溫雪 何昱靜 袁倩倩 李初誼 盧利霞 于曉輝 張久聰

摘要：目的 研究乙型肝炎肝硬化患者外周血T淋巴細胞和血清中Sema4D的表達，分析其與臨床指標的相關性。方法 納入2020年10月—2021年11月在聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院就診的20例慢性乙型肝炎（CHB）患者，68例乙型肝炎肝硬化患者以及20例健康對照者。根據(jù)Child-Pugh分級標準將乙型肝炎肝硬化患者分為Child-Pugh A級組（n=24）、B級組（n=24）和C級組（n=20）。采集患者外周血，分離血清及外周血單個核細胞（PBMC），流式細胞術檢測PBMC中膜結合型Sema4D（mSema4D）+CD4+T、mSema4D+CD8+T淋巴細胞的表達，酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血清中可溶型Sema4D（sSema4D）的表達，分析其與病毒復制、肝臟炎癥指標的相關性。符合正態(tài)分布的計量資料多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料多組間比較用Kruskal-Wallis H檢驗，進一步兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗；采用Spearman進行相關性分析。結果 mSema4D+CD4+T、mSema4D+CD8+T淋巴細胞的表達在CHB組、乙型肝炎肝硬化組和對照組3組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（F值分別為43.092、13.344，P值均＜0.001），進一步兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。隨著Child-Pugh分級的增加，mSema4D+CD4+T淋巴細胞、mSema4D+CD8+T淋巴細胞的表達水平逐漸降低（F值分別為14.093、17.154，P值均＜0.05），進一步兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。對照組、CHB組、乙型肝炎肝硬化組sSema4D含量分別為1.54（1.42～1.71）ng/mL、1.08（1.07～1.38）ng/mL、4.87（2.13～14.97）ng/mL，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義（H=32.366，P＜0.001），進一步兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。Child-Pugh A級組、B級組、C級組sSema4D含量分別為2.42（0.59～5.65）ng/mL、4.92（2.75～12.73）ng/mL、14.18（4.59～18.43）ng/mL，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義（H=11.889，P=0.003），進一步兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。sSema4D水平與乙型肝炎肝硬化患者的ALT、HBV DNA定量的表達水平均呈明顯正相關（r值分別為0.294、0.430，P值均＜0.05）。結論 Sema4D 在乙型肝炎肝硬化患者T淋巴細胞膜上低表達，在血清中高表達。sSema4D可能通過影響乙型肝炎肝硬化患者的ALT、HBV DNA水平，參與疾病的發(fā)生發(fā)展。

關鍵詞：肝硬化； 乙型肝炎； Sema4D； T淋巴細胞

基金項目：國家自然科學基金（青年基金）（81500454）； 甘肅省科技計劃項目（21JR7RA017）；? 甘肅省消化系統(tǒng)重癥疾病臨床醫(yī)學研究中心（20JR10RA107）

Expression of Sema4D in peripheral blood T cells and serum of patients with hepatitis B cirrhosis and its clinical significance

WEN Xue1，2， HE Yujing1， YUAN Qianqian1， LI Chuyi1， LU Lixia1， YU Xiaohui1， ZHANG Jiucong1. （1. Department of Gastroenterology， The 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese Peoples Liberation Army， Lanzhou 730050， China; 2. School of Clinical Medicine， Ningxia Medical University， Yinchuan 750000， China）

Corresponding authors：

YU Xiaohui， yuxiaohui528@126.com （ORCID：0000-0002-8633-3281）;

ZHANG Jiucong， zhangjiucong@163.com （ORCID：0000-0003-4006-3033）

Abstract：

Objective To investigate the expression of Sema4D in peripheral blood T cells and serum of patients with hepatitis B cirrhosis and its correlation with clinical indicators. Methods A total of 20 patients with chronic hepatitis B （CHB）， 68 patients with hepatitis B cirrhosis， and 20 healthy controls who attended The 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese Peoples Liberation Army from October 2020 to November 2021 were enrolled. According to Child-Pugh class， the patients with hepatitis B cirrhosis were divided into Child-Pugh class A group with 24 patients， Child-Pugh class B group with 24 patients， and Child-Pugh class C group with 20 patients. After peripheral blood samples were collected to isolate serum and peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）， flow cytometry was used to measure the expression of membrane-bound Sema4D （mSema4D）+CD4+ T cells and mSema4D+CD8+ T cells in PBMCs， and ELISA was used to measure the expression of soluble Sema4D （sSema4D） in serum; their correlation with viral replication and liver inflammation markers was analyzed. A one-way analysis of variance was used for comparison of normally distributed continuous data between multiple groups， and the??? least significant difference t-test was used for further comparison between two groups; the Kruskal-Wallis H test was used for comparison of non-normally distributed continuous data between multiple groups， and the?? Mann-Whitney U? test was used for further comparison between two groups; a Spearman correlation analysis was also performed. Results There were significant differences in the expression of mSema4D+CD4+ T cells and mSema4D+CD8+ T cells between the CHB group， the hepatitis B cirrhosis group， and the control group （F=43.092 and 13.344， both P＜0.001）， while there were significant differences between any two groups （P＜0.05）. The expression levels of mSema4D+CD4+ T cells and mSema4D+CD8+ T cells gradually decreased with increasing Child-Pugh class （F=14.093 and 17.154， both P＜0.05）， and there were significant differences between any two groups （P＜0.05）. The content of sSema4D was 1.54（1.42-1.71） ng/mL in the control group， 1.08（1.07-1.38） ng/mL in the CHB group， and 4.87（2.13-14.97） ng/mL in the hepatitis B cirrhosis group， with a significant difference between the three groups （H=32.366， P＜0.001） and between any two groups （P＜0.05）. The content of sSema4D was 2.42（0.59-5.65） ng/mL in the Child-Pugh class A group， 4.92（2.75-12.73） ng/mL in the Child-Pugh class B group， and 14.18（4.59-18.43） ng/mL in the Child-Pugh class C group， with a significant difference between the three groups （H=11.889， P=0.003） and between any two groups （P＜0.05）. In patients with hepatitis B cirrhosis， the level of sSema4D was positively correlated with the levels of alanine aminotransferase （ALT） and HBV DNA quantification （r=0.294 and 0.430， both P＜0.05）. Conclusion Sema4D is lowly expressed on T cell membrane and highly expressed in serum of patients with hepatitis B cirrhosis， and sSema4D may be involved in the development and progression of hepatitis B cirrhosis by affecting the levels of ALT and HBV DNA.

Key words：Liver Cirrhosis； Hepatitis B； Sema4D； T-Lymphocytes

Research funding：

National Natural Science Foundation of China （Youth Foundation）（81500454）; Science and Technology Program of Gansu Province（21JR7RA017）; Gansu Provincial Clinical Research Center for Severe Disease of Digestive System（20JR10RA107）

HBV持續(xù)感染所致的乙型肝炎肝硬化是目前我國肝硬化的主要原因［1］。機體免疫功能紊亂參與了乙型肝炎肝硬化的發(fā)生發(fā)展，但其具體機制還沒有完全闡明。Semxpahorin 4D（Sema4D），又稱為CD100，是一種跨膜型的二聚體蛋白，主要存在于靜息的T淋巴細胞，在B淋巴細胞、抗原遞呈細胞等細胞膜上也可表達［2-3］。某些基質金屬蛋白酶（matrix metallopeptidases，MMP）可以通過水解Sema4D胞外區(qū)的蛋白，介導Sema4D從細胞膜表面脫落，形成具有生物學活性的可溶型Sema4D（soluble Sema4D，sSema4D）［4］。Sema4D可以與受體分化抗原簇72（CD72）和神經叢蛋白B（Plexin-B），包括Plexin-B1和Plexin-B2結合，在病毒感染性疾病、炎性疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生中起著重要的作用［5-7］。由于肝硬化是慢性乙型肝炎（CHB）進展的重要階段，兩者關系密切，互為因果。因此，本試驗以CHB患者、乙型肝炎肝硬化患者和健康體檢者為研究對象，采集其外周靜脈血，運用流式細胞術及酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等實驗方法，檢測CHB患者、乙型肝炎肝硬化患者和健康體檢者Sema4D在外周血T淋巴細胞及血清中的表達水平，并探討二者相關關系，初步揭示Sema4D在乙型肝炎肝硬化疾病進程中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2020年10月—2021年11月在聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院就診的20例CHB患者、68例乙型肝炎肝硬化患者及20例健康對照者。診斷標準按中華醫(yī)學會感染病學分會、肝病學分會發(fā)布的《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》執(zhí)行［8］。根據(jù)Child-Pugh分級標準將乙型肝炎肝硬化患者分為Child-Pugh A級組（n=24）、B級組（n=24）、C級組（n=20）。納入標準：（1）患者至少3個月未使用抗病毒藥物或相關免疫抑制藥物治療；（2）所有受試者年齡18～80歲；排除標準：（1）合并HAV、HCV等嗜肝病毒或其他病毒感染的患者；（2）合并自身免疫、酒精、藥物、代謝、遺傳等多種原因引起的肝硬化的患者；（3）合并自身免疫及嚴重的其他系統(tǒng)疾病的患者；（4）合并肝癌的患者；（5）妊娠或哺乳期女性；（6）在過去3個月內接受抗病毒或免疫抑制治療的患者；（7）臨床資料不全者。對照組人群均無慢性病史。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 對所有入選的患者采集空腹肘靜脈血6 mL，其中2 mL注射入不含抗凝劑的采血管中，4 mL血液注射入肝素鈉抗凝管中用于分離血清及外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。

1.2.2 流式細胞術檢測PBMC中T淋巴細胞亞群及其表面膜結合型Sema4D（membrane-bound Sema4D， mSema4D）的表達 將-80 ℃冰箱凍存的外周血PBMC復蘇，設置空白對照管、單陽管、同型對照管、樣本管，分別加入CD3、CD4、CD8、Sema4D單克隆抗體，將細胞處理后用美國BD公司的流式細胞儀進行測定。

1.2.3 外周血血清中sSema4D的檢測 采用ELISA實驗方法，試劑盒由上海江萊生物科技有限公司提供，嚴格按照說明書檢測步驟進行。

1.2.4 患者ALT、HBV DNA定量的檢測 所有入組患者均采用全自動生化分析儀檢測ALT水平，RT-PCR法檢測HBV DNA定量。實驗過程中所需設備及耗材均來自本院檢驗科。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25～P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，進一步兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗；采用Spearman進行相關性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 T淋巴細胞亞群的檢測 各組間性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P值均＞0.05）。對照組、CHB組、乙型肝炎肝硬化組患者CD3+CD4+T淋巴細胞、CD3+CD8+T淋巴細胞的百分比呈逐漸下降的趨勢，各組間比較均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）（表1）。

2.2 Sema4D在受試者外周血CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞膜上的表達 流式細胞術檢測受試者外周血CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞膜上Sema4D的表達。結果顯示，與對照組相比，CHB組患者CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞膜上Sema4D的表達水平顯著增加，乙型肝炎肝硬化組患者CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞膜上Sema4D的表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）（表2）。2.3 Sema4D在乙型肝炎肝硬化患者不同Child-Pugh分級中的表達 隨著Child-Pugh分級的增加，mSema4D+CD4+T淋巴細胞、mSema4D+CD8+T淋巴細胞的表達水平逐漸降低，進一步兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）（表3）。

2.4 sSema4D在受試者血清中的表達 對照組、CHB組、乙型肝炎肝硬化組sSema4D含量分別為1.54（1.42～1.71）ng/mL、1.08（1.07～1.38）ng/mL、4.87（2.13～14.97）ng/mL，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義（H=32.366，P＜0.001）。進一步兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。

2.5 sSema4D在不同Child-Pugh分級患者血清中的表達 Child-Pugh A級組、B級組、C級組sSema4D含量分別為2.42（0.59～5.65）ng/mL、4.92（2.75～12.73）ng/mL、14.18（4.59～18.43）ng/mL，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義（H=11.889，P=0.003）。進一步兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.05）。

2.6 sSema4D與ALT、HBV DNA的相關性 sSema4D水平與乙型肝炎肝硬化患者的ALT、HBV DNA定量的表達水平均呈明顯正相關（r值分別為0.294、0.430，P值均＜0.05）。

3 討論

Sema4D是一種分子量為150 kD的跨膜蛋白，主要由T淋巴細胞產生，在NK細胞和抗原遞呈細胞中也可表達［9］。Sema4D在細胞膜上表達形式為mSema4D，細胞激活后表達升高，隨后通過某些蛋白酶的水解，脫落形成血清中的sSema4D［10］。Sema4D的兩種表達形式都保留了生物學活性，可以與其受體CD72、Plexin-B（Plexin-B1、Plexin-B2）結合，參與維持B淋巴細胞穩(wěn)態(tài)、T淋巴細胞活化等免疫調節(jié)過程［11］。Sema4D在多種疾病中都發(fā)揮重要作用，其中在病毒相關性疾?。?2］、炎癥性疾?。?3］及腫瘤性疾?。?4］中的研究較多。

HBV的持續(xù)感染，使機體長期處于HBV復制狀態(tài)，肝細胞受損，肝臟發(fā)生慢性炎癥。長期慢性炎癥，肝臟可發(fā)生不可逆轉的損傷，可使CHB進展至肝纖維化、肝硬化，甚至肝細胞癌［15］。機體的免疫功能紊亂是造成CHB、乙型肝炎肝硬化發(fā)生的重要內在原因，其中以T淋巴細胞介導的免疫功能紊亂為主。然而，其具體機制尚未完全闡明。HBV進入機體，激活CD4+T淋巴細胞，其中輔助性T淋巴細胞產生大量細胞因子，參與機體的免疫應答，并促進CD8+T淋巴細胞的成熟、增殖，釋放穿孔素、顆粒酶，分泌IFNγ等細胞因子，啟動HBV特異性免疫反應，在抑制HBV的復制和傳播的同時，對肝細胞也造成了損害［16-17］。多種研究［18-19］表明，HBV促進肝臟炎癥進展的過程中，T淋巴細胞逐漸竭耗。本研究結果顯示，對照組、CHB組、乙型肝炎肝硬化組患者，CD3+CD4+T淋巴細胞、CD3+CD8+T淋巴細胞的百分比逐漸下降。這一實驗結果與楚玉蘭等［20］的研究結果相一致，在HBV感染過程中，T淋巴細胞逐漸消耗，機體的細胞免疫功能逐漸降低，肝細胞損傷，最終導致了乙型肝炎肝硬化的發(fā)生。

Yang等［21］研究結果表明，在CHB患者中，CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞表面mSema4D的表達水平顯著高于正常人群，MMP2/9水平的降低導致了CHB患者血清中sSema4D的表達低下，HBV不能清除，外源性注射sSema4D可增強體內CD8+T淋巴細胞的功能。研究［22］顯示，血清中sSema4D在CHB患者中的表達水平較低，且與疾病的進展及肝細胞的損傷相關。王桂玲等［23］研究發(fā)現(xiàn)，健康者、CHB、乙型肝炎相關原發(fā)性肝癌患者，其血清中sSema4D的含量逐步升高，sSema4D可以影響機體內多種免疫細胞的表達，促進炎性因子的產生，從而參與HBV相關性肝病的發(fā)生。

Sema4D與HBV感染所致的慢性肝炎關系密切，在CHB進展至乙型肝炎肝硬化的過程中，T淋巴細胞的數(shù)量和功能是降低的［24］，而Sema4D是由T淋巴細胞所產生，但其在乙型肝炎肝硬化患者T淋巴細胞膜上的表達情況目前尚無文獻報道。本研究結果表明：CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞mSema4D的表達在CHB患者中是最高的，在乙型肝炎肝硬化患者中是最低的，兩組患者mSema4D的表達與對照組相比，均有顯著性差異（P值均＜0.05）；血清中sSema4D的表達在乙型肝炎肝硬化患者中是最高的，在CHB患者中是最低的，兩組與對照組比較，均有顯著性差異（P值均＜0.05）。Sema4D在淋巴細胞和血清中的表達在CHB和乙型肝炎肝硬化患者中出現(xiàn)截然相反的結果，分析原因：（1）Sema4D由T淋巴細胞產生，從CHB到乙型肝炎肝硬化的疾病進程中，由于HBV的不斷刺激，T淋巴細胞經歷了從活化到衰竭的過程。T淋巴細胞活化時，mSema4D高表達，而T淋巴細胞衰竭時，mSema4D產生減少，使mSema4D的表達水平經歷了從升高到降低的變化，造成了在CHB時期mSema4D表達增高，sSema4D降低，發(fā)展到肝硬化時期mSema4D降低，而sSema4D升高，提示了Sema4D可能作為判斷CHB進展的一個重要免疫學指標。有研究［25］發(fā)現(xiàn)HIV感染者由于機體T淋巴細胞衰竭，其表面mSema4D的表達也明顯降低，這與本研究結果一致。（2）MMP2和MMP9可促使T淋巴細胞膜上mSema4D裂解脫落成為血清中的sSema4D［26］。在乙型肝炎肝硬化患者的疾病進展中，MMP2和MMP9的表達水平升高［26］，介導mSema4D從細胞膜表面脫落，進而導致血清中sSema4D的表達升高。（3）sSema4D除來自于T淋巴細胞膜上mSema4D的脫落外，也可源于其他免疫細胞，如肝星狀細胞，而活化的肝星狀細胞分泌大量的膠原蛋白是肝硬化形成的重要原因。有文獻［27］報道在血吸蟲病小鼠體內，發(fā)生纖維化的肝組織中肝星狀細胞高表達Sema4D及Sema4D受體（Plexin B1和CD72），由此推測，乙型肝炎肝硬化患者血清中的Sema4D也會因肝星狀細胞的活化而增高。

Child-Pugh評分是判斷乙型肝炎肝硬化患者肝功能及病情嚴重程度的重要方法，其分級越高代表患者的肝功能越差，病情越嚴重［28］。本研究進一步分析不同Child-Pugh分級的乙型肝炎肝硬化患者Sema4D的表達水平，結果顯示，Sema4D在不同Child-Pugh分級患者中的表達均有所不同，隨著Child-Pugh分級的提高，患者mSema4D+CD4+T淋巴細胞、mSema4D+CD8+T淋巴細胞的表達水平逐漸下降，血清中sSema4D的表達水平則呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，提示Sema4D的表達水平與乙型肝炎肝硬化的病情嚴重程度關系密切。此結果與有關文獻報道的一致，如過敏性紫癜［29］、多發(fā)性骨髓瘤［30］等。

ALT主要存在于肝細胞胞漿中，是反映肝細胞損傷的指標［31］。HBV DNA的含量是判斷HBV復制最可靠的指標，高水平的HBV DNA復制可以加重肝細胞的損傷［32-33］。本研究對乙型肝炎肝硬化患者血清中sSema4D與ALT和HBV DNA定量的相關性進行評價，結果顯示，sSema4D與患者的ALT、HBV DNA定量的表達均呈現(xiàn)明顯正相關。這一結果與已有文獻報道相一致，sSema4D可以通過影響患者的臨床指標來參與疾病的發(fā)生。如何瑜等［34］研究顯示，HCV患者NK細胞膜上Sema4D的表達與ALT水平呈正相關，與HCV RNA定量呈負相關，Sema4D參與了疾病進展。HBV的持續(xù)感染是造成肝硬化進展的重要因素，高表達的 sSema4D與機體肝細胞的損傷程度及HBV DNA的復制密切相關，本研究結果進一步提示sSema4D參與了乙型肝炎肝硬化患者的疾病進展并與病情嚴重程度相關。

綜上所述，乙型肝炎肝硬化患者T淋巴細胞表達減少，機體發(fā)生復雜的免疫調節(jié)過程，使得Sema4D在T淋巴細胞膜上的表達降低，而血清中的表達升高，且Sema4D的表達水平隨著乙型肝炎肝硬化的疾病嚴重程度而變化。sSema4D與機體肝細胞的損傷密切相關，可以參與乙型肝炎肝硬化的發(fā)生發(fā)展。

倫理學聲明：本研究于2020年10月18日經由解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院倫理委員會審批，批號：2020KYL153，所有受試者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：溫雪負責實驗設計、標本采集、數(shù)據(jù)分析及論文撰寫；何昱靜、袁倩倩、李初誼和盧利霞負責采集標本，分析數(shù)據(jù)；于曉輝、張久聰負責指導撰寫論文并最后定稿。

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收稿日期：

2022-09-07；錄用日期：2022-10-09

本文編輯：林姣