孫澤薈，李杰，鈕小童，馬曉，于晶陽(yáng)，劉宇杰

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（泰安 271018）

隨著人們對(duì)健康重視程度的不斷深化，人們追求著更加平衡的膳食模式，對(duì)健康食品的需求也日益凸顯[1]。酸奶因其具有改善腸胃、預(yù)防心血管疾病等保健功效[2-4]，從而受到廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。如今，消費(fèi)者正努力尋求口味和健康之間的平衡，不含膽固醇和乳糖的植物型發(fā)酵乳不僅其產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性與動(dòng)物型發(fā)酵乳基本相同，并且口感順滑，更易被人體吸收，從而受到乳糖不耐受者和健康食品消費(fèi)人群的喜愛(ài)[5-7]。

椰漿中含有豐富的中鏈脂肪酸[8]，在食物中以中鏈甘油三酯的形式存在，可以快速產(chǎn)生能量卻又不易轉(zhuǎn)化為脂肪，有助于快速能量補(bǔ)給和促進(jìn)運(yùn)動(dòng)疲勞恢復(fù)[9]，并且具有良好的抗真菌、抗氧化、降血糖、降血壓、抗炎及抗腫瘤等營(yíng)養(yǎng)特性和藥用價(jià)值[10-13]，由此選用椰漿作為發(fā)酵原料。

赤蘚糖醇因其具有熱量低、無(wú)致齲齒性、無(wú)吸濕性、耐消化性等功能特點(diǎn)[14]，受到越來(lái)越多消費(fèi)者的青睞。研究表明，赤蘚糖醇在酸性環(huán)境下具有穩(wěn)定性，在提高甜度、厚重感、滑潤(rùn)感及降低苦澀感方面有顯著作用[15-16]，因此通過(guò)探究赤蘚糖醇添加量對(duì)椰漿發(fā)酵乳品質(zhì)的影響以優(yōu)化現(xiàn)有椰漿發(fā)酵乳的加工工藝。

在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，易被主觀因素干預(yù)的傳統(tǒng)感官品評(píng)法，存在感官評(píng)價(jià)界定不準(zhǔn)確的弊端，約束對(duì)椰漿發(fā)酵乳的準(zhǔn)確量化評(píng)價(jià)[17-18]。試驗(yàn)依靠模糊數(shù)學(xué)理論，構(gòu)建模糊矩陣對(duì)感官評(píng)價(jià)信息進(jìn)行量化評(píng)價(jià)，達(dá)到使評(píng)價(jià)結(jié)果更為精準(zhǔn)、客觀的目的[17]，從而改良椰漿植物型發(fā)酵乳的最佳工藝配方。

試驗(yàn)通過(guò)制備以椰漿為主料植物型發(fā)酵乳，闡述發(fā)酵乳與赤蘚糖醇的量效關(guān)系，依靠模糊數(shù)學(xué)理論耦合響應(yīng)面評(píng)價(jià)法，根據(jù)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果以確定添加赤蘚糖醇的椰漿植物基發(fā)酵乳的最佳工藝配方，為開(kāi)發(fā)新型椰漿發(fā)酵乳提供方法支持，旨在擴(kuò)大椰漿發(fā)酵乳市場(chǎng)、豐富酸奶品種、擴(kuò)寬發(fā)酵乳受眾人群、增加發(fā)酵行業(yè)活力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Kara椰漿（新加坡三務(wù)集團(tuán)有限公司）；赤蘚糖醇（市售）；混合發(fā)酵菌種（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、開(kāi)菲爾菌種，廣東順德尚川生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Neofuge 15R高速冷凍離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；FJ200-S均質(zhì)機(jī)（力辰科技有限公司）；DHP-9162恒溫發(fā)酵箱（上海一恒股份有限公司）；FE-28雷磁型pH計(jì)（梅特勒托利多有限公司）；UV-5200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；BC-71JA冰箱（浙江星星家電股份有限公司）；HT-3磁力攪拌器（常州國(guó)華電器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）。

1.3 工藝流程

預(yù)處理→巴氏殺菌→冷卻→接種→發(fā)酵→后熟→品質(zhì)監(jiān)控

1.4 操作要點(diǎn)

1.4.1 預(yù)處理

將新鮮椰漿高壓均質(zhì)機(jī)預(yù)熱至60 ℃，在20 MPa壓力下進(jìn)行均質(zhì)。

1.4.2 巴氏殺菌

迅速置于蒸汽鍋中，于60~85 ℃滅菌10~20 s。

1.4.3 接種

冷卻至室溫后接種混合發(fā)酵菌種。

1.4.4 發(fā)酵

于42 ℃恒溫發(fā)酵培養(yǎng)一定時(shí)間后冷卻至室溫25 ℃左右。

1.4.5 后熟

將椰漿發(fā)酵乳低溫保藏于4 ℃冰箱。

1.5 單因素試驗(yàn)

1.5.1 發(fā)酵時(shí)間

在赤蘚糖醇添加量0.6%、乳酸菌接種量1%、4 ℃儲(chǔ)藏時(shí)間4 h條件下發(fā)酵，探究在42 ℃恒溫發(fā)酵時(shí)間分別為4，6，8，10和12 h時(shí)對(duì)椰漿發(fā)酵乳感官品質(zhì)的影響，通過(guò)設(shè)計(jì)構(gòu)建的模糊數(shù)學(xué)理論模型獲得模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)。

1.5.2 接種量

在赤蘚糖醇添加量0.6%、42 ℃恒溫發(fā)酵時(shí)間10 h、4 ℃儲(chǔ)藏時(shí)間4 h條件下發(fā)酵，探究接種混合乳酸菌分別為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%時(shí)對(duì)椰漿發(fā)酵乳感官品質(zhì)的影響，通過(guò)設(shè)計(jì)構(gòu)建的模糊數(shù)學(xué)理論模型獲得模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)。

1.5.3 赤蘚糖醇添加量

在42 ℃恒溫發(fā)酵時(shí)間10 h、乳酸菌接種量1%、4 ℃儲(chǔ)藏時(shí)間4 h的條件下發(fā)酵，探究赤蘚糖醇添加量分別為0，0.2%，0.4%，0.6%和0.8%時(shí)對(duì)椰漿發(fā)酵乳感官品質(zhì)的影響，通過(guò)設(shè)計(jì)構(gòu)建的模糊數(shù)學(xué)理論模型獲得模糊數(shù)學(xué)感官評(píng)價(jià)。

1.6 理化指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 蛋白質(zhì)含量

稱取0.1 g考馬斯亮藍(lán)G250溶于50 mL 95%乙醇，加入100 mL 85%（W/V）磷酸，用去離子水定容至1 000 mL并稀釋，吸取1 mL待測(cè)液，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G250充分混合，放置2 min后，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線確定發(fā)酵乳蛋白質(zhì)含量[19]。

采用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.6.2 脂肪含量[20]

稱取10 g椰漿發(fā)酵乳（m）置于100 mL分液漏斗中，分別加入2.5 mL氨水、10 mL 95%乙醇混勻，加入15 mL乙醚振搖1 min、15 mL石油醚振搖1 min，靜置分層。下層的殘液棄去，上層的醚液通過(guò)無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾入稱好質(zhì)量（m1）的燒杯中，用少量無(wú)水乙醚淋洗無(wú)水硫酸鈉，將燒杯置放入40~80 ℃水浴中蒸除醚液，于100 ℃干燥30 min，冷卻后稱重m2，酸奶的脂肪含量（mg/100 g）按式（1）計(jì)算。

式中：m為稱取椰漿發(fā)酵乳總質(zhì)量；m1為燒杯質(zhì)量；m2為冷卻后燒杯及內(nèi)容物的總質(zhì)量。

1.6.3 pH和酸度[21]

取10 g椰漿發(fā)酵乳于250 mL錐形瓶中，加入20 mL約20 ℃去離子水稀釋。使用滴定管將氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液加于錐形瓶中，當(dāng)pH穩(wěn)定于8.30±0.01處4~5 s時(shí)停止滴加。整個(gè)過(guò)程始終用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌并且在1 min內(nèi)完成滴定。

1.6.4 持水力[20]

取約20 g椰漿發(fā)酵乳置于50 mL離心管中，精確稱量并記錄質(zhì)量W1，以3 500 r/min離心（4 ℃）30 min，棄去上清液，精確稱量并記錄質(zhì)量W2，平行測(cè)定3次，持水性按式（2）計(jì)算。

式中：W1為椰漿發(fā)酵乳置于離心管質(zhì)量；W2為離心后去除上清液后質(zhì)量。

1.7 感官評(píng)定

參照感官評(píng)價(jià)相關(guān)資料，設(shè)計(jì)椰漿發(fā)酵乳的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。針對(duì)椰漿發(fā)酵乳的口感、色澤、組織狀態(tài)3個(gè)方面，由10名食品專業(yè)人員（5男5女）構(gòu)成的感官評(píng)價(jià)組進(jìn)行百分制綜合評(píng)價(jià)。

1.8 模糊數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，以色澤（x1）、口感（x2）和組織結(jié)構(gòu)（x3）為指標(biāo)建立評(píng)價(jià)因素集X={x1，x2，x3}；以100分為滿分，90~100分為等級(jí)優(yōu)，70~90分為等級(jí)良，70分以下為等級(jí)差，建立評(píng)語(yǔ)集V={v1，v2，v3}，具體的感官評(píng)定細(xì)則見(jiàn)表1。根據(jù)感官評(píng)定小組的評(píng)定結(jié)果，用模糊數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析。

表1 酸奶的感官評(píng)分表

1.9 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面法分析發(fā)酵工藝中各因素對(duì)感官評(píng)分的影響及各因素間的相互影響，進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化。以發(fā)酵時(shí)間、接種量、赤蘚糖醇添加量為影響因素，感官評(píng)分為響應(yīng)值，通過(guò)Design Expert 8.0軟件，對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析。設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分的影響

由圖2可見(jiàn)，發(fā)酵時(shí)間10 h時(shí)，產(chǎn)品的感官評(píng)分最高。發(fā)酵時(shí)間短于10 h感官評(píng)分較低，其原因是發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，椰漿發(fā)酵乳酸度較低，凝乳效果差，其中香氣和部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)受到影響。發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)于10 h時(shí)，椰漿發(fā)酵乳偏酸，有輕微的乳清析出分層現(xiàn)象，并且發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致時(shí)間成本浪費(fèi)。故發(fā)酵時(shí)間選取10 h。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分的影響

2.1.2 發(fā)酵劑接種量對(duì)感官評(píng)分的影響

由圖3可知，椰漿發(fā)酵乳發(fā)酵劑接種量決定酸奶發(fā)酵成型時(shí)間[22]。發(fā)酵劑接種量過(guò)小，酸奶發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，組織結(jié)構(gòu)松軟，口感較差，無(wú)法達(dá)到酸奶酸度要求；接種量過(guò)大，則凝乳時(shí)間短，酸度高，發(fā)酵乳明顯析出分層。發(fā)酵劑接種量為體積分?jǐn)?shù)的1%時(shí)，感官評(píng)分最高，組織結(jié)構(gòu)優(yōu)良，故選取1%的發(fā)酵乳發(fā)酵劑接種量。

圖3 發(fā)酵劑接種量對(duì)感官評(píng)分的影響

2.1.3 赤蘚糖醇添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

糖不僅能為菌種提供碳源，而且還是椰漿發(fā)酵乳特殊質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味的主要來(lái)源，如增強(qiáng)發(fā)酵乳的黏性，提高發(fā)酵乳的奶香味等，但過(guò)度添加會(huì)破壞椰漿發(fā)酵乳的組織狀態(tài)[23]，且攝入過(guò)量的糖分會(huì)導(dǎo)致一系列不利于身體健康的結(jié)果[24]。因此，糖在椰漿發(fā)酵乳中的添加量尤為重要。由圖4可知，隨著赤蘚糖醇添加量的增加，椰漿發(fā)酵乳感官評(píng)分先增加后減小，赤蘚糖醇添加量0.6%時(shí)評(píng)分最高，該組產(chǎn)品色澤無(wú)較大差別，組織結(jié)構(gòu)良好。赤蘚糖醇添加量0.6%以下，口感偏酸；赤蘚糖醇添加量0.8%以上時(shí)，口感甜膩。糖添加量過(guò)多時(shí)會(huì)產(chǎn)生高滲透壓，不僅會(huì)抑制菌種的生長(zhǎng)繁殖，降低發(fā)酵速度，還會(huì)影響發(fā)酵乳的風(fēng)味口感[25]。故赤蘚糖醇添加量選取0.6%。

圖4 赤蘚糖醇添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

綜上所述，通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析可知添加赤蘚糖醇的椰漿發(fā)酵乳的發(fā)酵時(shí)間、赤蘚糖醇添加量、發(fā)酵劑接種量的最佳水平分別為10 h，0.6%和1%。

2.2 感官品評(píng)試驗(yàn)結(jié)果

按照表1感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，10名感官評(píng)價(jià)員評(píng)定響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的17組椰漿發(fā)酵乳樣品，獲得椰漿植物型發(fā)酵乳的感官評(píng)價(jià)結(jié)果，如表3所示。

表3 椰漿植物型發(fā)酵乳感官評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3 模糊評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1 確定質(zhì)量因素權(quán)重集

用k=（k1，k2，k3，…，km）表示權(quán)重，即各因素對(duì)結(jié)果影響程度在總體因素中所占比重，所有因素的權(quán)重總和為1[23]。由感官評(píng)定小組根據(jù)個(gè)人情感傾向評(píng)價(jià)色澤、口感、組織結(jié)構(gòu)3項(xiàng)因素在椰漿發(fā)酵乳感官評(píng)價(jià)中的重要性，按百分制打分，求出各項(xiàng)感官品質(zhì)權(quán)重平均值，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 評(píng)價(jià)椰漿植物型發(fā)酵乳質(zhì)量因素的權(quán)重分布統(tǒng)計(jì)

此3項(xiàng)質(zhì)量因素權(quán)重集合為k=（k1，k2，k3）=（0.137，0.654，0.209），即影響添加赤蘚糖醇的椰漿植物型發(fā)酵乳的質(zhì)量指標(biāo)中口感最重要，其次是組織結(jié)構(gòu)，而色澤影響程度最小。

2.3.2 模糊矩陣的建立及綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

據(jù)表3中感官評(píng)定員對(duì)發(fā)酵乳的色澤、口感、組織結(jié)構(gòu)3個(gè)因素分別進(jìn)行評(píng)定的結(jié)果，得到椰漿植物型發(fā)酵乳的感官評(píng)價(jià)模糊關(guān)系矩陣R，按式（3）計(jì)算。

式中：j=1，2，3，…，t為樣品編號(hào)，每一行為各因素評(píng)價(jià)結(jié)果。

依據(jù)矩陣公式（4）計(jì)算感官評(píng)分結(jié)果。

以第1組樣品R1為例，其感官評(píng)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品R1感官評(píng)價(jià)結(jié)果

由表5得到對(duì)應(yīng)的模糊關(guān)系矩陣。

根據(jù)式（3）（4）進(jìn)行樣品R1的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果，其中

結(jié)果表明，對(duì)于42 ℃發(fā)酵時(shí)間8 h、赤蘚糖醇添加量0.3 g、接種量1.5%所制備的椰漿發(fā)酵乳，55.17%的成員認(rèn)為其感官為優(yōu)，39.28%的成員認(rèn)為其感官為良，5.55%的成員認(rèn)為其感官為差。同理可得其他樣品的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果。

得到結(jié)果后，對(duì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)賦值（v1=95，v2=85，

同理可得其他樣品的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果，如表6所示。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化配方

基于Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)理論，將發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵劑接種量、赤蘚糖醇添加量作為自變量，以表6椰漿植物型發(fā)酵乳綜合評(píng)價(jià)結(jié)果的感官評(píng)分為因變量，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。運(yùn)用Design-Expert 12軟件對(duì)椰漿發(fā)酵乳感官評(píng)分試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，得到的二次多項(xiàng)式回歸方程為：Y=91.59-0.236 3A-0.828 8B+0.240 0C-0.460 0AB-1.02AC+0.077 5BC-3.77A2-0.634 5B2-4.29C2。響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表7，方差分析見(jiàn)表8。

表6 椰漿植物型發(fā)酵乳綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

表7 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

從表8可知，模型P＜0.05，該模型差異顯著，失擬項(xiàng)P=0.101 6（＞0.05），失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型擬合效果優(yōu)良，試驗(yàn)誤差小，因此可憑借該模型推測(cè)通過(guò)添加赤蘚糖醇優(yōu)化椰漿植物基發(fā)酵乳的最佳配方。

表8 回歸模擬方差分析結(jié)果

從各項(xiàng)P值（A為0.759 0，B為0.300 0，C為0.755 4）均大于0.05則可以說(shuō)明各因子對(duì)發(fā)酵乳的品質(zhì)影響不顯著。各因素獨(dú)立對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)產(chǎn)生作用，不存在因素之間對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)的共同作用。根據(jù)各項(xiàng)F值（A為0.10，B為1.25，C為0.11）可以看出在所選各因素的水平范圍內(nèi)，對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)影響大小的順序?yàn)椋喊l(fā)酵劑接種量＞赤蘚糖醇添加量＞發(fā)酵時(shí)間。

由圖5可知，因素對(duì)響應(yīng)值影響越大響應(yīng)面坡度越陡[22]，三維曲面的傾斜程度越顯著，等高線交匯呈橢圓形則表明各交互因素間的交互作用明顯[25]。對(duì)于椰漿發(fā)酵乳的品質(zhì)，從圖5（a）的弧面及等高線的變化程度可以看出，接種量和發(fā)酵時(shí)間兩因素之間不存在明顯相互作用。從圖5（b）可得，等高線排列稀疏且形狀呈現(xiàn)近圓形，說(shuō)明赤蘚糖醇添加量和發(fā)酵時(shí)間交互作用不顯著。從圖5（c）可得，響應(yīng)面坡度較平緩，則赤蘚糖醇添加量和接種量對(duì)椰漿發(fā)酵乳品質(zhì)影響的交互作用不強(qiáng)。

圖5 兩兩交互因素對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面及等高線圖

其中從圖5可以看出接種量響應(yīng)面陡峭程度大于赤蘚糖醇添加量和發(fā)酵時(shí)間，則說(shuō)明接種量對(duì)椰漿發(fā)酵乳品質(zhì)的影響最大，其次為赤蘚糖醇接種量，發(fā)酵時(shí)間對(duì)椰漿發(fā)酵乳品質(zhì)影響最小，與表8的方差分析結(jié)果一致，表明回歸模型的可靠性和真實(shí)性。

2.4.2 最佳配方驗(yàn)證

結(jié)合回歸模型分析結(jié)果可知，最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵時(shí)間11.5 h、接種量0.3%、赤蘚糖醇添加量0.279%，此時(shí)感官評(píng)分為89.886分。考慮到實(shí)際生產(chǎn)要求，改進(jìn)工藝參數(shù)為發(fā)酵時(shí)間11.5 h、接種量0.5%、赤蘚糖醇添加量0.6%。基于3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，得到感官評(píng)價(jià)平均分90.26分，與理論預(yù)測(cè)值基本一致，表明該添加赤蘚糖醇的椰漿發(fā)酵乳配方優(yōu)良。

3 結(jié)論

利用模糊數(shù)學(xué)耦合響應(yīng)面法分析優(yōu)化赤蘚糖醇添加量對(duì)椰漿發(fā)酵乳的品質(zhì)影響，得到最佳配方：發(fā)酵時(shí)間11.5 h、接種量0.5%、赤蘚糖醇添加量0.6%，感官評(píng)分為90.26分。該配方發(fā)酵的椰漿發(fā)酵乳呈乳白色，光潔度高，凝固狀態(tài)優(yōu)良，質(zhì)地均勻，酸甜適中，口感細(xì)膩，帶有椰香味，滿足人們對(duì)健康綠色的飲食需求。試驗(yàn)改善椰漿植物型發(fā)酵乳最優(yōu)工藝配方，在保留其原有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能[26]基礎(chǔ)上改善椰漿發(fā)酵乳口感，從而具有廣闊的發(fā)展空間和市場(chǎng)前景。試驗(yàn)僅涉及赤蘚糖醇對(duì)椰漿發(fā)酵乳的感官評(píng)估和相關(guān)理化性質(zhì)評(píng)價(jià)，后續(xù)可進(jìn)一步探究此配方發(fā)酵的椰漿發(fā)酵乳的揮發(fā)性成分、活菌數(shù)、抗氧化能力等變化。