方芷欣 鄧芮 孫劍

作者單位：510515 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院感染內(nèi)科

全球約有2.96億慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者，每年有大約50萬(wàn)例患者因HBV相關(guān)肝病死亡[1]，因此防治HBV感染是全球重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。HBV感染進(jìn)入機(jī)體后，可在肝細(xì)胞核內(nèi)形成穩(wěn)定的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，目前批準(zhǔn)的抗病毒藥物如核苷(酸)類(lèi)似物(NAs)和干擾素/聚乙二醇干擾素(IFN/Peg-IFN)仍難以徹底清除cccDNA[2]。直接評(píng)估cccDNA池需進(jìn)行有創(chuàng)的肝活檢，因此在實(shí)際臨床實(shí)踐中接受度不高，亟需無(wú)創(chuàng)、有效的替代指標(biāo)協(xié)助監(jiān)測(cè)肝內(nèi)HBV活躍情況[3]。既往研究表明[4]，傳統(tǒng)的HBV標(biāo)志物如血清HBV DNA、e抗原(HBeAg)和表面抗原(HBsAg)可反映自然史人群的肝內(nèi)病毒復(fù)制情況，但無(wú)法準(zhǔn)確反映NAs治療下患者cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性。近年來(lái)，血清HBV RNA被證明可作為一種新型無(wú)創(chuàng)指標(biāo)，用于監(jiān)測(cè)慢性乙型肝炎(CHB)患者肝內(nèi)cccDNA情況和疾病進(jìn)展[5]。因此，本文著重概述目前有關(guān)血清HBV RNA的分子特征及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展，為指導(dǎo)CHB治療提供線(xiàn)索。

一、血清HBV RNA的分子特征

(一)血清HBV RNA的種類(lèi)、存在形式與分泌途徑 HBV侵入肝細(xì)胞后，病毒的松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，形成cccDNA，隨后轉(zhuǎn)錄出5種具有相同3’末端的mRNA，分別是3.5 kb長(zhǎng)的前核心RNA(pcRNA)和前基因組RNA(pgRNA)，2.4/2.1 kb編碼表面抗原的mRNA(S mRNA)以及0.7 kb編碼X蛋白的mRNA(X mRNA)[5]。研究表明，CHB患者的血清HBV RNA主要為pgRNA[6]，近年發(fā)現(xiàn)還含有少量的HBx mRNA[7]。此外，血清HBV pgRNA中除全長(zhǎng)的pgRNA外，還觀(guān)察到大量的3’端截短型pgRNA(無(wú)polyA尾，由逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中病毒聚合酶的RNase H催化產(chǎn)生)，以及不同類(lèi)型的pgRNA剪接變異體[8]，但何種類(lèi)型的pgRNA占主導(dǎo)地位仍存在爭(zhēng)議，需要區(qū)分度更佳、性能更穩(wěn)健的RNA測(cè)序和定量技術(shù)來(lái)進(jìn)一步闡明。血清中HBV RNA的存在形式也較為復(fù)雜。體外研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞上清中的HBV RNA被包裝于乙型肝炎核心抗原(HBcAg)組成的核衣殼中，其外可覆蓋或不覆蓋病毒外包膜HBsAg[8]。在HBV感染者的血清中，除了存在有外包膜包裹的HBV RNA病毒樣顆粒外，還存在無(wú)病毒外包膜包裹的HBV RNA裸衣殼顆粒，但常以核衣殼-抗體復(fù)合物(CACs)的形式存在[9]。近期，有學(xué)者提出，血清HBV RNA還可能以外泌體等細(xì)胞外囊泡的形式存在于患者血清和細(xì)胞上清中，但目前相關(guān)研究證據(jù)較少。

對(duì)于血清中不同存在形式的HBV RNA顆粒，其分泌出胞的途徑也有所不同。前期研究發(fā)現(xiàn)，包裹有病毒外包膜的HBV RNA病毒樣顆粒和HBV DNA病毒顆粒一樣，通過(guò)多泡小體(MVB)途徑分泌至胞外，但目前有關(guān)HBV RNA裸衣殼顆粒的分泌途徑尚未明確[8]。

(二)HBV RNA病毒樣顆粒的感染能力 考慮到CHB患者的血液中存在含有HBV pgRNA的病毒樣顆粒，因此有必要了解它們是否能像HBV DNA病毒顆粒那樣建立從頭感染。首先，由于HBV RNA病毒樣顆粒的包膜蛋白結(jié)構(gòu)與HBV DNA病毒顆粒相似，有機(jī)會(huì)與肝細(xì)胞?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NTCP)受體結(jié)合進(jìn)入胞內(nèi)。其次，內(nèi)源性DNA 聚合酶實(shí)驗(yàn)(EPA)表明，外周血和細(xì)胞上清來(lái)源的HBV RNA可在體外逆轉(zhuǎn)錄為病毒DNA[8-9]，這進(jìn)一步表明血清HBV pgRNA病毒樣顆粒具有從頭感染的潛力。然而，由于HBV RNA病毒樣顆粒和DNA病毒顆粒的包膜蛋白組成和密度相似，從HBV DNA顆粒中分離和純化HBV RNA顆粒在技術(shù)上極具挑戰(zhàn)性。既往研究通過(guò)使用不可逆或可逆的HBV聚合酶抑制劑選擇性地富集細(xì)胞上清中的HBV RNA病毒樣顆粒，發(fā)現(xiàn)其均無(wú)法在體外建立從頭感染[8, 10]。然而，由于體外使用抑制劑富集的大多數(shù)HBV RNA病毒樣顆粒往往包含的是剪接和末端截短型的pgRNA，現(xiàn)有證據(jù)仍不能完全排除全長(zhǎng)HBV pgRNA病毒樣顆粒的感染性。因此，未來(lái)需在不中斷病毒聚合酶活性的自然條件下收集和純化HBV RNA病毒樣顆粒，以進(jìn)一步明確其從頭感染能力。

二、血清HBV RNA的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

HBV屬嗜肝DNA病毒科，遺傳物質(zhì)為病毒DNA，HBV RNA作為承接cccDNA與rcDNA的復(fù)制中間體，既往認(rèn)為僅存在于肝細(xì)胞內(nèi)。因此，盡管1996年德國(guó)實(shí)驗(yàn)室首次報(bào)道了HBV RNA存在于病人血清中[11]，當(dāng)時(shí)該發(fā)現(xiàn)并未引起學(xué)界的重視。此外，由于血清HBV RNA的種類(lèi)和存在形式多樣且復(fù)雜，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)和定量，直到2015年后才出現(xiàn)較多有關(guān)血清HBV RNA臨床應(yīng)用場(chǎng)景的探索研究，目前相關(guān)研究結(jié)果主要涵蓋以下5個(gè)方面：①輔助區(qū)分HBV感染自然史過(guò)程；②預(yù)測(cè)患者抗病毒治療應(yīng)答；③預(yù)測(cè)患者NAs停藥后復(fù)發(fā)；④預(yù)測(cè)患者HBsAg清除；⑤預(yù)測(cè)患者肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生。

(一)血清HBV RNA輔助區(qū)分HBV感染自然史 目前針對(duì)HBV感染的自然病程，主要依據(jù)病毒學(xué)指標(biāo)(HBV DNA水平和HBeAg狀態(tài))及生化學(xué)指標(biāo)(ALT)劃分為4期，包括免疫耐受期(IT)、免疫清除期(HBeAg+ IA)、免疫控制期(IC)和再激活期(HBeAg- IA)[3]。由于肝臟組織學(xué)結(jié)果難以獲得，依據(jù)現(xiàn)行無(wú)創(chuàng)指標(biāo)對(duì)CHB患者進(jìn)行分期易使部分患者劃入“灰色階段”，因此仍需聯(lián)合其他指標(biāo)進(jìn)行完善。血清HBV RNA作為一種新型病毒標(biāo)志物，具有區(qū)分不同感染階段的潛力。盡管研究發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA水平在自然病程各階段的分布規(guī)律與HBV DNA水平類(lèi)似，即IT期患者最高，其次依次為HBeAg+ IA、HBeAg- IA和IC期患者，但與HBeAg、HBV DNA和HBsAg等傳統(tǒng)病毒標(biāo)志物相比，血清HBV RNA在進(jìn)一步區(qū)分處于“灰色區(qū)域”的患者方面并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)[12]。未來(lái)，有關(guān)血清HBV RNA在慢性HBV感染自然史人群中的作用仍需在大樣本量且有肝組織學(xué)結(jié)果的研究中進(jìn)一步探究。

(二)血清HBV RNA預(yù)測(cè)患者抗病毒治療應(yīng)答 2015年，德國(guó)學(xué)者首次報(bào)道，相較于血清HBV DNA和HBsAg，基線(xiàn)血清HBV RNA水平以及NAs治療3或6個(gè)月后的血清HBV RNA下降水平可更好地預(yù)測(cè)患者治療后的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換[13]。該研究的發(fā)表使血清HBV RNA的臨床意義逐漸受到研究人員的重視。隨后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)一步證實(shí)，在IFN治療的CHB患者中，基線(xiàn)或治療早期(12周或24周)的血清HBV RNA水平同樣可較好預(yù)測(cè)CHB患者的后續(xù)IFN治療應(yīng)答情況(包括HBV DNA下降、ALT復(fù)常及HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換)[14-15]。但值得注意的是，在IFN治療人群中，血清HBV RNA與傳統(tǒng)的HBV標(biāo)志物(包括血清HBV DNA、HBsAg和HBeAg等)相比，其預(yù)測(cè)效能并無(wú)顯著優(yōu)勢(shì)[14-15]?；谘錒BV RNA預(yù)測(cè) IFN治療應(yīng)答的效果欠佳，而目前一線(xiàn)NAs治療患者大多可有效實(shí)現(xiàn)HBV DNA轉(zhuǎn)陰和HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，未來(lái)血清HBV RNA用于預(yù)測(cè)抗病毒治療應(yīng)答方面的價(jià)值較為有限。但值得注意的是，HBV RNA作為一種重要的病毒復(fù)制中間體，今后的臨床研究設(shè)計(jì)是否有必要將血清HBV RNA納入治療應(yīng)答的定義仍有待進(jìn)一步探討。

(三)血清HBV RNA預(yù)測(cè)患者NAs停藥后復(fù)發(fā) 相較于HBV DNA等其他病毒指標(biāo)，HBV RNA來(lái)源于cccDNA轉(zhuǎn)錄，與cccDNA具有更為直接的上下游關(guān)系。CHB患者血清中HBV RNA轉(zhuǎn)陰可能意味著患者肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的清除或轉(zhuǎn)錄活性的沉默，也可能預(yù)示著CHB患者有望在實(shí)現(xiàn)臨床治愈(HBsAg清除)之前安全地停用NAs抗病毒治療。2016年，國(guó)內(nèi)一項(xiàng)小樣本量臨床研究結(jié)果提示，對(duì)于NAs治療過(guò)程中達(dá)到停藥標(biāo)準(zhǔn)而停藥的CHB患者，停藥時(shí)血清HBV RNA陰性的患者在停藥后24周時(shí)HBV DNA反彈的比例遠(yuǎn)低于停藥時(shí)血清HBV RNA陽(yáng)性的患者(25.0% vs 72.7%，P=0.001)[6]。隨后，本研究團(tuán)隊(duì)分析了一項(xiàng)前瞻性停藥隊(duì)列中130例停用NAs治療患者的基線(xiàn)血清HBV RNA水平，發(fā)現(xiàn)與停藥時(shí)血清HBV RNA仍為陽(yáng)性的患者相比，停藥時(shí)血清HBV RNA轉(zhuǎn)陰患者的4年累積臨床復(fù)發(fā)率降低約60%，病毒學(xué)復(fù)發(fā)率降低51%[16]。用NAs停藥時(shí)患者血清HBV RNA水平預(yù)測(cè)停藥后病毒學(xué)復(fù)發(fā)和臨床復(fù)發(fā)，其預(yù)測(cè)效能優(yōu)于停藥時(shí)患者的血清HBV DNA與HBsAg[16]。同時(shí)，團(tuán)隊(duì)另一研究分析顯示，在停用NAs時(shí)血清HBV RNA陰性且HBcrAg低水平的患者，其4年累積臨床復(fù)發(fā)率降至0(P<0.001)[17]，進(jìn)一步說(shuō)明血清HBV RNA可用于指導(dǎo)“安全”停藥，以大幅度減少NAs停藥后復(fù)發(fā)。

(四)血清HBV RNA預(yù)測(cè)HBsAg清除 除可預(yù)測(cè)NAs停藥后復(fù)發(fā)外，血清HBV RNA還與NAs停藥后HBsAg清除有關(guān)。在初始HBeAg陽(yáng)性的患者中，停藥時(shí)HBV RNA < 1 000拷貝/mL的患者停藥后6年累計(jì)HBsAg清除率明顯高于停藥時(shí)HBV RNA高水平的患者(30.9% vs 1.6%，P=0.007)[18]。同樣，本團(tuán)隊(duì)既往研究發(fā)現(xiàn)，停藥時(shí)血清HBV RNA陰性且HBcrAg低水平的HBeAg陽(yáng)性患者停藥后第4年的HBsAg清除率顯著高于其他患者(16.1% vs 1.3%，P=0.002)[17]。然而，對(duì)于HBeAg陰性的患者，NAs停藥后 HBsAg轉(zhuǎn)陰患者中的血清HBV RNA陰性率雖高于停藥后HBsAg持續(xù)陽(yáng)性者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(88% vs 47%，P=0.053)[19]。此外，對(duì)于IFN治療的患者，無(wú)論初治時(shí)HBeAg狀態(tài)如何，血清HBV RNA對(duì)IFN治療后HBsAg轉(zhuǎn)陰的預(yù)測(cè)效能均不如HBsAg定量[15, 20]。

(五)血清HBV RNA預(yù)測(cè)HCC發(fā)生 近來(lái)，研究表明CHB患者的血清HBV RNA水平也與HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。2021年，來(lái)自香港的一項(xiàng)小樣本量病例對(duì)照研究首次發(fā)現(xiàn)，HCC組患者在既往治療過(guò)程中的血清HBV RNA陽(yáng)性率和HBV RNA水平均顯著高于非HCC組[21]。隨后，本團(tuán)隊(duì)基于一項(xiàng)大型前瞻性NAs抗病毒治療隊(duì)列，進(jìn)一步證實(shí)高水平血清HBV RNA可增加CHB患者的HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[22]。首先，入組時(shí)血清HBV RNA陽(yáng)性患者隨訪(fǎng)5年的HCC累計(jì)發(fā)生率顯著高于HBV RNA陰性組(4.1% vs 1.8%，P=0.009)。校正其他病毒和非病毒因素后，入組時(shí)血清HBV RNA陽(yáng)性患者的HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是RNA陰性組的2.21倍(P=0.005)。進(jìn)一步根據(jù)入組時(shí)血清HBV RNA定量結(jié)果將患者分為低、中、高水平3組，發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA水平越高，患者HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高。此外，血清HBV DNA/RNA雙陽(yáng)性患者的HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)為DNA/RNA雙陰性患者的4.02倍(P=0.001)。需要注意的是，以上研究均缺乏抗病毒治療基線(xiàn)和治療前的血清HBV RNA數(shù)據(jù)，未來(lái)仍需在更大樣本量的研究中進(jìn)一步探索疾病不同階段血清HBV RNA 水平及其動(dòng)態(tài)變化與HCC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

三、總結(jié)與展望

血清HBV RNA的分子特征較為復(fù)雜，目前不同實(shí)驗(yàn)室采用的擴(kuò)增靶點(diǎn)和定量方法不同，可能檢測(cè)到不同種類(lèi)的HBV RNA，并產(chǎn)生對(duì)血清HBV RNA臨床價(jià)值的不同解讀。因此，在將血清HBV RNA廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐之前，仍有如下問(wèn)題亟待解決：(1)建立統(tǒng)一的HBV RNA國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，開(kāi)發(fā)靈敏度、特異度和可靠性高的標(biāo)準(zhǔn)化血清HBV RNA定量分析方法或檢測(cè)試劑盒，以更準(zhǔn)確、全面地闡明血清HBV RNA與CHB患者臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)；(2)需進(jìn)一步確定不同種類(lèi)和存在形式的血清HBV RNA在不同臨床場(chǎng)景下是否具有特定的預(yù)測(cè)價(jià)值；(3)在抗病毒治療過(guò)程中進(jìn)一步明確血清HBV RNA的種類(lèi)和存在形式的組成是否也在發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)這種變化是否與疾病進(jìn)展和臨床預(yù)后相關(guān)；(4)探究血清HBV RNA在其他臨床場(chǎng)景中的應(yīng)用價(jià)值，如明確血清HBV RNA對(duì)隱匿性HBV感染患者病毒再激活的預(yù)測(cè)作用等。

如今，血清HBV RNA作為一種新型無(wú)創(chuàng)病毒學(xué)標(biāo)志物，已入選國(guó)內(nèi)外多個(gè)有關(guān)CHB診療的指南和專(zhuān)家共識(shí)。未來(lái)仍需進(jìn)一步探究血清HBV RNA的分子生物學(xué)特征，同時(shí)需借助大樣本量的前瞻性研究深入探討血清HBV RNA本身及其聯(lián)合傳統(tǒng)病毒指標(biāo)(如HBV DNA，HBsAg和HBeAg等)在更多臨床場(chǎng)景中的應(yīng)用價(jià)值，為CHB患者的管理策略提供新思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。