TeCHYE進行了克隆,獲得其完整編碼序列。進化分析表明萬壽菊TeCHYE與同科植物向日葵HaCHYE同源性最高,也進一步說明進化分析的可信性。所預測TeCHYE編碼蛋白三級結構與擬南芥同源AtCYP97C1蛋白結構類似。有報道認為,AtCYP97C1主要定位于葉綠體膜,催化α-胡蘿卜素ε環(huán)和β環(huán)的羥基化,但對β-胡蘿卜素的β環(huán)僅有很低的催化活性[14-16]。當最佳底物α-胡蘿卜素耗盡時,植物才發(fā)揮β-胡蘿卜素羥化酶活性[17]。本文中所檢測萬壽菊TeCHYE基因的表達模式與相應組織中葉黃素質(zhì)量比也顯示相似趨勢,因此TeCHYE可能具有類似功能,催化葉黃素在萬壽菊花中的合成。在課題組前期的轉(zhuǎn)錄組深度測序分析中[9],CHYE在萬壽菊中只發(fā)現(xiàn)了本文所克隆的1個基因序列,不存在多個拷貝,考慮到萬壽菊花中葉黃素的高合成積累,TeCHYE基因可能在其中發(fā)揮重要作用。

已有研究表明,萬壽菊所合成葉黃素可以與脂肪酸(主要是飽和脂肪酸)結合,主要以葉黃素酯的形式存在[18]。在相同的光、熱條件下,葉黃素酯的穩(wěn)定性要優(yōu)于葉黃素[19]。此外,以葉黃素酯提取的天然色素成分也更有利于人體、飼養(yǎng)動物的吸收利用。而通過CHYE催化α-胡蘿卜素ε環(huán)引入羥基形成葉黃素,這種羥基化也為葉黃素進一步與脂肪酸形成葉黃素酯,在萬壽菊花組織中穩(wěn)定積累提供了條件。文獻[20]對牽?；ǖ难芯勘砻?通過CHYE羥基化促進葉黃素酯的積累是其花瓣呈色的重要原因。

綜上所述,本研究通過TeCHYE基因克隆與分析,為植物類胡蘿卜素合成途徑及可能的遺傳改良應用提供了新的基因資源。后續(xù)可以利用番茄等模式園藝作物進行遺傳轉(zhuǎn)化,通過分析過表達株系果實色素表型進一步驗證其功能并評估應用潛力。