汪 慧，何學泓，秦 洲，趙培杏，張敏琳，黃楓淇，段旭琢，賈弦澤，梁凱珊，趙會宏，馮春元，孫佩銀，戴遠棠，王 慶*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學海洋學院，廣東 廣州 510642；2.東源縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綜合服務中心，廣東 河源 517575；3.廣東海元農(nóng)業(yè)科技有限公司，廣東 陽江 529823)

趨化因子是一種趨化性細胞因子，在炎癥和生理條件下對細胞運動和激活起重要作用[1-3]。趨化因子超家族也是連接先天性免疫和獲得性免疫的重要橋梁[4-5]。它們參與了脊椎動物神經(jīng)發(fā)育、血管生成、器官生成、生殖細胞遷移和缺氧反應等過程[6-13]。趨化因子受體是一種G蛋白偶聯(lián)受體，包含了7個跨膜結構[14]，根據(jù)受體N-端附近半胱氨酸殘基的間距，可以將這些受體分為4個亞家族(CXC、CC、CX3C和XC)[15]。同時，趨化因子超家族包括大量的配體，大多數(shù)趨化因子可與多個受體結合，一個受體也可與多個趨化因子結合[16]。雖然趨化因子及其受體在哺乳動物，尤其是人類中得到了廣泛的研究，但趨化因子受體在硬骨魚尤其在魚類免疫中的作用尚不明確。

CCR6是一種G蛋白偶聯(lián)受體，表達于多種免疫細胞類型，包括未成熟的樹突狀細胞(DCs)、固有淋巴樣細胞、調(diào)節(jié)性CD4 T細胞、Th17細胞和B細胞[17-21]。在人類中，CCR6已被證實在抵抗疾病中發(fā)揮重要作用，尤其在人類免疫缺陷病毒感染疾病中發(fā)揮關鍵作用[22]，但是在魚類中關于CCR6的作用還不清楚，尤其是CCR6在魚類病毒感染中的作用尚未被研究。

斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)，屬于鱸形目(Perciformes)、科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epinephelinae)、石斑魚屬(Epinephelus)，為廣鹽性暖水性中下層魚類，主要分布于太平洋和印度洋的熱帶及亞熱帶海區(qū)。石斑魚是中國重要的海洋經(jīng)濟魚類養(yǎng)殖品種。然而，近年來各種病毒性疾病的暴發(fā)影響了石斑魚養(yǎng)殖的發(fā)展[23]，尤其是赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒(RGNNV)，受其感染會導致超過90%的魚苗死亡。本研究克隆了斜帶石斑魚CCR6a基因ORF序列，并分析了該基因的進化關系，通過基因過表達和RT-qPCR方法研究了該基因組織分布、亞細胞定位和抗病毒功能，發(fā)現(xiàn)CCR6a可顯著抑制RGNNV的復制。由于CCR6在抗病毒免疫反應中發(fā)揮著重要作用，因此研究CCR6與抗RGNNV之間的關系將有助于防治該病毒病。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

本實驗所用斜帶石斑魚來自廣東省陽江市廣東海元農(nóng)業(yè)科技有限公司養(yǎng)殖基地，挑取3尾體質(zhì)量在500～750 g之間的健康魚，取樣前對魚進行麻醉處理，取肝、脾、垂體、頭腎、下丘腦、腎、性腺、肌肉、鰓、腸、皮膚和心臟組織于液氮中速凍，置于-80℃超低溫冰箱中保存，用于RNA提取、基因克隆和組織表達研究。

1.1.2 細胞實驗

研究中使用的石斑魚脾臟(GS)細胞是本實驗室前期培育的石斑魚脾臟細胞系。RGNNV是實驗室前期分離、培養(yǎng)和保存的病毒。用RGNNV感染GS細胞一定時間，在感染后的特定時間點，收集病毒感染的細胞并進行分析。

1.2 CCR6a基因ORF區(qū)域的克隆和分析

1.2.1 總RNA提取

采用 Trizol reagent 說明書及操作步驟來提取總 RNA，采用cDNA合成試劑盒(羅氏)反轉錄成 cDNA 模板，用于基因克隆和實時定量 PCR。

1.2.2 引物設計

從斜帶石斑魚基因組數(shù)據(jù)庫中獲取CCR6a核心序列信息，結合NCBI數(shù)據(jù)庫獲得已報道的魚類CCR6基因序列進行分析，使用Primer 5.0在線引物搜索工具設計CCR6a基因ORF區(qū)域引物，引物序列為CCR6a-F：GATGAACTACACCAACCAATC，CCR6a-R：CCTCACATGGTGAAAGATGAGC (表1)。

1.2.3 CCR6a 基因的克隆與分析

用反轉錄出來的cDNA為模板，采用設計的引物進行聚合酶鏈式反應來克隆CCR6a的ORF序列。瓊脂糖凝膠電泳驗證后，用膠回收試劑盒 (Omega Bio-Tek，USA)回收目的條帶，對回收產(chǎn)物進行連接轉化和菌液驗證，將驗證后的菌液送至擎科生物科技有限公司進行測序。測序結果出來后，CCR6a的氨基酸序列利用 BioEdit 軟件翻譯，CCR6a蛋白序列的多重比對和進化樹分析使用ClustalW 1.83和MEGA 5.0軟件進行。

1.2.4 表達載體的構建

將CCR6a亞克隆到pEGFP-C1表達載體中，研究CCR6a在石斑魚GS細胞中的定位和潛在功能。pEGFP-C1表達載體購買自Takara公司(貨號：PT3028-5)，GS細胞來自本實驗室前期構建的石斑魚脾臟細胞系，質(zhì)粒構建的引物如表1所示，pEGFP-C1-1F：CCGGAATTCTATGAACTACACCAACCAATCAG，pEGFP-C1-1R：CGGGGTACCCATGGTGAAAGATGAGCCGTTTTC。采用雙酶切方法將CCR6a的ORF區(qū)連接到載體，采用的兩種酶是ECORI和KPNI，酶切位點在引物序列中標粗，重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測序證實。

1.2.5 細胞定位分析

1×105GS細胞加入6孔板中，培養(yǎng)24 h后，采用Invitrogen 公司的Lipofectamine 2000 (貨號：11668-019)轉染試劑將pEGFP-C1和pEGFP-CCR6a質(zhì)粒轉染入GS細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用4%多聚甲醛固定細胞，然后用1 mg/mL DAPI染核10 min，最后用PBS沖洗細胞，50%甘油固定，熒光顯微鏡觀察CCR6a的定位情況。

1.2.6 病毒感染實驗

本研究中使用的石斑魚GS細胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清(FBS)的Leibovitz’ L 15培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后將細胞傳到24孔板中，24 h后將pEGFP-C1和pEGFP-CCR6a質(zhì)粒轉染到GS細胞中，轉染完后12 h，用RGNNV感染GS細胞24 h，再收集病毒感染的細胞，提取RNA，通過實時熒光定量分析病毒基因的表達量。

1.2.7 實時定量 PCR 及數(shù)據(jù)分析

使用SYBR Green I Master(羅氏)在羅氏LightCycler 480實時PCR系統(tǒng)上進行實時PCR分析。PCR條件如下：95℃活化5 min，然后在95℃ 20 s、58℃ 20 s和72℃ 20 s下循環(huán)40個周期。定量引物如表1所示，其中引物qCP-F/R表示RGNNV衣殼蛋白基因(Capsid protein，CP)定量引物，qRdRp-F/R 表示RGNNV RNA聚合酶基因(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，以β-actin基因作為內(nèi)參，表1中β Actin-F/R所示為內(nèi)參引物。分析溶解曲線，確定RT-qPCR的質(zhì)量，用Excel表格初步處理數(shù)據(jù)，再利用Graphpad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析。

表1 CCR6a基因克隆和RT-qPCR所用引物Tab.1 Primers used for CCR6a gene cloning and RT-qPCR

2 結果與分析

2.1 斜帶石斑魚CCR6a基因克隆及其序列分析

測序結果表明CCR6a包含ORF的cDNA序列，ORF長為1 131 bp，編碼376個氨基酸(圖1)。用TMHMM Server V.2.0分析得到7個跨膜區(qū)域(Transmembrane domain，TM)，分別為TM1(AA39～61)、TM2(AA70～92)、TM3(AA112～134)、TM4(AA147～169)、TM5(AA223～245)、TM6(AA258～277)和TM7(AA306～323)。

NetPhos 2.0 Server預測CCR6a氨基酸序列有36個磷酸化位點、17個絲氨酸磷酸化位點、12個蘇氨酸磷酸化位點和7個酪氨酸磷酸化位點。NetNGlyc 1.0 Server預測CCR6a氨基酸序列有8個糖基化位點，其中有1個位于跨膜結構區(qū)域內(nèi)(AA274)，1個位于胞內(nèi)的C末端區(qū)域(AA370)。

2.2 CCR6a氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹分析

進化樹分析結果顯示，斜帶石斑魚CCR6a基因與硬骨魚類的CCR6a基因聚為一支，進一步分析發(fā)現(xiàn) CCR6a與鞍帶石斑魚(Epinepheluslanceolatus)的CCR6a聚為一支(圖2)。進化樹中選取的相關物種及其基因在 GenBank 的序列號構建進化樹所用的基因的序列號如下：CCR6aEpinepheluslanceolatus，XP_033504450.1；CCR6aPercafluviatilis，XP_039637708.1；CCR6aSebastesumbrosus，XP_037605863.1；CCR6aAcanthopagruslatus，XP_036943380.1；CCR6aHippoglossusstenolepis，XP_035006979.1；CCR6aMoronesaxatilis，XP_035534502.1；CCR6aSanderlucioperca，XP_031171690.1；CCR6aGymnodracoacuticeps，XP_034057877.1；CCR6aAmphiprionocellaris，XP_023129801.1；CCR6aPungitiuspungitius，XP_037305948.1；CCR6aThalassophryneamazonica，XP_034018486.1；CCR6aPseudochaenichthysgeorgianus，XP_033935746.1；CCR6aNotolabruscelidotus，XP_034555014.1；CCR6aGasterosteusaculeatusaculeatus，XP_040025791.1；CCR6aOreochromisaureus，XP_031603377.2；CCR6aNeolamprologusbrichardi，XP_006793517.1；CCR6a CCR6aNematolebiaswhitei，XP_037541943.1。

注：陰影表示七次跨膜區(qū)域，*表示終止密碼子。Notes：The shadow indicated the seven-degree transmembrane region，and *indicated the termination codon.

注：斜帶石斑魚CCR6a氨基酸序列與其他物種的同源序列構建的系統(tǒng)進化樹。進化樹通過MEGA-X的鄰接(N-J)法構建，以最大似然法重復1 000次。Notes：Phylogenetic tree using CCR6a amino acid sequences of orange-spotted grouper and homologous sequences of other species.The tree was constructed by the neighbor-joining method of MEGA-X and repeated 1 000 times by the maximum likelihood method.

2.3 CCR6a基因在斜帶石斑魚不同組織中的表達

通過定量PCR檢測CCR6a在不同組織中的表達水平，結果如圖3所示，CCR6a基因在斜帶石斑魚的腎臟和鰓中表達量較高，皮膚次之，性腺和肝臟中表達較少。從中可看出，CCR6a基因在免疫組織和非免疫組織的表達水平表現(xiàn)出明顯差異，其在免疫組織中的表達水平遠高于非免疫組織。

2.4 CCR6a基因在細胞中的定位

構建斜帶石斑魚CCR6a基因的pEGFP-C1載體，通過轉染，將帶有EGFP標簽的CCR6a融合蛋白轉染到GS細胞中，以pEGFP-C1的空載體作為對照，在熒光顯微鏡下觀察，結果表明pEGFP-C1轉染GS后表達的EGFP在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布；而pEGFP-CCR6a轉染的GS細胞中表達的CCR6a存在于細胞的膜系統(tǒng)中(圖4)。

2.5 體外驗證CCR6a基因抗病毒能力

為確定CCR6a在RGNNV復制中的作用，本研究將CCR6a轉染GS細胞，然后用RGNNV感染GS細胞。RGNNV感染后，與對照載體轉染的細胞相比，RGNNV感染的CCR6a過表達細胞中RGNNV CP(圖5A)和RdRp(圖5B)基因的表達量顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明CCR6a對RGNNV感染具有抵抗作用。

3 討論

本研究通過克隆獲得斜帶石斑魚CCR6a基因ORF序列，其序列全長為1 131 bp，編碼376個氨基酸，通過TMHMM Server V.2.0預測含有7個跨膜結構域，具有G蛋白偶聯(lián)受體的典型特征。斜帶石斑魚CCR6a序列與其他物種同源性分析發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚CCR6a與大多數(shù)魚類的同源性比較高。系統(tǒng)進化樹分析表明斜帶石斑魚CCR6a與鞍帶石斑魚聚為一支。組織表達分析顯示，CCR6a在腎臟、鰓和皮膚等免疫組織中有較高的表達。在斑馬魚(Daniorerio)中，CCR主要在大腦和免疫系統(tǒng)中表達[24]；在大西洋鮭(Salmosalar)中，CCR在脾臟和鰓中表達最高[25]；在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中，CCR表達水平最高的部位是胸腺和脾臟[26]，本研究發(fā)現(xiàn)的CCR6a在腎臟、鰓和皮膚中高表達，與其他魚類中關于CCR在免疫器官高表達結果一致。這些研究結果表明，魚類CCR可能在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。近年來趨化因子受體在脊椎動物免疫應答中的作用備受關注[25，27]，已有許多研究表明趨化因子受體CCR6與機體的各類疾病有著密切的聯(lián)系[28-31]，但是關于趨化因子在魚類中的免疫反應，尤其是對病原入侵中的作用知之甚少，因此了解趨化因子受體在魚類病原體防御中的作用至關重要。

在魚類中，有研究表明CCR6a對抵抗細菌和寄生蟲的感染有重要作用，在大菱鲆(Scophthalmusmaximus)中，CCR6a對減少殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)感染有重要作用[32]，在斜帶石斑魚中發(fā)現(xiàn)CCR6可能在刺激隱核蟲引起的炎癥時免疫細胞向皮膚黏膜免疫組織的歸化過程中發(fā)揮重要作用[33]。前期研究表明CCR在細菌和寄生蟲感染中起著重要作用，而CCR6a作為CCR家族中的重要成員，在病毒感染中也起著重要作用。在人類中，有研究表明CCR6作為一種新的輔受體參與HIV和SIV毒株的入侵[34]，此外CCR6/CCL20趨化因子軸在HIV發(fā)病和免疫中發(fā)揮重要作用[35]。在魚類中還沒有CCR6與病毒入侵和抗病毒方面的研究，但是有大量研究表明趨化因子家族對魚類病毒的入侵和抗病毒免疫反應的初始階段起著重要作用[36-38]。本研究發(fā)現(xiàn)在石斑魚中CCR6a過表達顯著抑制RGNNV復制，CCR6a作為膜蛋白可能阻止了病毒的入侵，從而降低病毒在細胞內(nèi)的總量，也有可能如之前的研究發(fā)現(xiàn)，CCR可以通過誘導石斑魚細胞中IFN調(diào)控因子顯著增加和提高ISRE、IFN啟動子活性，從而提高干擾素生產(chǎn)來抵抗病毒[39]，但是這需要進一步的研究證實?？傮w來說，本研究結果提示CCR6a可能是魚類重要的抗病毒因子之一。

魚類病毒性神經(jīng)壞死病是由神經(jīng)壞死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)引起的一種全球范圍的魚類流行性傳染病。其中，RGNNV主要感染石斑魚、鱸魚等海水魚類，一旦感染，死亡率可達100%，對石斑魚養(yǎng)殖危害很大[40-42]。本研究探索斜帶石斑魚CCR6a基因的表達及其對RGNNV的作用情況，為斜帶石斑魚的抗病免疫等方面的研究提供一定的基礎。近年來，關于魚類趨化因子及其受體的研究逐漸增多，越來越多的魚類趨化因子被鑒定報道。目前有許多研究表明CCR6在免疫調(diào)節(jié)中扮演著重要的角色，探索其作用機制對相關疾病的免疫治療具有非常重要的意義。

4 結論

本研究從斜帶石斑魚組織中克隆出了CCR6a基因的ORF序列，并對其序列和進化關系進行了分析，同時研究了其組織分布、亞細胞定位和抗病毒情況。結果表明，斜帶石斑魚CCR6a基因ORF序列全長為1 131 bp，編碼376個氨基酸；進化樹分析發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚CCR6a與同為石斑魚屬的鞍帶石斑魚聚為一支；組織分布研究表明，斜帶石斑魚CCR6a在免疫組織中的表達水平顯著高于非免疫組織；利用熒光顯微鏡對其亞細胞定位分析表明，該基因為膜分布；此外，過表達顯著抑制了體外RGNNV的復制。研究結果將有助于理解魚類趨化因子在病毒感染中的作用。