黃欣桐，王李寶，黎慧，史文軍，陳孝煊，萬(wàn)夕和

（1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

喹諾酮類藥物具有廣譜抗菌、殺菌效果好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，常被用于防治水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌感染。但在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，喹諾酮類藥物的使用會(huì)導(dǎo)致藥物殘留，影響水產(chǎn)品質(zhì)量[1]。中國(guó)、歐盟、美國(guó)和日本等，已將喹諾酮列為動(dòng)物獸藥禁止使用藥物產(chǎn)品名單，并規(guī)定了最高殘留量。水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物的殘留和控制，是該領(lǐng)域發(fā)展迫切需要解決的問(wèn)題之一。在養(yǎng)殖過(guò)程中，一些養(yǎng)殖主體忽視用藥安全，濫用喹諾酮類藥物，導(dǎo)致藥物殘留超標(biāo)。而食用殘留超標(biāo)的水產(chǎn)品，可能導(dǎo)致生物腸道菌群失衡，甚至有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)[2]。目前已有關(guān)于喹諾酮類藥物毒性[3]、殘留限值和殘留測(cè)定方法[4]方面的研究報(bào)道，為合理、科學(xué)使用喹諾酮類藥物，防止耐藥性的產(chǎn)生提供了參考依據(jù)。

現(xiàn)簡(jiǎn)述喹諾酮類藥物的使用管理現(xiàn)狀、藥物殘留樣品前處理方法、最新檢測(cè)技術(shù)，擬為喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)相關(guān)研究提供參考。

1 喹諾酮類藥

喹諾酮類藥物是一類常見(jiàn)的人畜共用的人工合成類抗菌藥，在國(guó)際上被譽(yù)為最重要的高效廣譜抗菌藥。因其結(jié)構(gòu)中含有氟原子，稱之為氟喹諾酮類抗生素（FQs），目前已發(fā)展到第四代。抑菌機(jī)理為通過(guò)抑制DNA 螺旋酶而達(dá)到抑菌作用。目前使用最多的是第三代氟喹諾酮類抗生素，主要包括環(huán)丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFL）、洛美沙星（LOM）、恩諾沙星（ENR）等。此類抗生素因抗菌譜廣、抗菌性強(qiáng)、口服吸收好等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于人類及動(dòng)物疾病治療。

根據(jù)發(fā)明順序及其抗菌譜喹諾酮類藥物分為四代：第一代產(chǎn)品主要對(duì)痢疾大腸桿菌、大腸桿菌、克雷白桿菌和部分變形桿菌有抗菌活性；第二代產(chǎn)品具有廣泛的抗菌譜，對(duì)綠膿桿菌、腸桿菌科、馬氏沙雷桿菌具有一定抗菌活性；第三代產(chǎn)品的抗菌譜進(jìn)一步擴(kuò)大，包括革蘭陽(yáng)性、陰性菌；第四代引入8-甲氧基，加強(qiáng)了抗厭氧菌活性，抗菌譜進(jìn)一步擴(kuò)大到衣原體、支原體等病原體，且藥物的不良反應(yīng)更小[5]。歷代喹諾酮藥物的優(yōu)、缺點(diǎn)及抗菌譜差異見(jiàn)表1。

表1 歷代喹諾酮藥物的優(yōu)缺點(diǎn)、抗菌譜差異

2 使用現(xiàn)狀

1980 年，抗生素開(kāi)始在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用，主要用來(lái)控制病原微生物，減少養(yǎng)殖對(duì)象的感染風(fēng)險(xiǎn)。起初抗生素主要用于具有重要經(jīng)濟(jì)效益的養(yǎng)殖品種，1990 年后，其使用范圍逐步擴(kuò)大，大多數(shù)海水和淡水養(yǎng)殖品種均有使用[13]。

2018 年，我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)使用的獸用抗菌藥有69 種，其中10 種為氟喹諾酮類藥物，占總量的14.5%。在獸用抗菌藥的使用品種和數(shù)量上，氟喹諾酮類與β-內(nèi)酰胺類及抑制劑類、磺胺及增效劑類并列第一[14]。喹諾酮類藥物在畜禽、水產(chǎn)、蠶等養(yǎng)殖動(dòng)物中均有使用。其藥物代謝特點(diǎn)與使用對(duì)象及給藥途徑有密切關(guān)系，同時(shí)這些也影響著藥物的吸收速度、數(shù)量及作用強(qiáng)度。1982—2000 年，水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的抗生素藥物在我國(guó)逐步研制成功[15]。目前，越南和中國(guó)使用抗生素的種類較多，分別為31 種和17 種，以特色水產(chǎn)養(yǎng)殖為主且養(yǎng)殖強(qiáng)度較低的國(guó)家，如印度尼西亞和孟加拉國(guó)，使用抗生素的種類較少。水產(chǎn)養(yǎng)殖中允許使用的喹諾酮類藥物種類見(jiàn)表2。

為降低水產(chǎn)品中喹諾酮類藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)，各國(guó)對(duì)部分藥物設(shè)定了限量標(biāo)準(zhǔn)，美國(guó)則禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用抗菌喹諾酮類藥物。2015 年9 月1 日起，中華人民共和國(guó)原農(nóng)業(yè)部公告第2292 號(hào)明確停止使用洛美沙星等4 種家畜用獸藥，并撤銷有關(guān)獸藥上市許可文號(hào)[17]?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中規(guī)定，喹酸的最大殘留限量為100 μg/kg；《無(wú)公害食品 水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》（NY 5070—2002）中，也對(duì)喹諾酮類藥物的使用作出了規(guī)定（表3）。

表3 喹諾酮類藥物使用限量

3 藥物殘留檢測(cè)前處理方法

3.1 液液萃取法

液液萃取法是一種分離過(guò)程，是利用各組分在2 個(gè)不相溶（或僅部分相溶）的液相中的不同溶解度，將它們從一個(gè)液相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)液相。2021 年，楊霄等[18]運(yùn)用鹽析輔助液液萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，測(cè)定漁業(yè)水體中7 種喹諾酮類抗生素含量。2015 年，黃培婷等[19]采用固相分散萃取-液態(tài)微萃取結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，建立了快速、靈敏、簡(jiǎn)便的測(cè)定各種水基中殘留抗生素的方法。

3.2 固相萃取法

固相萃取法的目的是減少樣品中雜質(zhì)的干擾，提高測(cè)定的靈敏度。2021 年，梁思慧等[20]建立一種新型的固相萃取前處理方法，該方法的基質(zhì)凈化能力顯著升高，再結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，檢測(cè)出淡水魚(yú)中四環(huán)素和氟喹諾酮?dú)埩簟?022 年，丁紫榮等[21]采用固相萃取-液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（SPE-LC-MS/MS）技術(shù)，建立了養(yǎng)殖尾水中17 種氟喹諾酮類抗生素（FQs）的測(cè)定方法，以養(yǎng)殖尾水為基質(zhì)，17 種FQs 的加標(biāo)回收率為47.8%～118.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜20%（n=6）。

3.3 凝膠滲透色譜法

凝膠滲透色譜法的分離過(guò)程，是在一個(gè)充滿多孔物質(zhì)的柱子上進(jìn)行。填料顆粒包含許多不同大小的孔洞，不同分子質(zhì)量的聚合物分子，被淋洗溶液的流出物，按分子質(zhì)量從大到小分開(kāi)。2016 年，吳兆鳳等[22]建立了凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（GPC-GC-MS/MS），測(cè)定奶粉中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的分析方法，采用凝膠滲透色譜技術(shù)，成功檢測(cè)出有機(jī)氯農(nóng)藥殘留。

3.4 QuEChERS 萃取法

QuEChERS 的方法本質(zhì)上是振蕩萃取、液液預(yù)處理和基質(zhì)分散的固相萃取的組合，從而實(shí)現(xiàn)了樣品預(yù)處理。楊金易等[23]采用新型QuEChERS 前處理技術(shù)與酶聯(lián)免疫法結(jié)合，快速檢測(cè)水產(chǎn)品中3種喹諾酮類殘留。章紅等[24]以QuEChERS 樣品預(yù)處理方法、四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜（Q-TOF MS）為檢測(cè)手段，建立了典型水產(chǎn)品中的15 種喹諾酮類藥物殘留的快速篩查方法。

3.5 分子印跡固相萃取方法

分子印跡技術(shù)是基于模擬抗原-抗體、酶-底物等生物分子識(shí)別特異性的仿生分子識(shí)別技術(shù)[25-26]，是一種制備具有分子特異識(shí)別功能聚合物的技術(shù)。分子印跡聚合物可以對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行特異性選擇，使其能夠分離復(fù)雜樣品中的特定成分，具有較高的儲(chǔ)存能力，可以從環(huán)境中吸收低濃度的目標(biāo)化學(xué)品，具有較高的檢測(cè)靈敏度。劉芃巖等[27]同時(shí)以左氧氟沙星和環(huán)丙沙星為模板分子，合成了復(fù)合模板分子印跡聚合物，可同時(shí)測(cè)定魚(yú)肉中10 種FQs含量，可以滿足水產(chǎn)品中FQs 類藥物的確證和多殘留分析的要求。2019 年，王瑞等[28]建立了同時(shí)測(cè)定雞肉中16 種喹諾酮類藥物殘留的分子印跡固相萃?。∕ISPE）-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測(cè)方法，該方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單、快速。

3.6 固相微萃取法

固相微萃取法的基礎(chǔ)，是使用涂有固相的石英玻璃纖維來(lái)吸附和聚集樣品中被測(cè)物質(zhì)。2010 年，孫福江等[29]建立了頂空固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合氣相質(zhì)譜（GG-MS），檢測(cè)蘋(píng)果中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法。

以上6 種喹諾酮類藥物檢測(cè)的前處理方法各有優(yōu)缺點(diǎn)（表4）。研究和分析人員必須針對(duì)需要檢測(cè)的喹諾酮類藥物的特性和試驗(yàn)?zāi)康?，選擇合適的樣品處理方法，以期獲得快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)結(jié)果。

表4 喹諾酮藥物樣品前處理方法的優(yōu)缺點(diǎn)[30-31]

4 檢測(cè)技術(shù)

4.1 酶聯(lián)免疫吸附分析法

酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）是使用最廣泛的免疫測(cè)定方法。在基本方法中，已知的抗原或抗體被吸附在一個(gè)固相支持物的表面上，酶標(biāo)抗原-抗體反應(yīng)就在固相的表面上進(jìn)行，而液相中游離的部分被洗掉。最常用的ELISA 法是雙抗體夾心法，用于檢測(cè)大分子抗原，間接法用于檢測(cè)特定的抗體[32]。王強(qiáng)等[33]建立了檢測(cè)水產(chǎn)品中氟喹諾酮類藥物殘留的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析方法。

4.2 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析法（GICT），是一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合在一起的固相標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù)。以膠體金為標(biāo)記物，與待測(cè)物的絡(luò)合物被相應(yīng)的配體捕獲而濃集顯色,以纖維膜上顯色帶的有無(wú)進(jìn)行定性檢測(cè)。2018 年，宗婧婧等[34]采用膠體金免疫層析法，水產(chǎn)樣品用0.1%甲酸乙腈溶液提取，正己烷除脂，膠體金試紙條檢測(cè)，檢測(cè)出15 種喹諾酮類藥物。2021 年，羅梅霞[35]制備的抗FQs 單克隆抗體M4E3 洛美沙星、氧氟沙星和恩諾沙星等8 種FQs，有較高的交叉反應(yīng)率，基于此抗體所建立的膠體金免疫層析法，可以在現(xiàn)場(chǎng)快速靈敏地檢測(cè)豬肉和鴨肉中的這8 種FQs。

4.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPIC）是一種以高壓液體作為流動(dòng)相、以傳統(tǒng)液相為基礎(chǔ)的色譜過(guò)程。日常所說(shuō)的柱色譜法、薄層色譜法或紙色譜法是經(jīng)典的液相色譜法。在這些方法中，＞100 mm 的吸附材料（硅膠、氧化鋁等）被用作固定相。朱品玲等[36]應(yīng)用HPIC法，建立了測(cè)定水產(chǎn)品肌肉中4 種喹諾酮類殘留量的方法，采用乙腈-二氯甲烷（4∶3，V/V），為提取液，濃縮至干，用20%乙腈水溶解殘留物。

4.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是一種將多種高效組成成分都定量于一體的分析方法，對(duì)高沸點(diǎn)、不具有揮發(fā)性和對(duì)熱不穩(wěn)定性的極性化合物進(jìn)行分離檢測(cè)和含量分析。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法主要用于強(qiáng)極性、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定性的化學(xué)物。Meng 等[37]測(cè)定了牛奶中8 種氟喹諾酮類藥物含量，建立了低于最大殘留量濃度的多殘留分析方法。Magda 等[38]僅用0.5 mL 有機(jī)溶劑萃取樣品，在0.25～2.0 mL 內(nèi)回收率良好；以600 多個(gè)牛奶樣品對(duì)檢測(cè)限、定量限和適用性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果均良好。梁晶晶等[39]應(yīng)用最新型的固相萃?。≒RiME HLB）凈化技術(shù)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS），建立了水產(chǎn)品中19 種喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)方法。

4.5 化學(xué)發(fā)光免疫分析法

化學(xué)發(fā)光免疫分析法由2 部分組成，一個(gè)免疫反應(yīng)系統(tǒng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析在國(guó)內(nèi)畜禽領(lǐng)域的應(yīng)用相對(duì)較多，在水產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用相對(duì)較少。2008 年，官婷婷[40]利用鹽酸四環(huán)素本身沒(méi)有化學(xué)發(fā)光且會(huì)使化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光明顯消失的性質(zhì)，對(duì)人類晨尿樣品中的鹽酸四環(huán)素進(jìn)行了檢測(cè)。

為進(jìn)一步了解樣品檢測(cè)的便捷性、準(zhǔn)確性和檢測(cè)成本等因素，對(duì)比不同的檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)（表5），選擇合適的喹諾酮類藥物檢測(cè)方法，以期在較短時(shí)間內(nèi)，獲得準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)結(jié)果，為下一步抗生素的使用和管理提供有效的數(shù)據(jù)支撐。

5 結(jié)語(yǔ)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色健康發(fā)展的推進(jìn)，在預(yù)防和治療養(yǎng)殖對(duì)象的疾病中，抗生素依舊起著重要作用，因此抗生素使用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性[44-46]、環(huán)境污染及水產(chǎn)品抗生素的殘留問(wèn)題[47]依然存在。在水產(chǎn)品喹諾酮類藥物殘留檢測(cè)中，用于樣品前處理的固相萃取[48-49]和QuEChERS[50-51]方法，檢測(cè)成本低、效率高；用于樣品檢測(cè)的高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫法等[52]，目前使用最廣泛的為高效液相色譜法。