楊卓 楊歡

(1.西安市中醫(yī)醫(yī)院,西安 710000;2.西安啟迪兒童醫(yī)院,西安 710000)

胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase-associated recruitment domain-containing protein 9,CARD9)是一種信號銜接蛋白,參與多種模式識(shí)別受體的信號傳導(dǎo),包括C型凝集素受體(C-type lectin receptors,CLRs)、細(xì)胞內(nèi)Nod樣受體(NOD-like receptors,NLR)和核酸傳感器,可將Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)和CLRs的信號傳遞給有絲分裂激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和轉(zhuǎn)錄因子核因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB)[1-2]。由此可見,CARD9在NF-κB和MAPK激活中起關(guān)鍵作用,可導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子級聯(lián)的啟動(dòng),并引發(fā)針對微生物入侵的宿主免疫反應(yīng),特別是在真菌感染中。

CARD9在人類和小鼠組織中的表達(dá)模式幾乎相似,在胎盤、小腸、皮膚、肺和腦中均可檢測到CARD9基因,在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中,CARD9的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平最高[3]。CARD9在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、口腔黏膜和皮膚抗真菌免疫反應(yīng)的激活中具有高度特異性,CARD9基因缺陷患者易患持續(xù)性嚴(yán)重真菌感染,表現(xiàn)為易受念珠菌反復(fù)感染的特征[4]。此外,CARD9在動(dòng)物模型中被證明是真菌免疫的重要調(diào)節(jié)劑,機(jī)體CARD9基因的突變或缺乏可引起各種感染及侵襲性疾病,涉及念珠菌、曲霉、新生隱球菌、馬拉色菌及皮膚癬菌等[5]。

1 CARD9抗真菌免疫機(jī)制

先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞構(gòu)成了人體對抗微生物病原體的第1道防線,它們在組織損傷時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。CARD9主要在髓系細(xì)胞中表達(dá),轉(zhuǎn)導(dǎo)CLRs下游的信號,CLRs作為一個(gè)模式識(shí)別受體,包括Dectin-1、Dectin-2、Dectin-3和Mincle,它們對真菌細(xì)胞壁的β-葡聚糖、甘露聚糖等具有特異性[6]。這些受體是由Src家族激酶在受體胞質(zhì)尾部的免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)或相關(guān)信號分子的磷酸化激活的。這種激活誘導(dǎo)下游激活級聯(lián)反應(yīng),磷酸化ITAM首先招募和激活脾酪氨酸激酶(SYK),進(jìn)而磷酸化蛋白激酶C,因而通過CARD9的蘇氨酸殘基的磷酸化,使CARD9參與活化NF-κB或MAPK途徑[7-8]。磷酸化的CARD9招募B-細(xì)胞淋巴瘤因子10(recombinant B-Cell CLL,BCL10),BCL10立即與黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1 (mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1,MALT1)旁磷酸酶結(jié)合,導(dǎo)致CARD9-BCL10-MALT1(CBM)復(fù)合物的形成,這種復(fù)合物激活核因子NF-κB和c-Jun N末端激酶,以刺激編碼促炎細(xì)胞因子和趨化因子的基因轉(zhuǎn)錄,如IL-2、IL-10、IL-12等[9-10]。此外,在機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)中,單核細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的CARD9信號分別誘導(dǎo)集落刺激因子和趨化因子CXCL1的產(chǎn)生,從而啟動(dòng)中性粒細(xì)胞向真菌感染部位的募集,嗜中性粒細(xì)胞是真菌吞噬和殺死以及隨后清除病原體所必需的[11]。研究發(fā)現(xiàn),CARD9基因缺陷小鼠導(dǎo)致中性粒細(xì)胞募集受損,并允許侵襲性真菌生長,CARD9信號還將先天免疫感知與T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫的激活相結(jié)合,并控制Th1和Th17細(xì)胞的分化[12]。T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是機(jī)體抗真菌的主要免疫效應(yīng),Th1和Th17細(xì)胞發(fā)揮抵御真菌侵襲的作用,Th1細(xì)胞效應(yīng)因子γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對真菌的吞噬殺傷作用,Th17細(xì)胞效應(yīng)因子IL-17調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞募集,增加抗微生物多肽分泌,從而增強(qiáng)宿主免疫防御[13]。而在CARD9基因缺陷患者體外表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子的功能受損,中性粒細(xì)胞對某些真菌的殺滅也存在缺陷,CARD9缺陷患者外周血中Th1/Th17細(xì)胞比例降低,效應(yīng)因子分泌缺乏,因而更容易感染真菌[14]。研究發(fā)現(xiàn),CARD9基因缺陷小鼠IL-17的產(chǎn)生顯著減少,Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13的產(chǎn)生顯著增加,這表明CARD9介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)是M1巨噬細(xì)胞活化和誘導(dǎo)所必需的,其中CARD9對誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生至關(guān)重要[15]。CBM復(fù)合物能激活I(lǐng)KK復(fù)合體,最終介導(dǎo)包含p65-p50或REL-p50的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核,促進(jìn)促炎癥因子的產(chǎn)生,發(fā)揮抗真菌感染作用[16]。因此,CARD9介導(dǎo)的免疫是抗真菌病原體保護(hù)性免疫的重要調(diào)節(jié)劑,也是連接先天免疫和獲得性免疫之間的重要聯(lián)系,對于人體抵御各種真菌的系統(tǒng)宿主防御是必不可少的,這在微生物感染,特別是侵襲性真菌感染中得到了很好的證實(shí)[17]。

2 CARD9與真菌感染

2.1 CARD9與侵襲性真菌感染

侵襲性真菌感染(invasive fungal diseases,IFD)主要與念珠菌、曲霉以及新生隱球菌相關(guān),占真菌感染的90%左右,是免疫功能低下人群的易感疾病,CARD9缺陷是IFD發(fā)病的主要遺傳學(xué)病因,IFD可能是由先天免疫缺失引起的,例如IL17和CARD9免疫的先天性缺失[18]。機(jī)體CARD9缺乏導(dǎo)致對真菌特異性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向感染的敏感性,正常情況下CARD9可促進(jìn)中性粒細(xì)胞向真菌感染的中樞神經(jīng)系統(tǒng)募集,介導(dǎo)真菌清除。CARD9在Th1和Th17反應(yīng)的分化中起著關(guān)鍵作用,通過激活典型的NF-κB信號來誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中IL-6、IL-1β和IL-12的產(chǎn)生[19]。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)多種CARD9基因改變而引起的多種真菌感染,包括念珠菌感染、曲霉感染、新生隱球菌感染等。

念珠菌感染 念珠菌(Candida)是一類最常見的人類機(jī)會(huì)性致病真菌,侵襲性念珠菌病可致命,白念珠菌是其中最為常見且致病性也最強(qiáng)的致病菌,占念珠菌(Candidaalbicans)感染的75%[20]。常染色體隱性CARD9缺乏易感染深部真菌病及侵襲性念珠菌病,CARD9的先天性變異影響其與在腦中表達(dá)的Ras-GRF1蛋白結(jié)合造成真菌易感,CARD9基因相關(guān)侵襲性念珠菌病患者,常累及中樞神經(jīng)系統(tǒng),引起念珠菌性腦膜腦炎[21]。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前共發(fā)現(xiàn)CARD9突變體22種,常見的突變體有6種,我國1例以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染主要臨床表現(xiàn)的侵襲性念珠菌病患兒進(jìn)行全基因外顯子組檢測及一代測序驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)了CARD9基因存在c.952-12956delinsAG純合變異,為未報(bào)道的致病變異,豐富了CARD9基因的變異多樣性[22]。最近研究證明,骨髓來源的抑制性細(xì)胞(myeloidderived suppressor cells,MDSCs)在抗念珠菌感染中具有顯著抑制免疫細(xì)胞應(yīng)答的功能,致病性念珠菌可通Dectin-1及CARD9誘導(dǎo)中粒樣髓源抑制細(xì)胞(G-MDSC)生成,其中白念珠菌是G-MDSC最強(qiáng)的誘導(dǎo)劑[13]。

此外,在侵襲性念珠菌病患者中,CARD9的突變與保護(hù)性抗真菌IgG反應(yīng)受損有關(guān),這種抗真菌IgG能特異性識(shí)別白念珠菌,IgG的產(chǎn)生依賴于固有免疫調(diào)節(jié)因子CX3CR1+單核巨噬細(xì)胞(MNPs),編碼CX3CR1的基因中的SNPs位點(diǎn)與CD患者的抗真菌IgG反應(yīng)密切相關(guān),CX3CR1+MNPs在腸道抗真菌免疫中起關(guān)鍵作用,80%以上的CX3CR1+MNPs能有效識(shí)別和應(yīng)答念珠菌[23]。CARD9蛋白在中性粒細(xì)胞殺傷白念珠菌孢子免疫過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,CARD9缺陷可嚴(yán)重影響白念珠菌刺激后具有可趨化免疫細(xì)胞至感染部位發(fā)揮抗感染作用的中性粒細(xì)胞IL-8的表達(dá),導(dǎo)致中性粒細(xì)胞殺傷白念珠菌功能的異常[24]。Alves等[25]在對真菌感染的患者進(jìn)行基因檢測中發(fā)現(xiàn),外周血Th17、IL-6和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)等在白念珠菌刺激下分泌減少,這與CARD9基因突變導(dǎo)致的外周血中性粒細(xì)胞吞噬能力缺陷有關(guān)[26]。對白念珠菌性腦膜腦炎患者進(jìn)行G-CSF輔助治療后,患者的癥狀及影像學(xué)均恢復(fù)正常。Drummond等[27]發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞特異性CARD9缺失損害了IL-1β和CXCL1的產(chǎn)生和中性粒細(xì)胞的募集,并增加了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中真菌的增殖。念珠菌毒素通過與小膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)合,產(chǎn)生IL-1β和CXCL1,作用于保護(hù)性募集趨化因子表達(dá)受體的中性粒細(xì)胞。重要的是,小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β和CXCL1的產(chǎn)生依賴于CARD9,小膠質(zhì)細(xì)胞CARD9的特異性缺失會(huì)損害中性粒細(xì)胞對白念珠菌感染的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的募集。由此可見,人體之所以易受IFD,可能主要是由于的CARD9基因缺陷導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)減弱,中樞神經(jīng)系統(tǒng)對真菌的易感性增強(qiáng)。

曲霉感染 曲霉為低毒力條件致病菌,主要存在人體呼吸道、鼻竇、外耳道中,一般不感染正常人,免疫功能低下或粒細(xì)胞減少時(shí),曲霉可經(jīng)破損皮膚黏膜或呼吸道進(jìn)入人體引起感染。CARD9單核苷酸多態(tài)性S12N最近顯示在過敏性支氣管肺曲霉病患者中高度富集,CARD9變體激活RelB,隨后通過肺泡巨噬細(xì)胞激活I(lǐng)L-5的產(chǎn)生,并在肺中驅(qū)動(dòng)致病性嗜酸性粒細(xì)胞募集和Th2反應(yīng)[28]。Xu等[29]發(fā)現(xiàn)CARD9S12N在接觸CLR后促進(jìn)了2型免疫反應(yīng)的誘導(dǎo),從而證明CARD9S12N可以將肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生IL-5的細(xì)胞,并促進(jìn)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的病理反應(yīng),CARD9S12N介導(dǎo)CLR誘導(dǎo)的非典型轉(zhuǎn)錄因子NF-κB亞單位RelB的激活,啟動(dòng)肺泡巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-5的產(chǎn)生,以募集嗜酸性粒細(xì)胞來驅(qū)動(dòng)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的過敏反應(yīng)。表達(dá)CARD9S12N的先天單核細(xì)胞是Th2細(xì)胞介導(dǎo)的過敏反應(yīng)協(xié)調(diào)過程中產(chǎn)生IL-5的主要來源。CARD9通常與RelB相關(guān)聯(lián)以抑制其激活,而S12N取代削弱了CARD9與RelB的關(guān)聯(lián),從而導(dǎo)致Dectin-1介導(dǎo)的RelB激活以調(diào)節(jié)IL-5表達(dá)。CARD9S12N將先天單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生IL-5的細(xì)胞的能力,為探討先天免疫系統(tǒng)和過敏性疾病之間的聯(lián)系建立了新的范式。

新生隱球菌感染 新生隱球菌(Cryptococcusneoformans)是繼白念珠菌之后最常見的條件致病真菌,常在鴿子等鳥類的糞便沉淀物中繁殖。這種真菌通過空氣傳播途徑感染宿主,可在免疫功能嚴(yán)重受損的個(gè)體中引起肺部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。Dectin-2或CARD9基因敲除小鼠對在樹突狀細(xì)胞吞噬新生隱球菌中的作用明顯降低,認(rèn)為Dectin-2可能通過CARD9介導(dǎo)的信號通路在樹突狀細(xì)胞對新生隱球菌的肌動(dòng)蛋白聚合和吞噬過程中發(fā)揮重要作用[30]。此外,CARD9及上游受體Mincle在宿主防御新生隱球菌感染中起著關(guān)鍵作用,在隱球菌感染早期,野生型小鼠肺中Mincle的表達(dá)以CARD9依賴的方式增加,而CARD9基因敲除小鼠的Mincle表達(dá)顯著低于野生型小鼠[31]。Yamamoto等[32]研究發(fā)現(xiàn),CARD9基因敲除小鼠對新生隱球菌的經(jīng)呼吸道感染高度敏感,在感染的先天免疫階段,干擾素α是宿主抵御新生隱球菌感染的關(guān)鍵細(xì)胞因子,CARD9缺陷導(dǎo)致產(chǎn)生干擾素的記憶表型T細(xì)胞在肺內(nèi)蓄積受損,增加對新生隱球菌肺部感染的易感性,導(dǎo)致肺部真菌清除率降低。Th1細(xì)胞分化是宿主抵御新生隱球菌感染的關(guān)鍵過程,CARD9基因敲除小鼠Th1相關(guān)細(xì)胞因子的合成缺陷會(huì)加劇新生隱球菌感染。

2.2 CARD9與馬拉色菌感染

馬拉色菌(Malassezia)隸屬擔(dān)子菌門(Basidiomycota),廣泛存在于人體皮膚表面和胃腸道中,有潛在致病的可能。研究發(fā)現(xiàn),CARD9多態(tài)性有利于馬拉色菌定植,CARD9的缺失不僅可能導(dǎo)致對真菌病原體的易感性,還可能增加炎癥性腸病(inflammation bowel disease,IBD)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[33-34]。Lamas等[35]發(fā)現(xiàn),CARD9是IBD的易感基因,CARD9主要通過CLRs參與對馬拉色菌的免疫應(yīng)答,激活I(lǐng)L-22或介導(dǎo)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)MAPK信號和調(diào)節(jié)TLRs信號等途徑來促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)的康復(fù)。CARD9也與腸道真菌失調(diào)密切相關(guān),在CLRs介導(dǎo)的全身性真菌感染中,CARD9可將先天免疫與Th17細(xì)胞分化聯(lián)系起來,起關(guān)鍵的信號傳導(dǎo)作用,CARD9缺陷的小鼠腸道菌群會(huì)發(fā)生改變,表現(xiàn)出生物失調(diào),小鼠更容易患UC[36]。CARD9單核苷酸多態(tài)性是CD的遺傳危險(xiǎn)因素之一,在CARD9S12N多態(tài)性的克羅恩病(Crohn's disease,CD)患者中,限制馬拉色菌(M.restricta)能夠惡化其腸道炎癥,提示CARD9相關(guān)信號通路對于機(jī)體感知限制馬拉色菌起重要作用[37]。另外,在大部分的腸道腫瘤疾病中顯示出CARD9基因的異常,CARD9還可通過改變腸道菌群控制MDSC分化來調(diào)節(jié)腸道抗腫瘤免疫,缺乏CARD9的巨噬細(xì)胞顯示出殺真菌能力受損,這導(dǎo)致腸道中真菌增加,誘導(dǎo)了MDSC積累[38]。也有研究表明CARD9下游的NF-κB信號通路是目前認(rèn)為調(diào)控IBD炎癥反應(yīng)的重要信號通路之一,參與炎性因子的轉(zhuǎn)錄[39]。由此可見,CARD9可通過參與真菌免疫反應(yīng)減少IBD的發(fā)生,同時(shí)也可通過調(diào)控腸道菌群對腸道腫瘤性疾病進(jìn)行免疫。

2.3 CARD9與皮膚癬菌感染

皮膚癬菌病是一種全球范圍內(nèi)常見的疾病,紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum)為主要致病菌,CARD9基因突變引起的皮膚癬菌感染不僅累及淺表皮膚、甲、頭皮等,還可累及淋巴結(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等部位發(fā)生深部皮膚癬菌病或引起全身泛發(fā)的皮膚癬菌病。先天免疫和適應(yīng)性免疫在皮膚抗真菌防御中起重要作用,CLRs參與皮膚真菌的識(shí)別,這種識(shí)別誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián),其中CARD9銜接蛋白起核心作用,在宿主抵御真菌病原體的防御中發(fā)揮重要作用,并誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子,負(fù)責(zé)將免疫細(xì)胞募集到感染部位[40]。陳佳沁等[41]研究發(fā)現(xiàn),CARD9基因敲除影響HaCaT細(xì)胞IL-6和IL-8的分泌,認(rèn)為CARD9基因的突變和缺失會(huì)損害機(jī)體對真菌的抗感染免疫,CARD9基因還可能介導(dǎo)了紅色毛癬菌感染誘導(dǎo)的IL-6、IL-8下調(diào),這表明CARD9在皮膚癬菌病致病機(jī)制中存在十分重要的作用。Majocchi肉芽腫作為皮膚癬菌深部感染的一種,有研究表明,CARD9缺陷使得宿主天然免疫受損,使皮膚癬菌出現(xiàn)深部感染,因此認(rèn)為CARD9缺陷與Majocchi肉芽腫的發(fā)病機(jī)制有密切聯(lián)系[42]。Lanternier等[43]將來自5個(gè)國家共25名患者進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)所有深部皮膚真菌病患者均有常染色體隱性遺傳性CARD9缺陷。由此可見,CARD9與皮膚癬菌病所致的各類皮膚真菌感染類疾病都有密切的聯(lián)系,在銜接先天免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用。

3 小結(jié)與展望

綜上所述,CARD9在真菌感染類疾病中的作用與介導(dǎo)機(jī)體先天免疫有關(guān)。無論是發(fā)生于皮膚、組織還是臟腑的真菌感染類疾病,缺乏CARD9及其變體的機(jī)體都表現(xiàn)出對真菌的易感性,由此可見CARD9在機(jī)體的先天免疫中扮演著不可缺少的角色。今后的研究或可深入到其他真菌感染類疾病與CARD9是否也有密切聯(lián)系,是否與其他通路有密切聯(lián)系,哪些受體參與了皮膚真菌的免疫,以便更好地明確CARD9在真菌感染類疾病中的作用,為臨床治療靶點(diǎn)選擇提供新的思路。