宋聲雷，許開武，胡鴻運(yùn)，李成龍，李光義，陳超武

（湖南省人民醫(yī)院，湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科，湖南 長沙 410000）

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是臨床常見的惡性腫瘤之一，2020 年全球新發(fā)CRC 1 880 725例，死亡915 880 例，發(fā)病率及死亡率在所有腫瘤中分別排第3 位和第2 位，發(fā)病率高，預(yù)后差[1]。有研究指出，接近50% 的CRC 是可以預(yù)防的[2]，探究CRC 危險(xiǎn)因素以及預(yù)防、治療方案具有重要的意義。平均紅細(xì)胞體積（Mean corpuscular volume, MCV）是血常規(guī)指標(biāo)之一，由紅細(xì)胞比容和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算得出，它是判斷紅細(xì)胞平均大小的直接指標(biāo)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，高M(jìn)CV 與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]，此外，還有研究發(fā)現(xiàn)高M(jìn)CV 與CRC 和肝癌的預(yù)后之間存在關(guān)聯(lián)[5-6]。然而，這些關(guān)聯(lián)是否確實(shí)存在，以及存在正相關(guān)還是負(fù)相關(guān)，仍然存在爭議。傳統(tǒng)的流行病學(xué)觀察研究在發(fā)現(xiàn)疾病病因和推斷因果關(guān)系方面存在許多局限，如反向因果關(guān)系、混雜因素和微觀有效暴露因素的存在，導(dǎo)致了推斷表型和疾病之間聯(lián)系的局限性。孟德爾隨機(jī)化（Mendelian randomization,MR）作為一種新的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，基于“親代等位基因隨機(jī)分配給子代”的孟德爾遺傳規(guī)律，使用與暴露因素有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）位點(diǎn)作為工具變量（instrumental variables,IVs）來驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)因素與結(jié)果之間的因果關(guān)系[7-8]。在本研究中，我們應(yīng)用兩樣本MR 方法來評估MCV 與CRC 之間的關(guān)系，為MCV 與CRC 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)提供遺傳學(xué)方面的支持。

1 研究資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)及研究設(shè)計(jì)

確認(rèn)MCV 為暴露變量，CRC 為結(jié)局變量，搜索IEU Open GWAS 數(shù)據(jù)庫（https://gwas.mrcieu.ac.uk），得到來自日本生物銀行（BioBank Japan , BBJ）[9-10]的暴露（bbj-a-40）及結(jié)局（bbj-a-76）變量的全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）數(shù)據(jù)。MCV 樣本量及SNP 數(shù)分別為108 256、6 108 953，CRC 樣本量及SNP 數(shù)分別為33 870（病例組6692，對照組27 178）、7 492 477。上述GWAS 數(shù)據(jù)來自亞洲人群。

1.2 篩選工具變量

以P＜5×10-8為篩選條件，挑選與暴露因素強(qiáng)相關(guān)的SNPs 作為工具變量。以r2＜0.001，距離10 000 kb 為篩選條件，消除連鎖不平衡所帶來的偏倚[11]，以保證各個(gè)SNP 之間相互獨(dú)立，排除基因多效性對結(jié)果的影響。通過設(shè)置SNP 的F值＞10，去除弱工具變量。利用PhenoScanner 數(shù)據(jù)庫去除與混雜因素有關(guān)的工具變量。

1.3 MR 分析

利用5 種常用方法進(jìn)行MR 分析，即逆方差加權(quán)法（inverse variance weighted，IVW）[12]、MR-Egger回歸法[13]、加權(quán)中位數(shù)法（weighted median）[14]、基于眾數(shù)的加權(quán)估計(jì)（weighted mode）以及基于眾數(shù)的簡單估計(jì)法（simple mode）。使用Cochran’s Q 檢驗(yàn)進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，如異質(zhì)性檢驗(yàn)P值小于0.05，證明分析結(jié)果具有異質(zhì)性，則重點(diǎn)關(guān)注隨機(jī)效應(yīng)IVW 法的結(jié)果，因?yàn)镮VW 方法為隨機(jī)效應(yīng)模型，存在異質(zhì)性并不影響結(jié)果解讀；使用Egger-intercept 檢驗(yàn)進(jìn)行水平多效性檢驗(yàn)；MR-PRESSO 方法可以檢測并校正離群的SNP ；以留一法檢驗(yàn)作為敏感性分析方法。以上MR 分析通過使用R 4.3.1 軟件中的TwoSampleMR包實(shí)現(xiàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 研究結(jié)果

2.1 工具變量的篩選

達(dá)到顯著差異的工具變量共10 609 個(gè)，排除連鎖不平衡影響后，篩選出SNP 共109 個(gè)作為有效工具變量，所有工具變量的F值均大于10。根據(jù)PhenoScanner 數(shù)據(jù)庫去除與混雜因素相關(guān)的工具變量（吸煙：rs12027999 ；炎性腸?。簉s2524100、rs12412214 ；體重指數(shù)：rs1047891、rs11525583、rs2278557）。最終，被納入為MCV 工具變量的SNP共103 個(gè)。

2.2 MR 分析結(jié)果

我們從MR 分析的森林圖可以看出（圖1A），下面紅色的部分，是所有SNP 的綜合結(jié)果，其在0 的右側(cè)，說明在使用MR Egger 和IVW 法下，MCV 的升高會增加CRC 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。IVW 作為MR 的主要分析方法，結(jié)果表明，MCV 水平與CRC 存在相關(guān)性（OR=1.171，95% CI:1.048 ～1.308，P=0.005）。MR Egger（OR=1.380，95% CI:1.101 ～ 1.731，P=0.006）、Weighted median（OR=1.332，95%CI:1.133 ～ 1.567，P＜0.001）、Weighted mode（OR=1.379，95% CI:1.113 ～1.708，P=0.004） 方法與IVW 方法分析的結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了MCV 水平與CRC 的相關(guān)性。Simple mode 分析結(jié)果（OR=1.335，95% CI:0.937 ～1.902，P=0.113）與上述分析結(jié)果存在差異。5 種方法得到的因果效應(yīng)方向及結(jié)果基本一致（圖1B，圖1C）。

2.3 異質(zhì)性、水平多效性及敏感性檢驗(yàn)

由MR 的漏斗圖（圖2A）可見，所有納入的SNP 基本對稱，故以這些SNP 作為工具變量分析的結(jié)果比較穩(wěn)定，提示受到潛在偏倚影響的可能性較小。異質(zhì)性分析Cochran’s Q 檢驗(yàn)結(jié)果Q=155.690，P＜0.001，提示SNP 之間存在異質(zhì)性，故我們重點(diǎn)關(guān)注IVW 方法的檢驗(yàn)結(jié)果。多效性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，MR-Egger 回歸的截距分別為-0.0098，接近于0(P＞0.05)，提示MR 分析結(jié)果不受水平多效性影響。MR-PRESSO 模型未發(fā)現(xiàn)離群SNP（P值均大于0.05）。采用留一法分析（圖2B），剔除單個(gè)SNP 后，MR 的分析結(jié)果均未出現(xiàn)明顯波動(dòng)，說明本研究中MR 結(jié)果是穩(wěn)定的。

3 討論

近年來，CRC 的發(fā)病率逐年升高，造成了較重的社會負(fù)擔(dān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，多種危險(xiǎn)因素與CRC的發(fā)病及預(yù)后有關(guān)，包括體重指數(shù)[15]、吸煙[16-17]等，針對上述風(fēng)險(xiǎn)因素的一級和二級預(yù)防策略可能在預(yù)防和控制CRC 方面發(fā)揮重要作用。然而，除了上述危險(xiǎn)因素外，我們還需要進(jìn)一步探究一些新型的、檢測方便的CRC 危險(xiǎn)因素，如血細(xì)胞相關(guān)的一些分析數(shù)據(jù)。

MCV 是血常規(guī)檢測中的常用指標(biāo)，是指單個(gè)紅細(xì)胞的平均體積，以飛升(fL) 為單位。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，MCV 參與了多種腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[18-19]。一項(xiàng)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，570 例接受了食管癌根治術(shù)的患者中，高M(jìn)CV（＞99 fL）組患者的總生存期（Overall survival，OS）較MCV 正常組（83 ～99 fL）短，高M(jìn)CV 是食管癌患者預(yù)后較差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[20]。Nagai 等[6]對1174 例進(jìn)行了R0 切除的Ⅰ～Ⅲ期CRC患者進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，無論是否行術(shù)后輔助化療，術(shù)前MCV 較低（＜80 fL）患者的無病生存期（diseasefree survival，DFS）均優(yōu)于MCV 較高（80 ～100 fL）的患者。

本研究中通過使用GWAS 數(shù)據(jù)和MR 分析，為上述推論提供了更確切的依據(jù)，確定了MCV 和CRC之間的因果關(guān)系。與隨機(jī)對照試驗(yàn)相比，MR 的樣本量大，試驗(yàn)設(shè)計(jì)也更接近隨機(jī)分配。與回顧性研究相比，MR 受反向因果關(guān)系的干擾更少。本研究證明了MCV 與CRC 之間存在正向因果關(guān)系（OR=1.171，95% CI:1.048 ～1.308，P=0.005），這與觀察性研究的結(jié)論一致，豐富了人們對CRC 危險(xiǎn)因素的認(rèn)識。

當(dāng)然，本研究仍存在一定的局限性：首先，本研究中的數(shù)據(jù)主要來自亞洲人群，因此研究結(jié)果可能無法推廣到其他人群，未來需要更多的研究來驗(yàn)證我們的研究成果在其他人群和種族中的適應(yīng)性。其次，MCV 的測量值一定程度上受到了不同檢測設(shè)備的影響，這可能導(dǎo)致結(jié)果存在一定的偏倚。

綜上所述，本研究應(yīng)用MR 方法得到了MCV 和CRC 的因果關(guān)系，初步證明了MCV 水平的升高增加了患CRC 的風(fēng)險(xiǎn)。然而MCV 是如何影響CRC 的，未來仍需更多的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。