周琳琳，郭辰濤，鐘晨輝，林 琪*

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013；2.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.海洋生物種業(yè)技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361013)

微藻是一類光合效率高、生長(zhǎng)速度快的自養(yǎng)型生物，細(xì)胞結(jié)構(gòu)為單細(xì)胞，通常以二分裂方式增殖，且細(xì)胞周期短，具有易培養(yǎng)、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[1-2]。微藻可以利用簡(jiǎn)單的元素合成具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和生理功能的生物活性物質(zhì)，在人類生產(chǎn)與生活中，引起了廣泛的關(guān)注[3]。作為初級(jí)生產(chǎn)者，微藻不僅能將無(wú)機(jī)環(huán)境中的物質(zhì)能量同化吸收，促進(jìn)生態(tài)系統(tǒng)元素循環(huán)，同時(shí)還能伴隨產(chǎn)生油脂、蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸等多種活性物質(zhì)[4-5]?；谖⒃遄陨淼奶攸c(diǎn)，其產(chǎn)業(yè)應(yīng)用廣泛分布在生產(chǎn)生活的各個(gè)領(lǐng)域中。在農(nóng)業(yè)方面，因含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，微藻常作為魚類、貝類的優(yōu)質(zhì)飼料[6]。在生態(tài)環(huán)境方面，微藻能夠利用水中的有機(jī)物，包括碳、氮、磷等，并釋放溶解氧到水體中，因此其也常被用于廢水處理，包括生活廢水、工業(yè)廢水、養(yǎng)殖廢水[7]。同樣，微藻在生物能源及食品藥品等領(lǐng)域也備受關(guān)注。由于化石燃料的局限性，微藻作為第三、第四代生物燃料的生產(chǎn)生物已成為當(dāng)下的一個(gè)研究熱門，小球藻[8]、微擬球藻[9]在生物柴油制備方面應(yīng)用較多。在食品藥品方面，螺旋藻[10-11]、裂殖壺藻[12]、雨生紅球藻[13]等含有的生物活性物質(zhì)也常被用于開(kāi)發(fā)食品、藥品和保健品等。

微藻的育種經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的發(fā)展過(guò)程，最早可以追溯到1957年的稱重法，這是自然分離選育的一種方法，Moazami N等[14]用此方法篩選得到了2株高油脂含量的微藻。自然分離選育還包括平板劃線法、稀釋法、微吸管法和 96 孔板法等。但是傳統(tǒng)自然選育周期長(zhǎng)，同時(shí)伴隨著選育品質(zhì)性狀不穩(wěn)定、生物質(zhì)產(chǎn)量低等缺點(diǎn)，限制了微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展[15]，因此將一些新興的技術(shù)手段用于微藻種質(zhì)資源的創(chuàng)新，對(duì)微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有深遠(yuǎn)的意義。本文綜述了不同方法在微藻育種領(lǐng)域的研究成果，并分析了其存在的優(yōu)勢(shì)和不足，以期為后續(xù)的微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究提供參考。

1 微藻育種的應(yīng)用

微藻雖然含有許多高附加值的產(chǎn)品，如油脂、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)、蝦青素等，但原始藻株的生產(chǎn)能力有限，因此提高微藻的油脂含量、生長(zhǎng)速度、光合作用效率等性狀對(duì)于推動(dòng)微藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展是十分必要的。隨著育種技術(shù)應(yīng)用于微藻，目前已經(jīng)選育出許多性狀優(yōu)良的突變?cè)逯?，并且被廣泛應(yīng)用在生產(chǎn)和生活中。

1.1 水產(chǎn)飼料

微藻含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)元素以及各類生物活性物質(zhì)，可以滿足水產(chǎn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需求，能有效促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，提高抗逆能力[16]。但微藻生物量、生長(zhǎng)速度、環(huán)境適應(yīng)能力等都存在局限性，因此選育出生物量高、生長(zhǎng)速度快、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的藻株成為了飼料微藻的選育目標(biāo)之一。已有相關(guān)研究報(bào)道，如夏金蘭等[17]通過(guò)紫外線誘變小球藻獲得了1株耐高溫的突變?cè)逯辏@使小球藻最適生長(zhǎng)溫度提高到了35℃；Ong S C等[18]通過(guò)甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate，EMS)溶液誘變小球藻，使小球藻的生長(zhǎng)溫度提高到了40℃。

1.2 修復(fù)水環(huán)境

近年來(lái)，隨著“綠色水產(chǎn)養(yǎng)殖”理念的提出，日益突出的環(huán)境問(wèn)題也被提上了議程。作為微生物一類，微藻被認(rèn)為是天然的凈化者[19]，自1957年，利用微藻去除水體中的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)鹽這一觀點(diǎn)被Oswald W J等[20]提出來(lái)之后，有研究發(fā)現(xiàn)，小球藻對(duì)水體中氮和磷的去除率分別可達(dá)86%和78%[21-22]，此外，Rugnini L等[23]利用小球藻和鏈帶藻去除水介質(zhì)中重金屬Cu和Ni，在混合金屬溶液中的去除率分別達(dá)到了95%和90%。

1.3 碳中和

隨著工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，二氧化碳的排放量逐年增加，對(duì)自然環(huán)境造成了嚴(yán)重的影響[24]。微藻通過(guò)光合作用，可以將大氣中CO2轉(zhuǎn)化為有機(jī)物，從而實(shí)現(xiàn)碳中和。越來(lái)越多的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，藻類的CO2固定率大約為12%，利用藻類捕獲和固定環(huán)境中的CO2是一種安全有效的方式[25]，因此提高CO2的固定率成為微藻育種的目的之一。Zhu Y等[26]采用60Co-γ射線誘變鈍頂螺旋藻獲得的突變株對(duì)CO2的固定率提高了22.4%；Yang B等[27]通過(guò)過(guò)表達(dá)小球藻的果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(Fructose-1，6-bisphosphate aldolase，F(xiàn)BA)，使得細(xì)胞固定二氧化碳的效率提高了24.7%。

1.4 生物柴油

生物柴油作為一種清潔能源越來(lái)越受到人們的重視。微藻能夠在有機(jī)物和CO2存在的情況下生產(chǎn)脂質(zhì)，并且微藻細(xì)胞產(chǎn)生的脂質(zhì)的性質(zhì)與柴油相似，因此可以將微藻用于生物柴油的制備[28]。但由于微藻細(xì)胞個(gè)體小，油脂含量低，以小球藻為例，小球藻細(xì)胞大小為3～8 μm，油脂含量占細(xì)胞干重的20%[29]，相對(duì)于人類的生產(chǎn)活動(dòng)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因此培育出高油脂含量的藻株是微藻育種的主要目標(biāo)之一。盡管通過(guò)藻類制備生物柴油還處于初級(jí)階段，同時(shí)生產(chǎn)成本高昂，導(dǎo)致其無(wú)法與化石能源競(jìng)爭(zhēng)，但微藻生物柴油仍然是未來(lái)生物能源主要的來(lái)源之一[30]。

1.5 活性物質(zhì)

微藻中含有的生物活性物質(zhì)也常被添加于食品、保健品、藥品等產(chǎn)品中。微藻中含有的不飽和脂肪酸，主要包括EPA和 DHA。其中，EPA可以調(diào)節(jié)血脂，保護(hù)心腦血管，常用作為老年人保健品的重要添加物；DHA除了有保護(hù)心腦血管的作用，還是大腦成長(zhǎng)，發(fā)育的重要物質(zhì)，常被用于嬰幼兒食品[31-32]。螺旋藻含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素等，具有提高人體免疫力、抗衰老等作用[10]，因此也常被用于保健品。蝦青素作為一種抗氧化劑，也用來(lái)作為食品、保健品以及生物飼料的重要添加物。雨生紅球藻中蝦青素的含量為1.5%～10.0%，被稱為天然蝦青素的“濃縮品”，因此雨生紅球藻已成為提取蝦青素的主要微藻[33-34]。

2 微藻育種方法

目前，常見(jiàn)的微藻育種方法主要包括2種：誘變育種和新興的分子育種。誘變育種是指通過(guò)物理、化學(xué)或者二者相結(jié)合的方式處理藻細(xì)胞，造成遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，再通過(guò)定向的篩選、培育，來(lái)獲得目的性狀優(yōu)良的目標(biāo)藻株[35]。分子育種是指將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于育種，主要在分子水平上對(duì)基因進(jìn)行改造，從而改變性狀。分子育種能夠定向地控制基因表達(dá)，它可以實(shí)現(xiàn)微藻育種的定點(diǎn)突變，彌補(bǔ)誘變育種的不定向性[16]。

2.1 物理誘變

物理誘變主要用α射線、β射線、中子和其他粒子、紫外輻射以及微波輻射等物理因素誘發(fā)變異，引起分子結(jié)構(gòu)改變，誘發(fā)染色體異位、缺失、重組或斷裂等，從而引起后代性狀產(chǎn)生變異[36]。常用的物理誘變主要包括紫外線(Ultraviolet ray，UV)、射線、重離子束(Linear energy transfer，LET)、常壓室溫等離子體(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)、激光、超聲波和太空射線[35]。

2.1.1 紫外誘變

紫外誘變是通過(guò)UV照射藻類細(xì)胞DNA，導(dǎo)致藻細(xì)胞DNA雙鏈雙螺旋結(jié)構(gòu)變異，堿基錯(cuò)配，從而形成突變體[15]。紫外誘變操作簡(jiǎn)便易上手，因此其在微藻誘變中被廣泛應(yīng)用。

通過(guò)UV照射藻細(xì)胞時(shí)，功率范圍一般為10～30 W、照射距離為10～40 cm、輻射時(shí)間選取在30～900 s之間，并且在致死率為80%～95%的范圍內(nèi)選取突變株。目前，通過(guò)紫外誘變已經(jīng)選育出油脂含量高、DHA含量高的微藻[12，37-39]，

具體情況見(jiàn)表1。

表1 紫外誘變?cè)谖⒃逵N中的研究成果Tab.1 Research results of UV mutagenesis in microalgae breeding

2.1.2 射線誘變

射線包括X射線、γ射線、α射線、β射線等，是一種能量高、穿透力強(qiáng)的電離輻射源。射線誘變是指輻射造成DNA分子共價(jià)鍵斷裂或者分子缺失，當(dāng)修復(fù)出錯(cuò)時(shí)造成突變，進(jìn)而獲得突變體[40]。γ射線相對(duì)于其他射線具有更強(qiáng)的穿透力，可誘變?cè)逯戤a(chǎn)生多種活性代謝物，如酶和維生素等[41-42]。目前在微藻的育種中多使用60Co-γ誘變?cè)荚逯辏渚€的誘變劑量一般為100～1 600 Gy，獲得的突變株的油脂含量有較大幅度的提高[43-45]，具體見(jiàn)表2。

表2 60Co-γ射線誘變選育高油脂藻株研究成果Tab.2 Results of 60Co-γ ray mutagenesis and breeding of high lipid algae

2.1.3 重離子束誘變

離子輻射源包括質(zhì)子、氦和帶正電的重離子等，長(zhǎng)期以來(lái)被用作微生物和植物育種的誘變劑[46]。其中使用較多的是重離子，而LET是指被剝掉或部分剝掉外圍電子后的帶正電的原子核通過(guò)大型加速器裝置加速而形成的具有能量的射線。相較于傳統(tǒng)的誘變?cè)?，LET具有傳能線密度大、相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)高、損傷后修復(fù)效應(yīng)小、能量沉積的空間分辨性好等生物學(xué)優(yōu)勢(shì)[47]。目前，誘變實(shí)驗(yàn)中使用較多的LET主要是碳離子束，使用的碳離子的能量為80 MeV/μ，密度為31 keV/μm，誘變劑量通常在10～160 Gy之間，并且獲得了性狀優(yōu)良的藻株[9，48-50]，具體見(jiàn)表3。

表3 重離子束誘變育種的研究成果Tab.3 Research results of heavy ion beam mutagenesis breeding

2.1.4 常壓室溫等離子體誘變

ARTP 誘變是通過(guò)釋放活性粒子，作用于微生物的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，使其結(jié)構(gòu)和通透性發(fā)生變化，引起基因損傷，致使突變，從而獲得性狀優(yōu)良的藻株。相較于其他誘變方法，ARTP誘變具有高效、穩(wěn)定、無(wú)毒、環(huán)保、成本低等優(yōu)點(diǎn)[51]。

采用ARTP誘變時(shí)，一般是在功率為80～120 W、通氣量為10 ～12 SLM、距離為2～5 mm的條件下進(jìn)行的，誘變時(shí)間選取在10～150 s之間。利用ARTP選育出的突變株性狀優(yōu)良，表現(xiàn)在油脂含量高、蝦青素含量高等[52-55]，具體見(jiàn)表4。

表4 ARTP在微藻育種中的研究成果Tab.4 Research results of ARTP in microalgae breeding

2.2 化學(xué)誘變

化學(xué)誘變是指使用一些導(dǎo)致基因突變的化學(xué)誘變劑，使遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，從而獲得性狀優(yōu)良的突變株。在生物育種中，化學(xué)誘變對(duì)于獲得優(yōu)良性狀的誘變體是一個(gè)高效且簡(jiǎn)單的方法，這是因?yàn)榛瘜W(xué)誘變能夠在DNA非致死點(diǎn)反復(fù)誘變，由此可產(chǎn)生穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)[56-57]。目前常用的化學(xué)誘變劑主要是烷化劑，包括EMS、亞硝基胍(Nitrosoguanidine，NTG)、硫酸二乙酯(Diethylsulfate，DES)等?；瘜W(xué)誘變對(duì)基因的損害較小，具有特異性，并且具有操作簡(jiǎn)單、成本低、突變范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在誘變育種中被廣泛使用。近年來(lái)，化學(xué)誘變?cè)诳苁想[甲藻(Crypthecodiniumcohnii)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、雨生紅球藻(Haematococcupluvialis)、柵藻(Desmodesmussp.)等均獲得突變株[56-59]。

使用化學(xué)誘變劑誘變微藻時(shí)，采用較多的方法是在固定的時(shí)間內(nèi)，采用不同濃度的誘變劑[58-61]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這有利于縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)。如NTG誘變微藻，NTG的濃度范圍一般在1～5 g/mL之間，誘變時(shí)間通常設(shè)定為10～60 min。具體見(jiàn)表5。

表5 不同化學(xué)試劑誘變微藻研究成果Tab.5 Research results of mutagenesis of microalgae by different chemical reagents

2.3 分子育種

分子育種，是一種新興的手段，包括基因工程育種和基因編輯育種?；蚬こ逃N，也被稱為轉(zhuǎn)基因育種，是將外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使之能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)，以改變生物原有的遺傳特性獲得新品種。當(dāng)前，外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的技術(shù)主要包括電轉(zhuǎn)法、微粒轟擊法(基因槍法)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、玻璃珠攪拌法、自然轉(zhuǎn)化法、細(xì)菌接合法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[62]。近年來(lái)，Crispr/cas9等基因編輯育種技術(shù)也逐漸被應(yīng)用于微藻[63]，與基因工程育種不同的是，基因編輯是對(duì)特定基因進(jìn)行修飾，沒(méi)有外源基因的導(dǎo)入。這2種新興的育種方式具有針對(duì)性強(qiáng)、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠通過(guò)定向改造遺傳物質(zhì)獲得較理想的突變?cè)逯闧15]。

相對(duì)于傳統(tǒng)的育種技術(shù)，新興的微藻育種還處于初級(jí)階段。三角褐指藻作為模式生物，無(wú)論是基因工程，還是基因編輯技術(shù)，都有廣泛的應(yīng)用，在微藻育種中的主要目標(biāo)產(chǎn)物為脂質(zhì)、甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)等[63-67]，具體見(jiàn)表6。

表6 分子育種在微藻育種中的研究成果Tab.6 Research results of molecular breeding in microalgae breeding

3 微藻育種存在的問(wèn)題及解決方法

雖然微藻育種技術(shù)已經(jīng)發(fā)展多年，但微藻育種仍然處于一個(gè)發(fā)展階段，并存在以下幾個(gè)問(wèn)題：1)產(chǎn)量和品質(zhì)互相矛盾。在藻類育種的過(guò)程中，篩選得到生產(chǎn)率高、性狀優(yōu)良的品種是最理想的結(jié)果。但實(shí)際情況中，產(chǎn)量和品質(zhì)卻很少能同時(shí)提高，研究發(fā)現(xiàn)這可能是控制品質(zhì)和產(chǎn)量的基因是相互連鎖的，提高一種性狀的基因表達(dá)會(huì)影響其他基因的表達(dá)，很難一起提高，甚至產(chǎn)生抑制作用，這是因?yàn)槲⒃迨菃渭?xì)胞生物，其繁殖體系使基因間的連鎖難以打破[68]。2)誘變因子及誘變劑量難以精確控制。不同種類微藻誘變因子和誘變劑量是不同的，因此在育種時(shí)如何選擇誘變因子及誘變劑量是目前誘變育種的一大難題。研究發(fā)現(xiàn)，同一種類的微藻，不同的誘變因子均能篩選出性狀優(yōu)良的藻株。尤其是化學(xué)試劑的誘變劑量更加難以確定，化學(xué)誘變劑處理強(qiáng)度的衡量通常用暴露劑量，而不是吸收劑量，因?yàn)槲談┝恳话闱闆r下無(wú)法確定，但對(duì)遺傳物質(zhì)產(chǎn)生作用的卻是吸收劑量，因此化學(xué)誘變中化學(xué)物質(zhì)的誘變劑量通常是一個(gè)估計(jì)值[69]。3)篩選難度大。誘變后的藻株樣本容量較大，但并非所有的誘變株都是符合誘變目的的藻株，因此需要對(duì)誘變后的藻株進(jìn)行篩選，以獲得所需的藻株。另外，篩選出的藻株還需要連續(xù)培養(yǎng)幾代，確保遺傳物質(zhì)能夠穩(wěn)定遺傳。篩選出性狀優(yōu)良的藻株是一個(gè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過(guò)程。

針對(duì)微藻育種技術(shù)存在的問(wèn)題，可以從以下兩個(gè)方面解決：一方面，研究人員需要熟悉不同藻種的生理特性，選擇最適合的育種方法，或者還可以通過(guò)物理誘變和化學(xué)誘變相結(jié)合即復(fù)合誘變方法，從而選育出最佳的藻株；另一方面，微藻誘變育種與當(dāng)前先進(jìn)的基因工程相結(jié)合，如可以通過(guò)基因組重測(cè)序技術(shù)、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、蛋白質(zhì)組分析等技術(shù)，從DNA、蛋白水平上揭示表型與基因型之間的聯(lián)系，掌握誘變作用機(jī)理，從而實(shí)現(xiàn)高效、定向誘變育種。

4 展望

不同的誘變方法有各自的優(yōu)劣勢(shì)。物理誘變方法操作簡(jiǎn)單、易上手，也是目前使用最為廣泛的方法，但其設(shè)備要求高，前期投入成本較大；化學(xué)誘變方法彌補(bǔ)了物理誘變投入成本過(guò)高的不足，但化學(xué)試劑可能具有毒性，這加大了實(shí)驗(yàn)操作的風(fēng)險(xiǎn)；基因工程育種相對(duì)前兩種方法，克服了誘變方向的隨機(jī)性，實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)誘變，但我國(guó)目前與基因工程育種相關(guān)的實(shí)驗(yàn)做得相對(duì)較少，技術(shù)相對(duì)不成熟，并且基因工程目前還存在爭(zhēng)議，因此還需要進(jìn)一步研究。

盡管我國(guó)微藻誘變育種仍處于初級(jí)階段，但近年來(lái)研究者們利用誘變方法仍然培育出了許多含油量高、生長(zhǎng)速率快、生物量高的藻株，這為未來(lái)優(yōu)化選育技術(shù)和提高藻株性狀奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外，可將微藻育種與實(shí)際生產(chǎn)結(jié)合起來(lái)，根據(jù)實(shí)際需求動(dòng)態(tài)地調(diào)整目標(biāo)，促進(jìn)微藻的可持續(xù)發(fā)展。通過(guò)誘變方法選育性狀優(yōu)良的藻株，提高微藻自身含有的天然高附加值產(chǎn)物含量，推動(dòng)微藻育種的高效發(fā)展，為微藻產(chǎn)業(yè)鏈帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。