肖振明,楊浩,潘苗苗,王同堯,錢程朗,趙超,2

1. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部衛(wèi)健委重點實驗室,上海 200032; 2. 國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院),上海 200040

由于缺乏兒女陪伴,我國空巢老人更易缺乏與外界溝通交流,社會網(wǎng)絡(luò)縮小,社會隔離應(yīng)激(social isolation stress, SIS)水平顯著提升[1]。相關(guān)研究表明,社會隔離與抑郁[2]、虛弱[3]、心血管風(fēng)險[4]乃至死亡率[5]有關(guān),但社會隔離對老年肝臟健康的影響還缺乏研究。據(jù)報道,心理社會應(yīng)激可通過過度激活下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamic pituitary adrenal, HPA)軸并直接誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1, IL-1)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)等釋放而促進(jìn)肝臟炎癥[6]。因此,本研究通過老年小鼠的社會隔離模型觀察社會隔離對老年小鼠身體健康的影響,通過檢測該動物模型中血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平變化和肝臟差異表達(dá)基因,為社會隔離對老年肝臟健康的影響提供分子機(jī)制水平的理論依據(jù),為提高老年人生活質(zhì)量、促進(jìn)健康老齡化提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物老年小鼠： SPF級雌性C57BL6小鼠10只, 30月齡,體質(zhì)量(35.2±2.4)g;年輕小鼠： SPF級雌性C57BL6小鼠5只, 8周齡,體質(zhì)量(22.2±0.7)g。

實驗動物購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2021-0011],飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)實驗動物樓[SYXK(滬)2020-0032]。

所有動物實驗均經(jīng)過復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：20220627-001),按照實驗動物處理指南給予動物福利并進(jìn)行相關(guān)處理。

1.2主要試劑與儀器小鼠IL-1βELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)試劑盒(EK101B-96),小鼠TNF-αELISA試劑盒(EK282/4-96),小鼠IFN-γ高敏 ELISA試劑盒(EK280HS-96),小鼠IL-6 ELISA試劑盒(EK206/3-96),小鼠IL-10 ELISA試劑盒(EK210/4-96),購自上海聯(lián)科生物有限公司。微量移液器(美國Eppendrof公司);Synergy H1MF酶標(biāo)儀,購自美國BioTek公司。

1.3動物實驗分組小鼠予全價營養(yǎng)飼料,恒溫恒濕適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,采用數(shù)字表法將老年小鼠隨機(jī)分為2組：隔離組(n=5),隔離組老年小鼠在32 cm×18 cm×15 cm的不透明籠內(nèi)單籠隔離飼養(yǎng);同籠組(n=5),同籠組老年小鼠與年輕小鼠以1∶1的比例,每籠兩只在32 cm×18 cm×15 cm的籠中飼養(yǎng)。飼養(yǎng)及實驗期間2組動物均自由進(jìn)食飲水,并檢測其體重變化,每周記錄1次。4周后檢測老年小鼠的血清炎癥因子水平和肝臟基因轉(zhuǎn)錄。

1.4酶聯(lián)免疫吸附試驗麻醉小鼠后眼眶采血, 4 ℃靜置過夜后低溫離心,吸取上層血清分別用對應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素10(IL-10)和干擾素-γ(IFN-γ)水平。

1.5RNAseq法檢測小鼠肝臟差異表達(dá)基因解剖取老年小鼠肝臟并稱重記錄,凍存供指標(biāo)檢測。Trizol方法提取老年小鼠肝臟總RNA。Qubit(美國Thermo公司)精確定量RNA總量(≥500 ng),取1μL總RNA通過qubit儀器定量。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性(28S：18S≥1.5),根據(jù)濃度取300 ng用1%瓊脂糖電泳檢測。

利用DESeq軟件對不同樣本組之間篩選差異表達(dá)的已知基因,采用每百萬測序片段(fragments)中來自某一基因每千堿基長度的測序片段數(shù)目(FPKM)來進(jìn)行基因表達(dá)水平定量。

對篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析(http：//www.kegg.jp/),針對隔離組小鼠顯著上調(diào)表達(dá)的基因,采用TopGO軟件進(jìn)行基因本體論(Gene ontology, GO)功能分析,將所有差異表達(dá)基因與GO、 KEGG數(shù)據(jù)庫對比,利用Fisher精確檢驗計算GO和Pathway在差異表達(dá)基因中是否有顯著富集(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1一般情況比較實驗前,老年小鼠背部可見明顯灰色雜毛、毛發(fā)光澤度減弱,反應(yīng)遲鈍不喜動,對外界反應(yīng)淡漠;同籠干預(yù)結(jié)束后,相比隔離組小鼠,同籠組老年小鼠活動增多,背部毛發(fā)亮度增加;眼眶采血后,隔離組小鼠死亡2只,同籠組小鼠未見死亡。

2.2小鼠體質(zhì)量及肝臟系數(shù)比較隔離老年小鼠與同籠老年小鼠干預(yù)前后體重、肝臟質(zhì)量、肝臟系數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3社會隔離對小鼠血清細(xì)胞因子的影響血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素10(IL-10)和干擾素-γ(IFN-γ)使用酶聯(lián)免疫吸附劑分析試劑盒進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,與同籠組相比,隔離組老年小鼠血清的TNF-α、 IL-1β和IL-6水平均升高。見表2。

2.4隔離小鼠與同籠小鼠肝臟的差異基因分析與同籠老年小鼠相比, 隔離老年小鼠肝臟中檢測到543個顯著差異的基因, 其中289個基因上調(diào)(log2 FoldChange≥1,P≤0.05), 254個基因下調(diào)(log2 FoldChange≤1,P≤0.05)。見圖1。

表1 隔離組和同籠組老年小鼠體質(zhì)量及肝臟系數(shù)

表2 隔離組和同籠組老年小鼠血清細(xì)胞因子結(jié)果

注：深點代表顯著上調(diào)基因,淺點代表顯著下調(diào)基因;橫坐標(biāo)顯示不同樣品中基因的表達(dá)倍數(shù)變化;縱坐標(biāo)顯示基因表達(dá)差異的顯著性水平。圖1 隔離組和同籠組老年小鼠肝臟差異基因火山圖

對差異基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析, 顯著富集的兩條通路為趨化因子信號通路 (Chemokine signaling pathway,P<0.01)和細(xì)胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction,P<0.05), 兩條通路均富集的基因有趨化因子(CXC基序)配體1(C-X-C ligand 1, CXCL1), Cxcl5, Cxcl13和前血小板堿性蛋白(Pro-platelet basic protein, Ppbp)編碼基因以及預(yù)測基因13306(predicted gene 13306, Gm13306)。這5個免疫相關(guān)基因在隔離組老年小鼠中均顯著上調(diào), 這些差異表達(dá)基因在社會隔離對肝臟影響中的明確機(jī)制尚待后續(xù)深入探索。信號通路富集情況見表3。

GO功能分析中,在隔離組老年小鼠中顯著上調(diào)的生物過程(Biological process)、分子功能(Molecular function)和細(xì)胞組分(Cellular component)分別有427、 102和15個條目,其中生物過程主要涉及免疫反應(yīng)(Immune response);細(xì)胞組分主要涉及循環(huán)免疫球蛋白復(fù)合物(Immunoglobulin complex, circulating);分子功能主要涉及CXCR趨化因子受體結(jié)合(CXCR chemokine receptor binding)、免疫球蛋白受體結(jié)合(Immunoglobulin receptor binding)、趨化因子活性(Chemokine activity)等(見圖2)。從差異表達(dá)基因GO富集分析結(jié)果中,選取最顯著的20個條目繪制散點圖,顯著富集的GO包括CXCR趨化因子受體結(jié)合(CXCR chemokine receptor binding)、嗜中性粒細(xì)胞趨化性的正調(diào)控(Positive regulation of neutrophil chemotaxis)、粒細(xì)胞趨化性的正調(diào)控(Positive regulation of granulocyte chemotaxis)等(見圖3)。

表3 隔離組和同籠組老年小鼠肝臟差異基因KEGG顯著富集通路

注： 橫坐標(biāo)代表-log10(Pvalue),縱坐標(biāo)代表顯著富集的GO名稱。圖2 隔離組老年小鼠顯著上調(diào)的GO功能分類

注： 橫坐標(biāo)代表Rich factor,表示富集程度;縱坐標(biāo)代表顯著富集的GO名稱。圖3 隔離組老年小鼠顯著上調(diào)的GO條目氣泡圖

3 討論

當(dāng)今社會人們的傳統(tǒng)家庭意識逐步淡化,老年人可能會面臨更大的社會隔離風(fēng)險[7]。社會隔離對老年人生理、心理和社會健康等方面都存在不同程度的危害,合理應(yīng)用老齡動物研究社會隔離對身體健康影響的生物學(xué)機(jī)制,為進(jìn)一步研究老年社交環(huán)境與身心健康之間的關(guān)系提供科學(xué)依據(jù),對促進(jìn)實現(xiàn)健康老齡化有積極意義。本研究利用老齡C57BL/6J小鼠進(jìn)行隔離飼養(yǎng)模型的研究,結(jié)果顯示社會隔離造成老年小鼠外周血炎性細(xì)胞因子TNF-α、 IL-1β和IL-6水平升高,以及肝臟趨化因子編碼基因表達(dá)水平升高。

炎癥可能在老年社會隔離中起到關(guān)鍵病理作用。一方面,衰老本身與促炎狀態(tài)有關(guān),衰老細(xì)胞通過破壞外周免疫系統(tǒng)激活慢性炎癥狀態(tài),導(dǎo)致機(jī)體過度的先天免疫活性,釋放促炎細(xì)胞因子并減少抑炎因子表達(dá)[8];另一方面,社會隔離引起的心理社會應(yīng)激通過過度激活下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸,導(dǎo)致分泌腎上腺素、去甲腎上腺素、皮質(zhì)醇等應(yīng)激激素,促進(jìn)白細(xì)胞的遷移和活化并誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子,如IL-1β、 IL-6和TNF-α等分泌增加,從而加重炎癥反應(yīng)[9]。本研究運用酶聯(lián)免疫吸附試驗探索了社會隔離對老年小鼠血清細(xì)胞因子水平的影響,結(jié)果顯示隔離組老年小鼠外周血IL-1β、 IL-6和TNF-α水平顯著增加,提示社會隔離可能激活老年小鼠的慢性炎癥狀態(tài),增加炎癥相關(guān)疾病風(fēng)險。值得注意的是, IL-1β、 IL-6和TNF-α不僅提示更高的炎癥風(fēng)險,還與更高的應(yīng)激水平有關(guān),有研究指出外周IL-1β、 IL-6和TNF-α的升高可作為老年精神應(yīng)激、抑郁癥、全因性癡呆易感性的潛在生物標(biāo)志物[10]。

趨化因子越來越被認(rèn)為是肝臟炎癥的重要介質(zhì),在患有肝臟炎性疾病(包括由酒精、藥物(對乙酰氨基酚)和病毒(丙型肝炎)誘導(dǎo)的疾病)的患者中,肝臟內(nèi)的趨化因子表達(dá)增加,并且與這些肝臟疾病中的炎性細(xì)胞募集直接相關(guān)。本研究運用RNAseq方法從mRNA水平探索了社會隔離老年小鼠肝臟的差異表達(dá)基因和通路, KEGG富集分析結(jié)果顯示社會隔離對肝臟的影響可能主要集中于趨化因子信號通路和細(xì)胞因子受體相互作用的異常, 兩條通路均富集的基因有Cxcl1, Cxcl5, Cxcl13, Ppbp和Gm13306。Cxcl1, Cxcl5, Cxcl13, Ppbp是參與將嗜中性粒細(xì)胞募集到炎癥部位的趨化因子,其轉(zhuǎn)錄水平受到TNF-α, IL-1β和IL-6的調(diào)控誘導(dǎo)[11-12],該過程對于清除病原體和受損組織很重要,但如果失調(diào)也可能導(dǎo)致組織損傷和慢性炎癥。此外, Gm13306作為一種非編碼RNA基因,在免疫反應(yīng)中的確切作用尚不清楚,但很可能在調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)基因表達(dá)中發(fā)揮作用,已有報道其在自發(fā)性炎癥中上調(diào)[13]。與之一致的是,本研究的GO富集結(jié)果也顯示在隔離組老年小鼠肝臟的趨化因子上調(diào)表達(dá),提示免疫細(xì)胞趨化性上升。

總之,本研究初步得出社會隔離這種干預(yù)社交環(huán)境的實驗處理可能會通過激活炎癥影響老年小鼠肝臟健康。除了應(yīng)激-慢性炎癥機(jī)制外, 社會隔離還可能通過其他生物學(xué)機(jī)制影響肝臟健康,例如通過激活血管痙攣機(jī)制減少肝臟灌注、減少自主運動導(dǎo)致脂肪肝、增加酒精和藥物濫用的風(fēng)險加重肝臟代謝負(fù)擔(dān)等,此外, DNA水平變異、蛋白功能、藥物代謝能力、腸道菌群改變、機(jī)體其他重要器官功能改變等也均可在后續(xù)研究中運用相應(yīng)的組學(xué)手段進(jìn)行深入探索,從而更全面認(rèn)識社會隔離狀態(tài)對老年健康的影響。