摘要：農(nóng)作物雖然具有天然免疫系統(tǒng)，但是僅依靠本身的免疫系統(tǒng)并不能完全抵御病蟲害的侵染。幾丁質(zhì)酶能夠通過降解真菌性病毒細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)和破壞昆蟲及線蟲的消化膜等方式達(dá)到抗病蟲害的效果，而且不會(huì)對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)生任何負(fù)面影響，在提高農(nóng)作物的免疫防御方面具有非常重要的研究?jī)r(jià)值。文章重點(diǎn)總結(jié)了幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物中的免疫機(jī)制作用，綜述了其在糧食、蔬菜、果類等農(nóng)作物免疫防御中的應(yīng)用研究進(jìn)展，并展望了幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物上的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：幾丁質(zhì)酶；農(nóng)作物；免疫防御；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S432 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20230225

基金項(xiàng)目：江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）。

Research progress on the application of chitinase in crops immune defense

Sun Jintao， Xie Minhao， Xu Hui， Liu Jianhui， Su Anxiang

（ College of Food Science and Engineering， Nanjing University of Finance and Economics/ Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety， Nanjing， Jiangsu 210023 ）

Abstract： Although crops have a natural immune system， their immune system alone is not able to fully protect them against pest and disease. Chitinase can achieve pest and disease resistance by degrading chitin in the cell wall of fungal viruses and destroying digestive membranes of insects and nematodes without any negative effect on crops， it is of great research value in improving the immune defense of crops. The paper focused on the role of immune mechanisms of chitinases in crops， and then summarized research progress on their immune defense applications in crops such as grains， vegetables and fruits， and prospected for the application of chitinases in crops in the future.

Key words： chitinase， crops， immune defense， application

隨著世界人口的日益增長(zhǎng)，糧食的需求量隨之上升，導(dǎo)致農(nóng)作物在全球的種植面積需求越來(lái)越大，而農(nóng)作物病蟲害的發(fā)生是造成農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量降低的最主要因素，每年因病蟲害造成糧食（農(nóng)作物）減產(chǎn)20%～40%，直接損失超過2 000億美元[1]。目前在病蟲害防治方面，主要還是依靠化學(xué)防治的方式和手段[2]，然而過度依賴化學(xué)防治方式會(huì)造成環(huán)境生態(tài)污染。為了生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，降低化學(xué)試劑對(duì)土壤環(huán)境的影響，生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)建設(shè)過程中的應(yīng)用逐漸被重視。將生物技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病蟲害防治中，能夠有效減少傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥防治方法給環(huán)境帶來(lái)的負(fù)面影響，推動(dòng)綠色農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]，而幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物生物防治方面具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

幾丁質(zhì)酶（Chitinase， EC3.2.1.14）是水解幾丁質(zhì)的酶，能夠催化幾丁質(zhì)的β-1，4-糖苷鍵，將其降解成N-乙酰葡糖胺（N-actyl glucosamine， NAG），并能由各種微生物，包括病毒、細(xì)菌和真菌，以及昆蟲、高等植物和動(dòng)物合成[4]。幾丁質(zhì)由β-1，4-糖苷鍵將N-乙酰-D-氨基葡萄糖（Beta-1，4-linked Repeating N-acetylaminoglucose Units， GlcNAc）分子連接而成，以結(jié)構(gòu)多糖的形式存在于真菌細(xì)胞壁、節(jié)肢動(dòng)物的外骨骼、甲殼綱動(dòng)物的外殼以及寄生線蟲的外殼中，但尚未在植物體內(nèi)鑒定出幾丁質(zhì)的存在[5]。幾丁質(zhì)酶能夠通過降解真菌性病毒細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)和破壞昆蟲及線蟲的消化膜等方式達(dá)到抗病蟲害的效果，且不會(huì)對(duì)植物體產(chǎn)生傷害。同時(shí)，幾丁質(zhì)酶也是植物防御系統(tǒng)中重要的防衛(wèi)因子，可以增強(qiáng)植物的防御系統(tǒng)，在抵御病原真菌以及病蟲害中發(fā)揮著重要作用[6]。幾丁質(zhì)酶在轉(zhuǎn)基因抗性育種中也發(fā)揮著重要作用，探索幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物免疫防御中的應(yīng)用對(duì)病害的生物防治和轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物抗病的研究具有重要意義[7]。本文通過對(duì)近幾年幾丁質(zhì)酶在各種農(nóng)作物中的免疫防御應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為其他農(nóng)作物的生物防治提供參考。

1 幾丁質(zhì)酶

1911年，Bernard首次在蘭花球莖中描述了植物中的幾丁質(zhì)酶，其可作為可擴(kuò)散的抗霉菌劑和熱敏因子發(fā)揮作用。1929年，Karrer等[8]在陸生腹足軟體動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶，隨后人們逐漸開始研究幾丁質(zhì)酶。

1.1 幾丁質(zhì)酶的分類

1992年，國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUBMB）根據(jù)幾丁質(zhì)酶的作用方式，將其分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（EC3.2.1.14）和外切幾丁質(zhì)酶（EC3.2.1.30）兩大類。內(nèi)切幾丁質(zhì)酶是以內(nèi)部位點(diǎn)為靶點(diǎn)，產(chǎn)生氨基葡萄糖的小分子多聚體——二乙酰殼二糖、幾丁三糖和幾丁四糖。外切幾丁質(zhì)酶被分為chitobiosidase（EC 3. 2. 1. 29）和exo-β-N-acetylglucosaminidases（EC 3.2.1.30），分別作用于幾丁質(zhì)非還原端的二乙?；鶜ざ轻尫?，以及從內(nèi)切幾丁質(zhì)酶獲得的多聚體/低聚物的非還原端轉(zhuǎn)化為GlcNAc單體[9]。幾丁質(zhì)酶的作用方式使其在農(nóng)作物防治方面具有很好的應(yīng)用潛力。Saccharothrix yanglingensis Hhs. 015是從黃瓜根部分離得到一種新型稀有放線菌。從S. yanglingensis Hhs.015中克隆了一個(gè)新的內(nèi)切型幾丁質(zhì)酶Chi6769，能有效抑制黑腐皮殼屬真菌03-8（Valsa mali 03-8）的生長(zhǎng)[10]。

幾丁質(zhì)酶屬于糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH），能水解幾丁質(zhì)中兩個(gè)GlcNAc的C1和C4之間的β-1，4-糖苷鍵[11]。根據(jù)氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的不同，幾丁質(zhì)酶又被分成GH 18家族、GH 19家族和GH 20家族[12]。GH 18家族由細(xì)菌、真菌、病毒、動(dòng)物、昆蟲和植物的幾丁質(zhì)酶組成，能夠催化1，4-糖苷鍵靶向水解產(chǎn)生β-異構(gòu)體。GH 19家族包括鏈霉菌幾丁質(zhì)酶和植物幾丁質(zhì)酶，其催化機(jī)制與溶菌酶和殼聚糖酶相似，能水解谷氨酰胺和氨基葡萄糖[13]。GH 20涉及來(lái)自細(xì)菌、某些真菌、自盤基網(wǎng)柄菌和人類的N-乙酰己糖胺酶[14]。在農(nóng)作物中的應(yīng)用，多以GH 18家族和GH 19家族為主。

從酶的定位、氨基酸的長(zhǎng)度和類型、等電點(diǎn)、pH、誘導(dǎo)劑的存在以及信號(hào)肽和N-端肽，進(jìn)一步將幾丁質(zhì)酶分為五類。I類幾丁質(zhì)酶存在于高等真核生物中，如植物。II類存在于高等和低等真核生物中，如植物和真菌，在細(xì)菌中也有發(fā)現(xiàn)。目前，還沒有關(guān)于I類、II類或III類序列相似性的信息。在I類和IV類具有序列的相似性和免疫學(xué)特性的相似性，但是肽的長(zhǎng)度有所不同。V類幾丁質(zhì)酶的發(fā)現(xiàn)源于植物和微生物的相互作用[15]。

1.2 各物種幾丁質(zhì)酶及其在農(nóng)作物中的應(yīng)用概況

幾丁質(zhì)酶在各生物體中發(fā)揮著特定的功能，根據(jù)來(lái)源，幾丁質(zhì)酶可以被歸類為植物幾丁質(zhì)酶、哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶、昆蟲幾丁質(zhì)酶以及微生物幾丁質(zhì)酶[16]，并且各物種幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物中也具有豐富的研究?jī)r(jià)值和研究潛力。

1.2.1 植物幾丁質(zhì)酶

植物的莖、種子、花和塊莖中含有幾丁質(zhì)內(nèi)切酶，可以隨機(jī)水解幾丁質(zhì)內(nèi)部的β-1，4鍵，從而產(chǎn)生殼寡糖和GlcNAc。植物幾丁質(zhì)酶主要?dú)w入GH 19家族，在胚胎發(fā)育、乙烯合成和抵御環(huán)境脅迫（如寒冷、干旱和高鹽濃度）中發(fā)揮重要作用[17]。此外，植物會(huì)通過產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶來(lái)抵御植物病原體。植物幾丁質(zhì)酶在單子葉和雙子葉植物中均有存在，例如，豆類、大麥、卷心菜、胡蘿卜、玉米、黃瓜、大蒜、燕麥、洋蔥、豌豆、花生、土豆、大米、西紅柿等[18]。許多植物幾丁質(zhì)酶已被證明具有潛在的抗真菌活性。張兵[19]從蘋果葉片中克隆到GH 19家族幾丁質(zhì)酶基因M dChi，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因蘋果植株，轉(zhuǎn)化植株的抗灰霉病菌能力明顯提升，證明了M dChi基因具有提高植物抗病能力的作用。Kabir等[20]從大麥中分離到一種32 kDa的重組幾丁質(zhì)酶，在大腸桿菌中表達(dá)后顯示出較好的抗真菌活性。植物幾丁質(zhì)酶也顯示出耐受非生物脅迫的顯著潛力，例如大蒜幾丁質(zhì)酶基因在抗鹽脅迫的過程中發(fā)揮重要作用[21]。

1.2.2 哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶

哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶屬于GH 18家族，根據(jù)它們的酶活性，又將其劃分為類幾丁質(zhì)酶相似蛋白和活性幾丁質(zhì)酶[22]。哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶的分子結(jié)構(gòu)含有磷酸三糖異構(gòu)酶折疊組成的N-末端催化結(jié)構(gòu)域[23]。在活性幾丁質(zhì)酶中，通過谷氨酸提供一個(gè)質(zhì)子來(lái)水解幾丁質(zhì)中的β-1，4-糖苷鍵；類幾丁質(zhì)酶相似蛋白具有谷氨酸殘基和天冬氨酸，谷氨酸殘基作為催化中心的質(zhì)子供體，天冬氨酸穩(wěn)定底物[24]。哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶雖然多應(yīng)用于如哮喘、炎癥、癌癥、組織重塑等方面，但在農(nóng)作物的保護(hù)和增產(chǎn)方面也有探索的空間[25]。

1.2.3 昆蟲幾丁質(zhì)酶

昆蟲幾丁質(zhì)酶主要屬于GH 18家族，通常存在于昆蟲的外胚層上皮組織中，如前腸、角質(zhì)層、氣管以及昆蟲的腸道圍食基質(zhì)中。盡管昆蟲中含有豐富的幾丁質(zhì)酶，但只有6種昆蟲來(lái)源的幾丁質(zhì)酶具有結(jié)構(gòu)信息。它們?cè)诖呋Y(jié)構(gòu)域具有相似的整體結(jié)構(gòu)，包含一個(gè)核心區(qū)和一個(gè)額外的α+β插入結(jié)構(gòu)域[26]。有研究[27]發(fā)現(xiàn)，在亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）的中腸中特異性表達(dá)的幾丁質(zhì)酶ChtIV對(duì)植物病原真菌具有抗真菌活性。因此昆蟲幾丁質(zhì)酶可以作為一種重要的生防劑，通過與其他殺蟲劑聯(lián)合使用，從而進(jìn)一步提高農(nóng)作物的抗蟲性[28]。

1.2.4 微生物幾丁質(zhì)酶

除了一些革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌屬于GH 19家族，大多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶屬于GH 18家族。在自然界中，微生物幾丁質(zhì)酶是主要的幾丁質(zhì)分解者，它們?cè)谧匀唤缰械奶己偷纳锏厍蚧瘜W(xué)循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用[29]。同時(shí)，微生物幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)上具有廣闊的應(yīng)用。例如：黏質(zhì)沙雷氏菌（S. marcescens）和蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種（B. thuringiensis subsp. Aizawai）產(chǎn)生抗棉鈴蟲和吉普賽蛾幼蟲的幾丁質(zhì)酶，蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）作為微生物防治劑和生物殺蟲劑已在全球范圍內(nèi)得到實(shí)際應(yīng)用[30]。黏質(zhì)沙雷菌的幾丁質(zhì)酶基因SmChiC在煙草中的過表達(dá)，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)灰霉病菌感染的耐受性，在防御草食性昆蟲中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[31]。

2 幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物免疫中的作用機(jī)制

植物病原真菌利用它們的寄主植物來(lái)完成生命周期。然而，植物等農(nóng)作物具有多種防御機(jī)制來(lái)抵抗真菌感染[32]。非自身分子的細(xì)胞外監(jiān)控由細(xì)胞表面受體介導(dǎo)，這些受體在識(shí)別微生物相關(guān)分子模式（microbial-associated molecular patterns， MAMPs）后被激活。這些通常是高度保守的分子，如幾丁質(zhì)、β-葡聚糖和海藻糖等，這些分子在微生物中具有不可或缺的功能，此類受體的激活為免疫反應(yīng)提供了信號(hào)，被稱為MAMP觸發(fā)的免疫（MAMP-triggered immunity，MTI），這涉及產(chǎn)生活性氧、離子流、轉(zhuǎn)錄重編程和一系列新蛋白質(zhì)的合成，這些蛋白質(zhì)的聯(lián)合作用會(huì)阻止病原體生長(zhǎng)[33]。

幾丁質(zhì)是有效的MAMP，可在許多植物物種中引發(fā)MTI[34]。第一個(gè)幾丁質(zhì)激發(fā)結(jié)合蛋白是水稻細(xì)胞質(zhì)膜的幾丁質(zhì)誘導(dǎo)結(jié)合蛋白CEBIP。通過RNA干擾對(duì)CEBiP基因進(jìn)行敲除，抑制了誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的氧化猝滅以及基因反應(yīng)，表明CEBiP在水稻細(xì)胞感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)幾丁質(zhì)寡糖誘導(dǎo)劑中起著關(guān)鍵作用。同時(shí)，根據(jù)對(duì)CEBiP進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)CEBiP的胞外部分存在兩個(gè)LysM（Lysine motifs）基序。LysM基團(tuán)存在于參與豆科植物和根瘤菌之間共生信號(hào)傳遞的假定的Nod-factor受體激酶中，這表明部分同源的質(zhì)膜蛋白同時(shí)參與了植物細(xì)胞的防御和共生信號(hào)傳遞[35]。類似于CEBIP的幾丁質(zhì)誘導(dǎo)子結(jié)合蛋白不僅存在于水稻細(xì)胞中，而且還存在于對(duì)幾丁質(zhì)寡糖誘導(dǎo)子有反應(yīng)的各種植物細(xì)胞的質(zhì)膜中，例如大麥、胡蘿卜、大豆和小麥細(xì)胞，盡管分子大小因來(lái)源而略有不同。這些結(jié)果表明，基于幾丁質(zhì)識(shí)別的防御系統(tǒng)在農(nóng)作物中廣泛存在[36]。

農(nóng)作物的幾丁質(zhì)酶在幾丁質(zhì)識(shí)別的防御系統(tǒng)中具有重要作用。農(nóng)作物的抗真菌病源是通過質(zhì)外體幾丁質(zhì)酶（Apoplastic chitinases）和液泡幾丁質(zhì)酶（Vacuolar chitinases）兩種酶的作用機(jī)制。質(zhì)外體幾丁質(zhì)酶是在真菌侵染時(shí)，通過水解菌絲細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，促使幾丁質(zhì)與相應(yīng)的模式識(shí)別受體的結(jié)合，進(jìn)而刺激質(zhì)外體幾丁質(zhì)酶的合成分泌以及誘導(dǎo)液泡幾丁質(zhì)酶的合成，主要是負(fù)責(zé)為免疫反應(yīng)提供信號(hào)，引發(fā)固有免疫。液泡幾丁質(zhì)酶是在植物發(fā)病期間，由于真菌對(duì)細(xì)胞的破壞，致使原生質(zhì)體破裂而分泌，以此破壞真菌中幾丁質(zhì)的合成，達(dá)到抑菌的目的[37]。同時(shí)，幾丁質(zhì)酶也可以通過破壞昆蟲、線蟲的消化膜的方式，實(shí)現(xiàn)植物對(duì)蟲害的防御應(yīng)答。

然而，病原體已經(jīng)進(jìn)化出由效應(yīng)分子介導(dǎo)的復(fù)雜策略，以預(yù)防或干擾MTI，從而促進(jìn)感染[38]。在番茄葉霉菌（Cladosporium fulvum）中，質(zhì)外體效應(yīng)子CfAvr4的表達(dá)增強(qiáng)了其毒力。CfAvr4是一種幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素，通過在感染過程中分泌CfAvr4，從而保護(hù)真菌細(xì)胞壁的完整性免受植物幾丁質(zhì)酶的侵害。然而，這種保護(hù)機(jī)制只在不攜帶CF-4的宿主植物中起作用，CF-4是一種膜錨定的抗性蛋白，可以識(shí)別Avr4并觸發(fā)過敏反應(yīng)[39]。然而，不含編碼Avr4同源物基因的病原體仍然能夠抑制植物幾丁質(zhì)酶對(duì)其細(xì)胞壁的降解，表明有其他機(jī)制來(lái)對(duì)抗幾丁質(zhì)酶的活性[40]。

另一方面，幾丁質(zhì)酶對(duì)細(xì)菌的影響卻沒有得到充分的研究開發(fā)，這可能是因?yàn)閹锥≠|(zhì)酶不存在于細(xì)菌細(xì)胞壁中。只有少數(shù)幾丁質(zhì)酶被認(rèn)為是潛在的抗細(xì)菌蛋白。這些幾丁質(zhì)酶往往具有溶菌酶的活性，除了能夠降解幾丁質(zhì)外，還具有切割肽聚糖鏈的能力，從而促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞的裂解[41]。從伊朗高鹽度生態(tài)系統(tǒng)中分離出來(lái)的短小芽胞桿菌（Bacillus pumilus SG2）幾丁質(zhì)酶ChiS被鑒定為幾丁質(zhì)酶/溶菌酶，ChiS除了能夠降解真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)成分外，還能降解多種細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖成分，包括Xanthomonas translucens pv. Hordei、Bacillus licheniformis、E. coli C600、E. coli TOP10、Pseudomonas putida等[42]。因此應(yīng)多研究幾丁質(zhì)酶的肽聚糖水解酶活性，提高農(nóng)作物的抗細(xì)菌活性，從而抵御細(xì)菌性病原菌。

3 幾丁質(zhì)酶在各類農(nóng)作物免疫防御中的應(yīng)用研究進(jìn)展

農(nóng)作物的生長(zhǎng)和生產(chǎn)力受到各種生物和非生物因素的影響，雖然植物有發(fā)達(dá)的防御系統(tǒng)，但在病原體攻擊時(shí)，其產(chǎn)量和質(zhì)量仍會(huì)受到損害。幾丁質(zhì)酶不僅可以加強(qiáng)植物的防御系統(tǒng)，使真菌失去活性，而且對(duì)植物沒有任何負(fù)面影響。同時(shí)，由于基因工程技術(shù)的發(fā)展，使得幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物免疫防御上具有了廣泛的應(yīng)用[43]。

3.1 幾丁質(zhì)酶在糧食作物中的應(yīng)用研究進(jìn)展

目前，幾丁質(zhì)酶在糧食作物上的運(yùn)用主要是針對(duì)水稻、小麥、玉米、大豆、馬鈴薯。幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物抵御由真菌引起的病害中發(fā)揮了重要作用，尤其以幾丁質(zhì)酶的異源表達(dá)運(yùn)用最廣。通過將真菌或其他物種的幾丁質(zhì)酶基因?qū)氲阶陨淼幕蚪M中，進(jìn)行幾丁質(zhì)酶的異源表達(dá)，從而提高農(nóng)作物對(duì)病原菌的抗性?？瓜x轉(zhuǎn)基因玉米植物是通過表達(dá)來(lái)自Spodoptera littoralis的幾丁質(zhì)酶基因來(lái)開發(fā)的，開發(fā)的轉(zhuǎn)基因玉米植株對(duì)Sesamia cretica的抗性明顯增加[25]。而Liu等[44]同樣也發(fā)現(xiàn)了一種來(lái)自Leymus chinensis幾丁質(zhì)酶基因LcCHI2，LcCHI2的過量表達(dá)增加了轉(zhuǎn)基因玉米的幾丁質(zhì)酶活性，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出更好的病原體抗性，并增強(qiáng)了對(duì)中性鹽和堿性鹽脅迫的耐受性。菌核病病原菌核盤菌（Sclerotinia sclerotioru）也是一種毀滅性的真菌病原體，對(duì)大豆的產(chǎn)量影響很大。Yang等[45]將真菌寄生真菌Coniothyrium minita的幾丁質(zhì)酶基因CmCH1引入大豆中，CmCH1的過表達(dá)導(dǎo)致H2O2的積累增加及防御相關(guān)基因和酶的上調(diào)，從而增強(qiáng)了對(duì)核盤菌感染的抗性，同時(shí)對(duì)大豆植物的生長(zhǎng)和發(fā)育無(wú)不利影響。與此同時(shí)，張福麗等[46]發(fā)現(xiàn)棘孢木霉幾丁質(zhì)酶基因能夠顯著抑制大豆核盤菌的生長(zhǎng)，并通過誘導(dǎo)ROS積累和抗性酶活性提高大豆對(duì)核盤菌的抗性。哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的幾丁質(zhì)酶基因chit42通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到番薯中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)核盤菌抗性明顯提升[47]。

除了幾丁質(zhì)酶基因的異源表達(dá)提高農(nóng)作物本身抗性，農(nóng)作物幾丁質(zhì)酶的同源表達(dá)在農(nóng)作物的抗病性上也得到了很好的運(yùn)用。例如，耐受紋枯病的水稻品幾丁質(zhì)酶基因LOC_Os11g47510在易感水稻植株中的過表達(dá)顯示出對(duì)紋枯病抗性的改善[48]。與此同時(shí)，幾丁質(zhì)酶和草酸氧化酶基因的共表達(dá)，也提高了水稻對(duì)紋枯病的抗性[49]。Zhu等[50]研究了定殖于小麥的內(nèi)生菌Phomopsis liquidambaris。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和幾丁質(zhì)酶整合到基因組中構(gòu)建了兩種工程菌株，Phomopsis liquidambaris OEChi和INChi。OE-Chi和IN-Chi菌株可以抑制鐮刀菌的擴(kuò)增，增強(qiáng)小麥對(duì)禾谷鐮刀菌的抗性。從另一個(gè)角度探索了幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物抗病性的應(yīng)用。

同時(shí)，幾丁質(zhì)酶的作用也體現(xiàn)出在研究糧食農(nóng)作物的致病機(jī)理方面。稻瘟病菌（Pyricularia oryzae syn. Magnaporthe oryzae）是一種對(duì)水稻具有很強(qiáng)破壞性的疾病，每年對(duì)水稻造成大量的損失。韓藝娟[51]通過研究稻瘟病菌中GH 18家族的幾丁質(zhì)酶基因MoChil，發(fā)現(xiàn)了MoChil基因的敲除能夠使稻瘟病菌對(duì)水稻的致病性降低，并發(fā)現(xiàn)了MoChil基因的體外互作蛋白OsMBLl，從分子水平上研究了稻瘟病菌與水稻的相互作用機(jī)制。Bai等[52]發(fā)現(xiàn)小麥油菜素內(nèi)酯信號(hào)通路中的BES/BZR轉(zhuǎn)錄因子TaBZR2通過提高幾丁質(zhì)酶活性賦予小麥對(duì)條銹菌的廣譜抗性。

糧食農(nóng)作物幾丁質(zhì)酶在耐受金屬脅迫，作用于其他農(nóng)作物方面也略有研究。例如，大豆幾丁質(zhì)酶的活性是隨著植物部位的不同而不同，發(fā)育葉片中的植物部分與年輕組織相比更高，并且大豆幾丁質(zhì)酶具有耐受砷和鎘脅迫的顯著潛力[53]。大麥（Hordeum vulgare L.）幾丁質(zhì)酶基因在大腸桿菌表達(dá)純化后，對(duì)交鏈格孢菌、立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)有顯著抑制作用[54]。同時(shí)，馬鈴薯幾丁質(zhì)酶在茶基因組的過表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因茶對(duì)水皰疫病的抵抗力增強(qiáng)[55]。

3.2 幾丁質(zhì)酶在蔬菜作物中的應(yīng)用研究進(jìn)展

與糧食作物相同，異源表達(dá)幾丁質(zhì)酶在蔬菜作物抵抗病蟲害同樣適用。蘭創(chuàng)業(yè)等[56]采用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法將含有東亞鉗蝎昆蟲特異性神經(jīng)毒素基因BmkIT與夜蛾幾丁質(zhì)酶基因Chitinase的雙價(jià)抗蟲基因載體導(dǎo)入到白菜中，通過繼代培養(yǎng)獲得了含BmkIT-Chitinase雙價(jià)抗蟲基因的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因植株，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株及其后代具有抗性鱗翅目昆蟲的作用，豐富了轉(zhuǎn)基因白菜抗蟲材料。Jabeen等[57]進(jìn)行了含有稻幾丁質(zhì)酶RCG3基因的番茄轉(zhuǎn)基因系對(duì)兩種重要的真菌病原體Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici引起的鐮刀菌枯萎病和Alternaria solani引起的早疫病的抗性評(píng)估。對(duì)含有稻殼素酶RCG3基因（Solanum lycopersicum Mill. cv. Riogrande）的3個(gè)轉(zhuǎn)基因品系TL1、TL2和TL3及其R1后代進(jìn)行了兩種真菌病原體的抗性測(cè)試。發(fā)現(xiàn)，在番茄的易感栽培品種中引入幾丁質(zhì)酶基因，不僅增強(qiáng)了抗性，而且在轉(zhuǎn)基因品系2和3中穩(wěn)定的遺傳。哈茨木霉的幾丁質(zhì)酶基因chit42轉(zhuǎn)入胡蘿卜，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因胡蘿卜顯著降低了由核盤菌引起的胡蘿卜腐爛程度[58]。

同時(shí)，隨著幾丁質(zhì)酶在蔬菜作物上的應(yīng)用研究的深入，越來(lái)越多的蔬菜作物幾丁質(zhì)酶被發(fā)現(xiàn)研究，蔬菜作物幾丁質(zhì)酶基因在抵抗致病菌方面也有非常大的潛力。Xu等[59]發(fā)現(xiàn)黃瓜中的幾丁質(zhì)酶基因Chi2和Chi14在受到尖孢鐮刀菌感染后顯著上調(diào)，其體外表達(dá)蛋白也表現(xiàn)出對(duì)尖孢鐮刀菌的抗性。在通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默黃瓜中的Chi2基因后，發(fā)現(xiàn)Chi2的沉默阻礙了茉莉酸途徑中的基因激活，從而增加了對(duì)尖孢鐮刀菌的易感性。同時(shí)，大蒜這種蔬菜很容易被鐮刀菌感染。然而，關(guān)于大蒜幾丁質(zhì)酶的相關(guān)研究較少。在大蒜基因組中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)I類幾丁質(zhì)酶基因AsCHI1-7，AsCHI1-7啟動(dòng)子含有茉莉酸、水楊酸、赤霉素、脫落酸、生長(zhǎng)素、乙烯和與防御病原體有關(guān)的應(yīng)激反應(yīng)元件。這些基因可能在大蒜防御鐮刀菌攻擊方面具有保守的功能，可用于育種計(jì)劃以提高大蒜對(duì)鐮刀菌感染的抗性[60]。ChiIV3是辣椒中的幾丁質(zhì)酶基因，可誘發(fā)辣椒的細(xì)胞死亡。Liu等[61]通過研究ChiIV3在抗青枯病菌（Ralstonia solanacearum）中的作用，發(fā)現(xiàn)防御基因ChiIV3的表達(dá)受到多種調(diào)控方式的控制，轉(zhuǎn)錄因子WRKY40直接與ChiIV3啟動(dòng)子區(qū)的W4-box元件結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而調(diào)節(jié)辣椒對(duì)青枯菌的防御反應(yīng)。同樣，從辣椒中鑒定和分離出幾丁質(zhì)酶基因CaChiIII7，在響應(yīng)病原體感染的植物防御中發(fā)揮著重要作用。CaChiIII7的敲除導(dǎo)致刺炭疽病菌（Colletotrichum acutatum）在受感染的葉子中增殖和防御反應(yīng)基因的表達(dá)下降。而CaChiIII7的瞬時(shí)表達(dá)增強(qiáng)了對(duì)刺炭疽病菌的抗性[62]。

3.3 幾丁質(zhì)酶在果類作物中的應(yīng)用研究進(jìn)展

果類作物幾丁質(zhì)酶的研究多處于新基因的發(fā)現(xiàn)與功能探索方面。淀粉歐文菌（Erwinia amylovora）是蘋果火疫病的致病菌。而“Freedom”品種的蘋果中的一種酸性幾丁質(zhì)酶III蛋白（Machi3-1）可以抑制解淀粉歐文菌在柱頭滲出物和花蜜中的繁殖和生物膜的形成，使得部分保護(hù)含有5B-Machi3-1等位基因的蘋果栽培品種免受解淀粉歐文菌的侵害[63]。Han等[64]從“Baozhu”梨中發(fā)現(xiàn)、純化和表征了一種新的幾丁質(zhì)酶。該幾丁質(zhì)酶是分子量為28.9 kDa的單體。通過對(duì)內(nèi)部肽序列進(jìn)行分析，將該幾丁質(zhì)酶分類為III類幾丁質(zhì)酶。生物學(xué)分析表明，這種幾丁質(zhì)酶對(duì)農(nóng)業(yè)病原真菌具有很強(qiáng)的抗真菌活性?？偟膩?lái)說，\"Baozhu\"梨的幾丁質(zhì)酶是一種新型的雙功能幾丁質(zhì)酶，可作為植物病害生物防治的潛在殺菌劑。Wen等[65]從中國(guó)野生二倍體草莓Fragaria nilgerrensis Schlecht（F. nilgerrensis）中分離出一個(gè)V類幾丁質(zhì)酶基因FnCHIT2，通過將該基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中進(jìn)行過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)炭疽病的抵抗力提高了，推測(cè)FnCHIT2可能在草莓對(duì)真菌病原體的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論與展望

幾丁質(zhì)酶在糧食作物以及蔬菜作物中的開發(fā)應(yīng)用比較成熟，但其轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的穩(wěn)定性及安全性問題還需繼續(xù)深入研究。雖然幾丁質(zhì)酶在果類作物中的研究也在不斷發(fā)展，但其應(yīng)用種類不如糧食以及蔬菜作物，有待進(jìn)行持續(xù)性研究。幾丁質(zhì)酶以抗真菌性病原菌為主，但有少數(shù)幾丁質(zhì)酶具有抗細(xì)菌性病原菌的能力，幾丁質(zhì)酶的抗細(xì)菌性是一個(gè)新的探索方向。同時(shí)，關(guān)于幾丁質(zhì)酶與農(nóng)作物相互作用的機(jī)制仍需繼續(xù)研究。相信隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，幾丁質(zhì)酶將在農(nóng)作物病蟲害生物防治中發(fā)揮更大的作用。

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