王智慧 吳潔麗 項(xiàng)延包

先天性耳聾是人類最常見的出生缺陷之一。據(jù)報(bào)道，每1 000 名新生兒中約有1.5 例存在聽力障礙，其中超過一半與遺傳因素有關(guān)[1]。大約90%的先天性耳聾患兒出生在聽力正常的家庭[2]，因此國家近10 年來廣泛開展對新生兒耳聾基因的篩查，達(dá)到對耳聾患兒早期診斷及早期治療的目的[3]。如能將遺傳性耳聾基因攜帶者篩查提早到孕期，了解孕婦群體耳聾熱點(diǎn)基因突變攜帶情況，有助于臨床作出準(zhǔn)確的產(chǎn)前咨詢及產(chǎn)前診斷，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的。本研究以溫州市中心醫(yī)院產(chǎn)前門診的3 620 例聽力正常、無耳聾家族史的孕婦為研究對象，進(jìn)行常見遺傳性耳聾基因篩查，并對夫妻雙方攜帶同種基因的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，了解本地區(qū)常見遺傳性耳聾基因突變頻率和分布特征，以期為耳聾精準(zhǔn)防控提供遺傳學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2020 年2 月1 日至2022 年7 月31 日在本院產(chǎn)前門診，無耳聾家族史且未曾接受耳聾基因攜帶者篩查的孕婦為研究對象，共納入3 620 例聽力正常的孕期女性，年齡21～43 歲，孕周＜18 周。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：K2020-00-001），受檢者知情同意并簽署知情同意書后接受耳聾基因篩查。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 （1）口腔唾液標(biāo)本采集：漱口后30 min，以專用唾液采集器留取口腔唾液5 ml，參照說明書提取唾液標(biāo)本DNA（愷碩生物科技廈門股份有限公司試劑盒，備案號：閩廈械備20160003）。（2）胎兒羊水DNA 提?。哼M(jìn)入產(chǎn)前診斷的孕婦于孕中期（17～26 周）在超聲引導(dǎo)下抽取羊水10 ml，采用德國QIAGEN 公司QIAamp DNA mini Kit 抽提試劑盒參照說明書抽提羊水基因組DNA。取2 μl DNA 樣本用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量和純度檢測。

1.2.2 孕婦耳聾基因檢測方法及判讀 采用廣州凱普醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（備案號：粵穗械備20170043），采用PCR+導(dǎo)流雜交法檢測4個(gè)常見耳聾基因21個(gè)位點(diǎn)，具體如下。6 個(gè)GJB2 位點(diǎn)：c.35delG、c.167delT、c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT、c.508_511dupAACG；11 個(gè)SLC26A4 位點(diǎn)：c.281C＞T、c.589G＞A、c.1174A＞T、c.1226G＞A、c.1229C＞T、c.1975G＞C、c.2027T＞A、c.2162C＞T、c.2168A＞G、IVS7-2A＞G、IVS15+5G＞A；2 個(gè)GJB3 位點(diǎn)：c.538C＞T、c.547G＞A；2 個(gè)線粒體12S rRNA 位點(diǎn)：m.1494C＞T、m.1555A＞G。首先行PCR 法擴(kuò)增（杭州博日PCR 儀）：采用PCR 法，對檢測范圍為4 個(gè)基因的目標(biāo)位點(diǎn)位置用特異性引物進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，特異性引物的設(shè)計(jì)是專門針對目標(biāo)位點(diǎn)，覆蓋該位點(diǎn)上下游的100～200 bp 序列。然后進(jìn)行導(dǎo)流雜交：將擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)記不同突變類型遺傳性耳聾基因探針的尼龍膜在導(dǎo)流雜交儀上進(jìn)行導(dǎo)流雜交。最后通過化學(xué)顯色對結(jié)果進(jìn)行判讀：正常探針及對應(yīng)的突變探針位點(diǎn)都出現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)，為該位點(diǎn)的雜合突變或異質(zhì)突變；突變探針出現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)，而對應(yīng)的正常探針位點(diǎn)沒有出現(xiàn)藍(lán)紫色斑點(diǎn)，為該位點(diǎn)的純合突變或均質(zhì)突變。

1.2.3 GJB2、SLC26A4 基因攜帶者干預(yù)方案 GJB2、SLC26A4 基因?yàn)槌Ｈ旧w隱性遺傳病，當(dāng)夫妻雙方均為相同基因攜帶者，后代有25%概率發(fā)生耳聾的風(fēng)險(xiǎn)。因此，對于孕婦檢測結(jié)果顯示GJB2 或SLC26A4 基因突變攜帶者時(shí)，召回其配偶進(jìn)行相應(yīng)基因Sanger 測序，若夫妻雙方均攜帶有相同突變耳聾基因，在知情同意情況下，建議在孕中期（孕17～26 周）抽取羊水對胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷及相應(yīng)的突變位點(diǎn)檢測，進(jìn)入產(chǎn)前診斷的孕婦同時(shí)行羊水胎兒染色體檢查。

1.2.4 GJB3、線粒體12S rRNA 攜帶者干預(yù)方案 對于GJB3 基因攜帶者，有文獻(xiàn)報(bào)道與高頻聽力損傷有關(guān)，會導(dǎo)致遲發(fā)性聽力受損[4]，僅予遺傳宣教，注意聽力變化，不進(jìn)行配偶篩查及產(chǎn)前診斷。對于孕婦檢測結(jié)果提示為m.1494C＞T、m.1555A＞G 攜帶者，因其為線粒體的母系遺傳，為氨基糖苷類抗生素敏感個(gè)體，予告知應(yīng)終生絕對禁止使用氨基糖苷類抗生素，以避免耳聾的發(fā)生。

1.3 觀察指標(biāo) （1）孕婦耳聾基因篩查結(jié)果；（2）耳聾基因攜帶者配偶基因檢測及產(chǎn)前診斷結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 孕婦耳聾基因篩查結(jié)果 3 620 例聽力正常孕婦接受耳聾基因篩查，共檢出攜帶常見耳聾基因突變者163 例（4.50%）；檢出5 種GJB2 基因突變共85 例，其中c.235delC 突變率最高，共65 例（1.80%）；檢出6 種SLC26A4 基因突變共44 例，其中IVS7-2A＞G 突變率最高，共33 例（0.91%），見表1。

表1 3 620 例孕婦耳聾基因篩查結(jié)果

2.2 耳聾基因攜帶者配偶基因檢測及產(chǎn)前診斷結(jié)果 在163 例孕婦耳聾基因攜帶者中，共有129 例為GJB2、SLC26A4 基因攜帶者，對其配偶進(jìn)行召回，并建議其配偶進(jìn)一步行相應(yīng)基因測序，結(jié)果共有118 例配偶進(jìn)行了耳聾相應(yīng)基因的Sanger 測序，檢出8 例攜帶者，其中1 例因胎兒多發(fā)畸形引產(chǎn)未做產(chǎn)前診斷，7 例進(jìn)行羊水穿刺染色體培養(yǎng)加染色體微陣列分析（CMA）及耳聾基因鑒定，結(jié)果1 例為GJB2 c.235delC純合突變，1 例為SLC26A4 c.2168A＞G 和SLC26A4 IVS7-2A＞G 復(fù)合雜合突變，患者選擇終止妊娠。1 例染色體檢查確診為21-三體綜合征引產(chǎn)，見表2。

表2 118 例耳聾基因攜帶者配偶耳聾基因攜帶情況及產(chǎn)前診斷結(jié)果

3 討論

耳聾嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量，根據(jù)是否伴有耳外組織病變分為綜合征型和非綜合征型耳聾，其中約70%的非綜合征型耳聾與遺傳因素有關(guān)，目前沒有有效的治療手段。迄今為止，已鑒定出非綜合征型耳聾基因至少124 個(gè)（https://hereditaryhearingloss.org，其中已鑒定出78 個(gè)基因與常染色體隱性遺傳的非綜合征型耳聾相關(guān)，截至2021 年8 月30 日）。因此耳聾基因攜帶者篩查和產(chǎn)前診斷是預(yù)防遺傳性非綜合征型耳聾患兒出生或外界因素導(dǎo)致的聽力損失最直接有效的方法。本研究采取口腔唾液標(biāo)本，對我國常見的4個(gè)耳聾基因中的21 個(gè)致病位點(diǎn)進(jìn)行篩查。自2020 年2 月1 日 至2022 年7 月31 日 共3 620 例聽力正常且無耳聾家族史的孕婦接受耳聾基因篩查，發(fā)現(xiàn)總共有163 例攜帶者，提示溫州地區(qū)孕婦群體中常見耳聾基因的攜帶率約為4.5%，略低于沈陽地區(qū)孕期聽力正常女性遺傳性耳聾基因攜帶率[5]，與武漢地區(qū)聽力正常人群耳聾基因攜帶率相似[6]。

GJB2 基因位于13 號染色體13q12.11 區(qū)域，是最常見的致聾基因，約50%的常染色體隱性遺傳性耳聾患者存在GJB2 基因突變[7]。GJB2 基因在不同地域、不同種群中熱點(diǎn)突變位點(diǎn)不同，c.35delG、c.167delT、c.176_191del16、c.235delC、c.299_300delAT、c.508_511dupAACG 為我國多區(qū)域常見的致聾位點(diǎn)，臨床上常將這些基因突變位點(diǎn)作為普通感音神經(jīng)性耳聾患者的檢測位點(diǎn)，其中c.235delC 是我國人群攜帶率最高的位點(diǎn)，也是溫州地區(qū)非綜合征型耳聾主要致聾基因位點(diǎn)[8]。在本研究中，檢出5 種GJB2 基因突變共85 例，其中65 例為c.235delC 攜帶者，攜帶率為1.80%（65/3 620），占全部耳聾基因攜帶者的39.88%（65/163），這與我國惠州地區(qū)篩查結(jié)果相近[9]。其次為c.299_300del AT 雜合突變共9 例，占5.52%（9/163）；c.176_191del16雜合突變5 例，占3.07%（5/163）；c.508_511dupAACG 雜合突變4 例，占2.45%（4/163），c.35delG 突變2 例，占1.23%（2/163），提示溫州地區(qū)GJB2 熱點(diǎn)基因攜帶譜較廣，且檢出率高，攜帶者篩查具有重要意義。

SLC26A4 基因突變與大前庭導(dǎo)水管綜合征有關(guān)，臨床表現(xiàn)為出生時(shí)聽力正?；蜉p度至重度聽力下降，但因?yàn)閴嫶?、兒童玩耍、跌倒或輕度碰撞等情況致聾，稱為“一巴掌耳聾”，臨床影像學(xué)診斷較為困難。筆者團(tuán)隊(duì)前期針對溫州地區(qū)187 例耳聾患者的研究發(fā)現(xiàn)，溫州地區(qū)非綜合征型耳聾患者SLC26A4 基因攜帶率達(dá)11.76%，其中c.919-2A＞G（IVS7-2A＞G）、c.2168A＞G 是溫州地區(qū)SLC26A4 基因突變最主要的類型[10]。本研究針對SLC26A4 基因在我國人群中常見的11 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行攜帶者篩查，共檢出6 種SLC26A4 基因突變位點(diǎn)共44 例，攜帶率為1.2%，其中IVS7-2（A＞G）突變率最高，共33 例（0.91%），其余位點(diǎn)攜帶率較低，這與筆者團(tuán)隊(duì)前期對溫州地區(qū)耳聾患者的檢測結(jié)果相同[10]，提示IVS7-2A＞G 為本地區(qū)SLC26A4 基因致聾最常見的突變位點(diǎn)。

m.1555A＞G 和m.1494C＞T 是12S rRNA 基因的主要致病突變，已被證實(shí)與氨基糖苷類抗生素誘導(dǎo)的聽力損失有直接關(guān)系[11]，以母系遺傳為特點(diǎn)，一人檢出，便提示所有母系親屬均為攜帶者，有藥物致聾風(fēng)險(xiǎn)。一項(xiàng)關(guān)于新生兒聽力篩查的研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有12S rRNA 攜帶者都通過了聽力測試，因此不能通過體格檢查鑒別出是否為該基因攜帶者，這類攜帶者如使用氨基糖苷類抗生素就會導(dǎo)致不可逆的耳聾，基因篩查可有效避免此類不良事件的發(fā)生[12]。本研究中，有13例孕婦是m.1555A＞G 攜帶者，2 例孕婦為m.1494C＞T攜帶者。如果這類孕婦的嬰兒出生后使用氨基糖苷類抗生素，會發(fā)生不可逆的聽力損失。本研究幫助這15 個(gè)家庭的孩子避免氨基糖苷類抗生素引起的藥物性耳聾等情況的發(fā)生。

GJB3 中c.538C＞T 和c.547G＞A 位點(diǎn)的變異為常染色體顯性遺傳，已證明主要導(dǎo)致高頻聽力損失[13]，被認(rèn)為是遲發(fā)性耳聾的原因之一[14]。GJB3 雖為我國耳聾基因篩查常規(guī)項(xiàng)目之一，但目前沒有明確依據(jù)證明該基因?yàn)槎@患者的根本致病位點(diǎn)[15]，本研究共篩查出14 例為c.538C＞T 攜帶者，5 例為c.547G＞A 攜帶者，針對這19 例攜帶者，筆者團(tuán)隊(duì)僅建議其避免接觸高頻聲音，并注意聽力變化。

本研究通過電話隨訪并對85 例GJB2 攜帶者及44例SLC26A4 攜帶者的配偶進(jìn)行召回，結(jié)果118 例配偶接受耳聾基因檢測。本研究采用Sanger 測序法對配偶攜帶的相應(yīng)基因進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)8 例為攜帶者，其中1例因胎兒多發(fā)畸形引產(chǎn)拒絕基因檢測，7 例進(jìn)行羊水穿刺產(chǎn)前診斷，結(jié)果1 例為GJB2 c.235delC 純合突變，1 例為SLC26A4 c.2168A＞G 和SLC26A4 IVS7-2A＞G復(fù)合雜合突變，患者選擇終止妊娠。1 例染色體檢查確診為21-三體綜合征引產(chǎn)，筆者建議胎兒耳聾基因檢測時(shí)同時(shí)行染色體檢查。

綜上所述，溫州地區(qū)孕婦群體4 種常見耳聾基因的攜帶率約為4.5%，GJB2 基因c.235delC 位點(diǎn)、SLC26A4 基因IVS7-2A＞G 位點(diǎn)是溫州地區(qū)孕婦群體常見的耳聾基因變異位點(diǎn)，通過對溫州地區(qū)聽力正常的孕婦進(jìn)行遺傳性致病性耳聾基因篩查，有助于對攜帶者進(jìn)行遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷，實(shí)現(xiàn)遺傳性耳聾的二級預(yù)防，提高出生人口素質(zhì)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。