付婉瑞,古再麗努爾·卡德?tīng)?何雅琦,馮穎

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科,上海 200040

肌少癥性肥胖(sarcopenic obesity, SO),即過(guò)度肥胖伴肌肉質(zhì)量或功能低下,在65歲及以上老年人群的患病率已高達(dá)11%[1],作為一種肥胖與肌少癥共存的疾病,兩者互為因果,且與多種慢性非傳染性疾病的高發(fā)有關(guān)。研究表明, SO是老年人衰弱、代謝紊亂、住院和死亡的獨(dú)立顯著的危險(xiǎn)因素[2]。焦亡(pyroptosis)是一種新近發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡方式,不同于細(xì)胞凋亡,其特征為細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性的破壞,以及細(xì)胞內(nèi)容物釋放激活的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)。肥胖和衰老可激活焦亡通路,后者在SO相關(guān)的全身性低度炎癥及眾多并發(fā)癥中扮演著重要的角色[3-4]。F框/WD-40域蛋白7(F-box and WD-40 domain protein 7, FBXW7)是一種擁有7串聯(lián)WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域的F-box蛋白,可直接識(shí)別并泛素化多種底物,作為腫瘤抑制因子得到了廣泛的研究。而近年來(lái)不少的研究發(fā)現(xiàn), FBXW7還可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝并發(fā)揮炎癥抑制作用[5-6]。由此,探究FBXW7對(duì)焦亡通路的調(diào)節(jié)作用,可為SO防治策略提供新思路。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器FBXW7過(guò)表達(dá)慢病毒及對(duì)照慢病毒載體(由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司構(gòu)建);胎牛血清(美國(guó)Gibco, 10091148);高糖DMEM培養(yǎng)基(中國(guó)思拓凡, SH30243.01);馬血清(中國(guó)美倫公司, MB2968);棕櫚酸鈉(美國(guó)sigma, P9767-5G); MG132(中國(guó)源葉公司, S42096); FBXW7抗體(美國(guó)Novus Biologicals, NBP2-50403);環(huán)己酰亞胺&ASC抗體(均購(gòu)自美國(guó)CST, 2112S&67824T);GSDMD抗體(英國(guó)Abcam, ab209845); FBX32抗體&NF-κB p65抗體(均購(gòu)自中國(guó)愛(ài)博泰克公司, A6825&A10609); SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(中國(guó)雅酶公司, PG212); CCK-8試劑盒、蘇木素與伊紅染色液、改良油紅O染色試劑盒、 RIPA、 GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、牛血清白蛋白、β-半乳糖苷酶染色試劑盒、 NLRP3抗體、 CASP1抗體、 P21抗體(均購(gòu)自中國(guó)碧云天公司,貨號(hào)分別為C0038、 C0107 &C0109、 C0158M、 P0013B、 AF1186、 A0208、 ST025、 C0602、 AF2155、 AF1681、 AF5252);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-tek);凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad);倒置常規(guī)顯微鏡(日本尼康);共聚焦顯微鏡(德國(guó)徠卡)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)小鼠C2C12細(xì)胞系(小鼠成肌細(xì)胞, FH0345)購(gòu)自上海富衡生物科技有限公司。C2C12細(xì)胞首先培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清, 1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基),當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%匯合度時(shí),更換為分化培養(yǎng)基(含2%馬血清, 1%青霉素-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d。

1.3細(xì)胞活力檢測(cè)CCK-8選用10%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA,不含脂肪酸與IgG)溶解棕櫚酸鈉(palmitate, PA),干預(yù)C2C12細(xì)胞24 h構(gòu)建SO細(xì)胞模型[7]。

篩選PA的工作濃度。96孔板中有提前接種細(xì)胞(5 000 cell/100 μL/孔)及無(wú)細(xì)胞的接種孔,每孔加入200 μL不同濃度PA溶液或?qū)φ誃SA溶液,干預(yù)24 h后進(jìn)行CCK-8測(cè)量：棄去舊培養(yǎng)基,每孔加入10% CCK-8溶液200 μL,繼續(xù)培養(yǎng)1 h,然后取出96孔板在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。細(xì)胞活力計(jì)算：細(xì)胞活力=[A(PA)-A(空白)]/[A(PA對(duì)照)-A(空白)]

A(PA)：具有細(xì)胞、 CCK-8溶液和PA溶液的孔的吸光度。

A(空白)：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度。

A(PA對(duì)照)：具有細(xì)胞、 CCK-8溶液和PA對(duì)照溶液的孔的吸光度。

1.4FBXW7過(guò)表達(dá)使用FBXW7過(guò)表達(dá)慢病毒(FBXW7)及對(duì)照慢病毒載體(CMV enhancer-MCS-3flag-polyA-EF1A-zsGreen-sv40-puromycin, FBXW7-vec)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞72 h后,使用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選已成功轉(zhuǎn)染慢病毒的C2C12細(xì)胞;再選用嘌呤霉素濃度遞減為工作濃度的1/2～1/4的培養(yǎng)基,繼續(xù)對(duì)轉(zhuǎn)染后的C2C12細(xì)胞進(jìn)行篩選和擴(kuò)增,收集穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FBXW7的C2C12細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5蘇木素伊紅(hematoxylinandeosin,HE)染色培養(yǎng)皿中先加4%多聚甲醛室溫固定15 min,再加蘇木素染色液染色5～10 min,然后用蒸餾水洗去多余的染料。隨后加鹽酸乙醇分化液分化約30 s,再用蒸餾水沖洗約10 min;加伊紅染色液染色30 s,再用70%乙醇洗滌2次后置于鏡下觀察、拍照。隨機(jī)拍攝6個(gè)視野,測(cè)量每個(gè)視野中30個(gè)肌管的直徑。

1.6油紅O(OilredO,ORO)染色C2C12細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定15 min后,取適量染色洗滌液覆蓋細(xì)胞約20 s后棄去;加適量油紅O染色10～20 min,棄去油紅O染色工作液后,再加染色洗滌液覆蓋細(xì)胞約30 s后棄去;用PBS漂洗細(xì)胞約20 s后棄去,再加入新的PBS置于鏡下觀察、拍照。

1.7細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)染色培養(yǎng)皿中加入β-gal染色固定液室溫固定15 min,加PBS潤(rùn)洗細(xì)胞3次,每次3 min。棄去PBS,每孔加入適量染色工作液,置于37 ℃、無(wú)CO2恒溫箱過(guò)夜,然后置于鏡下觀察、拍照。

1.8乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)釋放實(shí)驗(yàn)在“樣品最大酶活性對(duì)照孔”中加入10%的LDH釋放試劑,繼續(xù)培養(yǎng)1 h。然后取各處理孔上清液, 400 g離心5 min,轉(zhuǎn)移上清至新的96孔板中。按照說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備適量INT溶液(1X),然后按照乳酸溶液： INT溶液(1X)∶酶溶液=1∶1∶1配制LDH檢測(cè)工作液。在96孔板各孔中分別加入60 μL LDH檢測(cè)工作液及120 μL樣品,混勻室溫避光孵育30 min。然后在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。LDH相對(duì)釋放量(%)=100×(處理樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性孔的吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度)。

1.9免疫熒光使用4%多聚甲醛室溫固定C2C12細(xì)胞15 min,加入免疫染色封閉液,封閉約1 h。加配制好的FBXW7一抗溶液(1∶100)及GSDMD一抗溶液(1∶100),于4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌后根據(jù)一抗種屬類(lèi)型選擇合適的免疫熒光二抗,避光孵育1 h,洗滌后加入適量DAPI染色液,染核15 min。最后加入一滴抗熒光淬滅劑,置于共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照。

1.10免疫印跡(westernblot,WB)收集干預(yù)后的C2C12細(xì)胞,加入配制好的細(xì)胞裂解液(RIPA,含磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑),置于冰上充分裂解后,收集細(xì)胞裂解液, 13 000 rpm, 4 ℃離心15 min。收集上清液,加入蛋白上樣緩沖液,置于干式金屬浴儀器中, 100 ℃加熱15 min使蛋白變性。配制10%的SDS-PAGE膠,加入蛋白樣品, 120 V電泳1.5 h,然后收集凝膠,覆蓋PVDF膜置于轉(zhuǎn)膜夾中, 300 mA,冰浴轉(zhuǎn)膜2 h。收集PVDF膜孵育一抗溶液： FBXW7(1∶1 000)、 GSDMD(1∶1 000)、 ASC(1∶1 000)、 NLRP3(1∶5 000)、 NF-kB p65(1∶1 000)、 CASP1(1∶5 000)、 FBX32(1∶1 000)、 GAPDH(1∶10 000), 4 ℃過(guò)夜,洗膜后加入二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L), 1∶2 000)室溫孵育1 h,漂洗后置于顯影儀中進(jìn)行曝光拍照。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。使用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。使用ImageJ軟件處理染色以及WB條帶圖像。2組比較時(shí)使用非配對(duì)雙尾Studentt檢驗(yàn),多組比較時(shí)使用單因素ANOVA 及Bonferroni 事后檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PA處理誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞脂質(zhì)積累及肌管萎縮衰老C2C12細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5 d后,可見(jiàn)C2C12細(xì)胞融合成多核肌管(圖1A)。參照文獻(xiàn)[7]及本研究CCK8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最終選用250 μM作為干預(yù)C2C12細(xì)胞的PA工作濃度(圖1B)。ORO染色結(jié)果顯示PA處理組肌管內(nèi)出現(xiàn)較多的脂滴,而B(niǎo)SA干預(yù)的對(duì)照組無(wú)脂滴聚集,說(shuō)明PA干預(yù)成功誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞發(fā)生了成脂分化(圖1C)。另外,PA干預(yù)使C2C12肌管直徑減小,說(shuō)明PA干預(yù)誘導(dǎo)肌管發(fā)生了萎縮(圖1D&E)。FBX32是肌肉萎縮的蛋白標(biāo)志物, WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PA干預(yù)組細(xì)胞中FBX32蛋白表達(dá)水平上升1.75倍,進(jìn)一步證明了肌萎縮的發(fā)生(圖1F&G)。SA-β-gal活性增加是細(xì)胞衰老的常見(jiàn)標(biāo)志,表現(xiàn)為藍(lán)綠色細(xì)胞數(shù)量增加。結(jié)果顯示, PA干預(yù)后的C2C12細(xì)胞SA-β-gal活性升高,即細(xì)胞老化程度上升(圖1H&I)。P21是細(xì)胞周期抑制因子,是細(xì)胞衰老標(biāo)志物。WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PA干預(yù)使細(xì)胞中P21蛋白表達(dá)水平上升1.68倍,進(jìn)一步證明了細(xì)胞衰老的發(fā)生(圖1J&K)。

2.2PA處理誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白降解半衰期延長(zhǎng)為了探究脂質(zhì)積累對(duì)焦亡通路蛋白穩(wěn)定性的影響,本研究檢測(cè)了PA干預(yù)C2C12細(xì)胞后焦亡相關(guān)蛋白的半衰期。環(huán)己酰亞胺(cycloheximide, CHX)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的抑制劑。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成被抑制后,蛋白質(zhì)水平會(huì)因?yàn)榉核鼗揎椪T導(dǎo)的蛋白酶體的蛋白分解作用下降。MG132是蛋白酶體抑制劑,可以抑制蛋白酶體的分解作用。WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, CHX干預(yù)后炎癥標(biāo)志物核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)P65亞基以及焦亡標(biāo)志蛋白核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3), 半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1, CASP1), 消皮素D(gasdermin D, GSDMD),和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)的蛋白含量明顯下降,但PA干預(yù)后,可見(jiàn)以上蛋白標(biāo)志物半衰期的明顯上升,表明PA可以明顯抑制蛋白質(zhì)的降解作用,這和MG132的干預(yù)效果類(lèi)似(圖2)。以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明PA引起炎癥及焦亡的原因可能與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)。

2.3PA處理降低C2C12細(xì)胞中FBXW7表達(dá)水平PA 干預(yù)在降低C2C12細(xì)胞中肌管直徑和增加脂質(zhì)積累的同時(shí),可使FBXW7表達(dá)量下降(圖3A-C),這說(shuō)明PA可能是通過(guò)降低FBXW7表達(dá)水平來(lái)調(diào)節(jié)SO表型。為了研究FBXW7在SO發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用,本研究采用慢病毒載體轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞來(lái)構(gòu)建過(guò)表達(dá)FBXW7的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株：熒光圖像顯示,慢病毒載體成功進(jìn)入C2C12細(xì)胞(圖3D);WB顯示,慢病毒成功介導(dǎo)了FBXW7在C2C12細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)(圖3E-F)。

注： A：不同培養(yǎng)階段C2C12細(xì)胞的HE染色; B：不同濃度PA干預(yù)C2C12細(xì)胞24 h后的細(xì)胞活力; C：工作濃度PA干預(yù)后肌管內(nèi)中脂質(zhì)積累(ORO染色); D&E.：工作濃度PA干預(yù)后肌管直徑變化(HE染色); F&G：工作濃度PA干預(yù)后FBX32表達(dá)水平變化。H& I：工作濃度PA干預(yù)后肌管老化程度變化(SA-β-gal染色); J&K：工作濃度PA干預(yù)后P21表達(dá)水平變化。與對(duì)照相比, ns無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,***P< 0.001, ****P< 0.0001。圖1 C2C12細(xì)胞的成熟分化, PA干預(yù)誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞的成脂分化及肌管萎縮

注： WB分析CHX(10 μM)、或CHX + PA、或CHX + MG132(10 μM) 處理后C2C12細(xì)胞中焦亡標(biāo)志物： NLRP3(圖A)、 GSDMD(圖B)、 CASP1(圖C)、ASC(圖D),以及炎癥標(biāo)志物(P65,圖E)的蛋白表達(dá)量。在相同時(shí)間點(diǎn), CHX vs CHX+PA或CHX vs CHX+MG132, *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001。圖2 PA干預(yù)使炎癥及焦亡的蛋白標(biāo)志物穩(wěn)定性增加

注： A： PA及BSA干預(yù)的FBXW7共聚焦圖像(紅色, FBXW7;藍(lán)色,細(xì)胞核); B&C：工作濃度PA干預(yù)C2C12 細(xì)胞24 h后FBXW7表達(dá)水平; D-F：構(gòu)建慢病毒轉(zhuǎn)染的FBXW7過(guò)表達(dá)C2C12細(xì)胞株(共聚焦顯像, WB)。與對(duì)照相比, ***P< 0.001, ****P< 0.0001。圖3 PA干預(yù)FBXW7表達(dá)與FBXW7穩(wěn)定過(guò)表達(dá)C2C12細(xì)胞株

2.4FBXW7過(guò)表達(dá)改善PA干預(yù)誘導(dǎo)的C2C12肌管萎縮及焦亡使用PA干預(yù)過(guò)表達(dá)FBXW7的C2C12細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)FBXW7過(guò)表達(dá)能改善PA處理誘導(dǎo)的肌管萎縮(圖4A&B)。焦亡的特征是細(xì)胞膜完整性喪失和胞質(zhì)LDH的釋放,因此測(cè)量LDH釋放量可以反映細(xì)胞焦亡情況。LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,FBXW7過(guò)表達(dá)可抑制PA誘導(dǎo)LDH釋放,說(shuō)明FBXW7可以改善PA誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞焦亡(圖4C)。WB結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)PA干預(yù)可以誘導(dǎo)肌萎縮標(biāo)志蛋白(FBX32)、炎癥標(biāo)志蛋白(P65)以及焦亡相關(guān)蛋白(ASC、 CASP1、 GSDMD、 NLRP3)上調(diào),而FBXW7的異位表達(dá)可以抑制PA誘導(dǎo)的上述效應(yīng)(圖4D-E)。

2.5FBXW7與GSDMD存在共定位關(guān)系FBXW7通過(guò)其Cdc4磷表位(Cdc4 phosphodegron, CPD, S/TPXXS/T/D/E)與各種磷酸化底物結(jié)合,隨后通過(guò)K48泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)底物的降解[8]。本研究分析了GSDMD及其同家族GSDME蛋白序列,發(fā)現(xiàn)其含有CPD基序,推測(cè)FBXW7可能通過(guò)與GSDMD的CPD基序結(jié)合調(diào)控蛋白穩(wěn)定性(圖5A)。在PA干預(yù)后,本研究對(duì)C2C12細(xì)胞中的GSDMD蛋白及FBXW7蛋白進(jìn)行了免疫熒光染色。結(jié)果顯示, FBXW7聚集于焦亡細(xì)胞的特征性水泡中(圖5B)。另外, FBXW7與GSDMD存在共定位關(guān)系,表明FBXW7可能與GSDMD直接結(jié)合發(fā)揮泛素化作用(圖5C)。

3 討論

肌少癥性肥胖,雖可見(jiàn)于任何年齡段的肥胖人群,但增齡過(guò)程中,伴隨骨骼肌質(zhì)量與功能的逐步下降而出現(xiàn)的體脂的相對(duì)或絕對(duì)增加,仍不容忽視。脂肪組織關(guān)聯(lián)性代謝紊亂而產(chǎn)生的負(fù)面影響,如氧化應(yīng)激、炎癥、胰島素抵抗等,可使肥胖獨(dú)立引起骨骼肌質(zhì)量和功能下降;肌少癥因能量消耗減少可直接促進(jìn)脂肪堆積;因此,肥胖和肌少癥可能會(huì)協(xié)同增強(qiáng)彼此的程度;此外,慢性非傳染性疾病及其并發(fā)癥、久坐少動(dòng)等不良生活方式,也會(huì)增加SO的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。有關(guān)SO定義、診斷的不斷更新及發(fā)病機(jī)制的探究,是SO治療的基石。

注： A&B： PA干預(yù)FBXW7過(guò)表達(dá)C2C12穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株24 h后肌管直徑變化(HE染色); C： PA干預(yù)FBXW7過(guò)表達(dá)C2C12穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株24 h后細(xì)胞外培養(yǎng)基中的LDH水平變化(LDH釋放實(shí)驗(yàn),按“最大酶活性孔”的LDH水平作歸一化); D-E： PA干預(yù)FBXW7過(guò)表達(dá)C2C12穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株24 h后FBX32、 ASC、 CASP1、 P65、 GSDMD、 NLRP3的表達(dá)水平(WB)與BSA組相比, *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001, ****P< 0.0001;與PA + FBXW7-vec組相比, #P< 0.05, ##P< 0.01, ###P< 0.001, ####P< 0.0001。圖4 FBXW7過(guò)表達(dá)抑制PA誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞肌管萎縮、 LDH釋放及焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)

SO發(fā)生機(jī)制中,增齡以及肥胖引起的炎癥和焦亡可能是骨骼肌萎縮和代謝失調(diào)的主要原因[9-11]。SO與炎癥關(guān)系密切。在肥胖小鼠骨骼肌中,可以觀察到肌萎縮和炎性細(xì)胞因子水平增加[9, 12- 13]。近期研究發(fā)現(xiàn),高脂血癥[14]或其他刺激可以誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體組裝,活化CASP1并且切割GSDMD蛋白,形成GSDMD-N插入細(xì)胞膜形成膜孔,促使細(xì)胞脹破,誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。因此,在肥胖以及肥胖相關(guān)炎性疾病中,焦亡通路以及相關(guān)蛋白的致病作用已經(jīng)為人所熟知,而且是治療的潛在靶點(diǎn)之一[15-16]。另一方面,在快速老化小鼠大腦以及自然衰老的老年大鼠骨髓中,NLRP3、CASP1以及GSDMD表達(dá)的明顯上升[17-18]。而在香煙煙霧誘導(dǎo)和地塞米松誘導(dǎo)的肌肉萎縮小鼠模型中,焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、 CASP1以及GSDMD等表達(dá)水平提高,而且抑制GSDMD表達(dá)可以改善小鼠骨骼肌萎縮[19-20]。在本研究中,PA處理的C2C12肌管中有脂滴形成,并伴隨肌管直徑縮小、細(xì)胞衰老、LDH釋放增加以及焦亡相關(guān)蛋白標(biāo)志物的上調(diào),表明焦亡參與了肥胖誘導(dǎo)肌萎縮的過(guò)程中。

注： A： GSDMD和GSDME中CPD結(jié)構(gòu)域的比對(duì); B： PA干預(yù)后明場(chǎng)以及FBXW7的免疫熒光圖像; C： PA干預(yù)后FBXW7與GSDMD的免疫熒光圖像(紅色, FBXW7;綠色, GSDMD; 藍(lán)色,細(xì)胞核)。圖5 FBXW7與GSDMD的共定位

焦亡相關(guān)蛋白的激活主要依賴(lài)于炎癥小體途徑,而蛋白的穩(wěn)定與降解主要依賴(lài)于不同的翻譯后修飾,如琥珀?；揎梉21],氧化修飾[22],以及泛素化修飾[23]。其中,泛素化修飾是調(diào)控蛋白穩(wěn)定性的主要途徑之一。線粒體泛素連接酶(mitochondrial ubiquitin ligase, MARCH5)是一種定位于線粒體的E3泛素連接酶。研究發(fā)現(xiàn),MARCH5上調(diào)可以抑制炎癥性心肌病中GSDMD的表達(dá),從而發(fā)揮保護(hù)心肌的作用[24]。另外,亞砷酸鈉可以抑制GSDMD的K48以及K63泛素化,導(dǎo)致GSDMD的積累,促使焦亡發(fā)生[23]。以上研究說(shuō)明,泛素化修飾是調(diào)節(jié)焦亡通路的重要方式。本研究發(fā)現(xiàn)PA可以延長(zhǎng)焦亡相關(guān)蛋白的半衰期,而且FBXW7過(guò)表達(dá)可以抑制以上過(guò)程,說(shuō)明泛素化調(diào)節(jié)在焦亡通路調(diào)控中起著重要作用。

FBXW7具有多種生物學(xué)功能,可以調(diào)控衰老[25], 脂肪生成[26-28], 以及炎癥信號(hào)通路[29-31]。在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中,敲除小鼠腸上皮中FBXW7會(huì)激活NF-κB信號(hào),導(dǎo)致促炎因子釋放[32]。在脊髓損傷小鼠模型中,促進(jìn)FBXW7表達(dá)可阻斷NF-κB信號(hào)的激活,下調(diào)腫瘤壞死因子α和白介素1β[33]。FBXW7通過(guò)其CPD基序發(fā)揮泛素化修飾作用。研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白δ(CCAAT/enhancer-binding protein δ, C/EBPδ)可以促進(jìn)衰老小鼠肌內(nèi)脂肪浸潤(rùn),從而引發(fā)肌少癥[34]。而C/EBPδ蛋白序列中存在CPD基序,因此FBXW7可以通過(guò)調(diào)節(jié)C/EBPδ蛋白的穩(wěn)定性使之降解[29]。目前, FBXW7與焦亡通路的關(guān)系尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)上調(diào)FBXW7表達(dá)水平可以抑制PA誘導(dǎo)的肌管萎縮、 LDH釋放、以及焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的升高;并且, FBXW7與GSDMD存在共定位關(guān)系,說(shuō)明FBXW7可能通過(guò)與GSDMD直接結(jié)合,調(diào)控其蛋白穩(wěn)定性,發(fā)揮調(diào)節(jié)SO中焦亡途徑的作用。但尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探究其具體的泛素化形式以及結(jié)合位點(diǎn),以及進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FBXW7對(duì)SO的調(diào)節(jié)作用。

總之,本研究結(jié)果表明, PA可以通過(guò)延長(zhǎng)焦亡相關(guān)蛋白的半衰期來(lái)提高細(xì)胞中的焦亡水平,而FBXW7是以上過(guò)程的抑制因子,其機(jī)制可能是通過(guò)泛素化修飾焦亡相關(guān)蛋白來(lái)改善肌細(xì)胞焦亡。因此, FBXW7在SO的焦亡調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,是治療SO的潛在靶點(diǎn)之一。