楊麒琳，馬韞楠，楊萬(wàn)青，汪文杰，鐘宛凌，樊簫雨，楊天姿，杜守穎，李鵬躍（北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029）

2020年版《中國(guó)藥典》收錄的地龍為鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E. Perrier）、通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulgarisChen（P. vulgaris）、威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或櫛盲環(huán)毛蚓Pheretima pectiniferaMichaelsen 的干燥體[1]。前一種習(xí)稱“廣地龍”，主產(chǎn)地為廣東、廣西、海南等；后3種習(xí)稱“滬地龍”，主產(chǎn)地為上海、江蘇、浙江等[2]。我國(guó)地龍藥材的基原動(dòng)物主要有14個(gè)品種，分別屬于鉅蚓科（Megascolec-idae）、正蚓科（Lmubricidae）和鏈胃蚓科（Moniligastridae）5 個(gè)屬[3]。赤子愛勝蚓Eisenia foetida（Savigny）為正蚓科愛勝蚓屬，俗稱紅蚯蚓，其繁殖率高，適宜人工養(yǎng)殖，是目前世界上養(yǎng)殖最普遍的蚯蚓品種[4]。地龍及混淆品的基原動(dòng)物種類繁多，且形態(tài)極其相似，容易造成品種混雜和摻假的現(xiàn)象[5]。通過(guò) DNA 分子水平進(jìn)行物種的鑒別是近年來(lái)興起的物種鑒定新方法，在中藥材鑒定領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。格小光等[6]采集全國(guó)多個(gè)藥材市場(chǎng)的地龍，進(jìn)行 DNA分子鑒定，與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn) 55% 的市售地龍均非藥典規(guī)定的基原。因此采用 DNA 分子鑒定地龍是有效的手段。

現(xiàn)代研究表明，地龍中含有的化學(xué)成分主要有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核苷、有機(jī)酸、脂質(zhì)等[7]，其中地龍內(nèi)含有的蛋白多肽類成分高達(dá) 55%～68%[8]。目前有關(guān)赤子愛勝蚓的研究大多集中在其對(duì)環(huán)境污染物的富集、生物降解等方面[9]。而赤子愛勝蚓不僅在環(huán)境保護(hù)方面發(fā)揮功能，同時(shí)也是一種有效的抗血栓藥材。赤子愛勝蚓是藥典地龍品種之外研究抗血栓活性較多的蚯蚓品種。20世紀(jì) 80年代日本學(xué)家 Mihara[10]首次從赤子愛勝蚓中分離得到具有纖溶酶活性的蛋白酶，后來(lái)研究者們開始研究蚯蚓具有抗血栓功效的蛋白多肽類成分，發(fā)現(xiàn)地龍蛋白中的纖維蛋白溶解酶、蚓激酶、蚓膠原酶對(duì)體內(nèi)凝血系統(tǒng)具有顯著的影響，是抗凝血活性物質(zhì)的主要成分[11]。乙醇沉淀法是純化蛋白常用方法，是利用蛋白的溶解度進(jìn)行分離純化，彭洪兵等[12]對(duì)比鹽析法和水提醇沉法對(duì)地龍蛋白活性的影響，結(jié)果表明水提醇沉法的蛋白提取率及纖溶活性均高于鹽析法。因此本實(shí)驗(yàn)選擇藥典內(nèi)的滬地龍品種之一通俗環(huán)毛蚓和廣地龍的品種參環(huán)毛蚓與藥典外的赤子愛勝蚓，對(duì)比這3種蚯蚓水提液以及乙醇沉淀物的抗血栓活性大小，為今后地龍抗血栓類產(chǎn)品的開發(fā)選擇蚯蚓品種提供參考。

1 材料

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（PHGT-9140A），臺(tái)式高速離心機(jī)（5418 R，Eppendorf），超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000，Thermo），PCR儀（C1000，Bio-Rad）、電泳儀（PowerPac，Bio-Rad），凝膠成像儀（UVP，Upland），微量移液器（Eppendorf），Milli Q 超純水機(jī)（Millipore），pH計(jì)（FE20，Mettler Toledo），恒溫空氣浴搖床（INNOVA 40R，New Brunswick），勻漿機(jī)（QSJ1 型，OIDIRE），電動(dòng)攪拌器（OES20 型，BNCH），臺(tái)式離心機(jī)（TDL80-2B 型，上海安亭科學(xué)儀器廠），Multiscan Go 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo Scientific），電子天平（BS224S 型，Sartorius），Sysmex CA500 全自動(dòng)血凝分析儀（Sysmex）。

鮮體通俗環(huán)毛蚓（上海市地龍養(yǎng)殖基地），鮮體赤子愛勝蚓（天津市蚯蚓培養(yǎng)基地），鮮體參環(huán)毛蚓（廣西蚯蚓養(yǎng)殖基地），基因組提取試劑盒Mollusc DNA Kit D3373（OMEGA Bio-tek，America），F(xiàn)ast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit、5minTM TA /Blunt-Zero Cloning Kit、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、Fast-T1 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞C505-02/03（Vazyme，南京諾唯贊生物科技有限公司），無(wú)水乙醇（Fisher），氯仿（北京科華經(jīng)緯科技有限公司），異戊醇（X1，西隴化工股份有限公司），氯化鈉、氫氧化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），Tris、EDTA（Bioruler，America），冰醋酸（北京化工股份有限公司），Tryptone、Yeast Extract（OXOID），瓊脂糖（Biowest Agarose，北京拜爾迪生物有限公司），6x SuperStain Loading Buffer（北京康為試劑生物科技有限公司），Agar粉（北京索萊寶科技有限公司），氨芐青霉素鈉（北京百瑞極生物科技有限公司），COI通用引物（COI-F：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'，COI-R：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，Tm 值為 54），纖維蛋白原（牛血）（批號(hào)：140607-202042）、凝血酶（牛血）（批號(hào)：140606-201826）、蚓激酶（批號(hào)：140650-201703）（中國(guó)食品藥品檢定研究院），生理鹽水（山東華魯制藥有限公司，批號(hào)：SD21061115），瓊脂糖（上海貝晶），藥用級(jí)95%乙醇。

2 方法

2.1 3種蚯蚓的分子鑒定

2.1.1 蚯蚓DNA的提取 在研缽中放入活體蚯蚓2 cm的肌肉組織，加入液氮冷凍，快速研磨成粉，按照軟體動(dòng)物基因組提取試劑盒（Mollusc DNA Kit D3373）說(shuō)明書提取蚯蚓基因組 DNA，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并通過(guò)NanoDrop 2000 進(jìn)行濃度及純度檢測(cè)。

2.1.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè) 根據(jù)PCR擴(kuò)增試劑盒（Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit）說(shuō)明書加入通用引物、DNA 和試劑，PCR的反應(yīng)程序以50 μL反應(yīng)體系建立，具體程序見表1。1% 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接至質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌，將菌液送華大基因進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后，將克隆的基因片段在National Center for Biotechnology Information（NCBI）中進(jìn)行 BLAST 搜索比對(duì)。

表1 PCR反應(yīng)程序Tab 1 PCR reaction procedure

2.2 3種蚯蚓水提液及乙醇沉淀物的纖溶、抗凝活性對(duì)比

2.2.1 3種蚯蚓水提液的制備 將鮮體蚯蚓切碎，用打漿機(jī)制成蚯蚓泥，加4倍量純水，勻漿處理，離心（4000 r·min-1，15 min），收集上清液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)至檢測(cè)范圍內(nèi)作為測(cè)試樣品。

2.2.2 3種蚯蚓乙醇沉淀物的制備 取鮮體蚯蚓制備的水提液，加定量 95% 乙醇，調(diào)至乙醇濃度為80%，靜置后收集沉淀，凍干。稱取 10 mg 乙醇沉淀物加 10 mL 生理鹽水溶解，稀釋適當(dāng)倍數(shù)至檢測(cè)范圍內(nèi)作為測(cè)試樣品。

2.2.3 纖維蛋白平板法評(píng)價(jià)纖溶活性 參考劉濤等[13]利用纖維蛋白平板法，以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定地龍中蛋白酶的活性，本實(shí)驗(yàn)采用蚓激酶作為標(biāo)準(zhǔn)品。取一次性平皿，加入0.5 mL凝血酶（40 BP·mL-1）。將8 mL纖維蛋白原（2 mg·mL-1）與10 mL的瓊脂糖溶液（5 mg·mL-1）迅速混合后加入皿中，輕輕搖勻，室溫水平放置1 h后打孔，分別吸取10 μL濃度為4000、6000、8000、10 000、12 000、16 000 U·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶以及“2.2.1”項(xiàng)下制得的測(cè)試樣品進(jìn)行點(diǎn)樣加蓋，置37℃恒溫箱中孵育18 h，取出，測(cè)量溶圈垂直兩直徑，以標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶單位數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，垂直兩直徑乘積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制回歸方程，計(jì)算樣品效價(jià)單位數(shù)作為纖溶活性，利用公式1計(jì)算纖溶比活（U·μg-1）。

公式 1：纖溶比活（U·μg-1）＝纖溶活性（U·mL-1）/蛋白濃度（μg·mL-1）

2.2.4 Fibg-TT法評(píng)價(jià)抗凝活性 參考吳婭麗等[14]利用全自動(dòng)血凝分析儀測(cè)定纖維蛋白原-凝血酶時(shí)間（Fibg-TT）來(lái)評(píng)價(jià)地龍及其相關(guān)制劑的體外抗凝活性。以生理鹽水為空白對(duì)照，測(cè)定系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶液（250、500、1000、1500、2000 U·mL-1）和測(cè)試樣品，以標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶的單位數(shù)為橫坐標(biāo)，以系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品蚓激酶 Fibg-TT 的對(duì)數(shù)與空白組 Fibg-TT 的對(duì)數(shù)的差值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得樣品效價(jià)單位數(shù)作為抗凝活性，利用公式 2 計(jì)算抗凝比活（U·μg-1）。

公式2：抗凝比活（U·μg-1）＝抗凝活性（U·mL-1）/蛋白濃度（μg·mL-1）

2.3 蛋白含量測(cè)定

采用BCA法測(cè)定蚯蚓蛋白含量，測(cè)試樣品用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，以系列濃度BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量。

2.4 SDS-PAGE 凝膠電泳

采用 SDS-PAGE檢測(cè)3種蚯蚓乙醇沉淀物的分子量，每個(gè)樣品上樣 10 μL。采用 12% 電泳預(yù)制膠，電壓為 150 V，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)蛋白膠快速染色液染色，最后用純水脫色至背景清晰，重復(fù)2次。

2.5 數(shù)據(jù)處理

每種蚯蚓從提取到測(cè)試重復(fù) 3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 3種蚯蚓的分子鑒定結(jié)果

3.1.1 蚯蚓 DNA 的提取、PCR 擴(kuò)增 對(duì)3種蚯蚓提取的 DNA 進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，DNA 條帶均清晰明亮，無(wú)彌散情況，如圖 1。3種蚯蚓提取的 DNA 的A260/280均在 1.8～2.0，表明提取的DNA 純度較高，無(wú)蛋白質(zhì)污染。利用通用引物COI對(duì)3種蚯蚓提取的 DNA 片段進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶均呈現(xiàn)整齊、單一明亮的條帶，如圖 2。

圖1 3種蚯蚓提取的 DNA 的瓊脂糖電泳Fig 1 Agarose electrophoresis of DNA of the three earthworms

圖2 3種蚯蚓 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳Fig 2 Agarose electrophoresis of PCR products of the three earthworms

3.1.2 PCR 產(chǎn)物測(cè)序分析 去除載體 TOPO 序列及引物端可知擴(kuò)增的COI基因片段大小分別是：參環(huán)毛蚓為 709 bp、赤子愛勝蚓為 768 bp、通俗環(huán)毛蚓為 765 bp。BLAST 相似性比對(duì)結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)3種蚯蚓都能成功匹配上對(duì)應(yīng)物種。其中本實(shí)驗(yàn)樣品通俗環(huán)毛蚓與 NCBI 基因庫(kù)中報(bào)道的所有已知基原的蚯蚓序列相似度最高的為通俗腔蚓（Metaphire Vulgaris）線粒體基因COIKF205980.1，相似度為 99.27%。通俗腔蚓與通俗環(huán)毛蚓為同名異物現(xiàn)象，該現(xiàn)象是由于蚯蚓分類系統(tǒng)的改進(jìn)而出現(xiàn)的結(jié)果[15]。本實(shí)驗(yàn)樣品赤子愛勝蚓與 NCBI 基因庫(kù)中報(bào)道的所有已知基原的蚯蚓序列相似度最高的為赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）線粒體基因COILC006114.1，相似度為98.87%。本實(shí)驗(yàn)樣品參環(huán)毛蚓與 NCBI 基因庫(kù)中報(bào)道的所有已知基原的蚯蚓序列相似度最高的為參環(huán)毛蚓（Pheretima aspergillum）線粒體基因COIMN729554.1，相似度為 99.85%。

3.2 3種蚯蚓水提液的纖溶、抗凝活性對(duì)比

計(jì)算3批參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓水提液的纖溶比活、抗凝比活和蛋白含量百分比，具體結(jié)果如表 2 所示。3種蚯蚓的水提液纖溶比活用單因素方差分析檢驗(yàn)，LSD 法進(jìn)行兩兩比較，F(xiàn)＝1753.750，P＜0.05；3種蚯蚓的水提液抗凝比活用單因素方差分析檢驗(yàn)，LSD 法進(jìn)行兩兩比較，F(xiàn)＝274.35，P＜0.05。因此3種蚯蚓水提液的纖溶比活之間與抗凝比活之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示參環(huán)毛蚓水提液的纖溶比活和抗凝比活最強(qiáng)，通俗環(huán)毛蚓次之，赤子愛勝蚓水提液的纖溶比活和抗凝比活遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于參環(huán)毛蚓和通俗環(huán)毛蚓，而赤子愛勝蚓水提液的蛋白含量最高。

表2 參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓水提液的纖溶比活、抗凝比活與蛋白含量(n＝3)Tab 2 Specific activity of fibrinolysis，specific activity of anticoagulation and protein content of water extracts from Pheretima aspergillum，Pheretima vulgaris and Eisenia fetida (n＝3)

3.3 3種蚯蚓乙醇沉淀物的纖溶、抗凝活性對(duì)比

3批參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓乙醇沉淀物的纖溶比活、抗凝比活和蛋白含量百分比結(jié)果見表 3。3種蚯蚓的乙醇沉淀物纖溶比活用單因素方差分析檢驗(yàn)，LSD 法進(jìn)行兩兩比較，F(xiàn)＝1053.967，P＜0.05；3種蚯蚓的乙醇沉淀物抗凝比活用單因素方差分析檢驗(yàn)，LSD 法進(jìn)行兩兩比較，F(xiàn)＝127.904，P＜0.05。因此3種蚯蚓乙醇沉淀物的纖溶比活之間和抗凝比活之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果參環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的纖溶比活最強(qiáng)，通俗環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的抗凝比活最強(qiáng)，赤子愛勝蚓的纖溶比活、抗凝比活、蛋白含量均小于參環(huán)毛蚓和通俗環(huán)毛蚓。

表3 參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、赤子愛勝蚓乙醇沉淀物的纖溶比活、抗凝比活與蛋白含量(n＝3)Tab 3 Specific activity of fibrinolysis，specific activity of anticoagulation and protein content of ethanol precipitates from Pheretima aspergillum，Pheretima vulgaris and Eisenia fetida (n＝3)

3.4 SDS-PAGE 結(jié)果分析

重復(fù)2次結(jié)果一致性較好，典型圖譜見圖3，通俗環(huán)毛蚓與參環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的條帶集中在25～70 kDa，但條帶分布有所差異，而赤子愛勝蚓乙醇沉淀物的條帶集中在 25～40 kDa，條帶數(shù)量較前兩種蚯蚓少。其中參環(huán)毛蚓乙醇分級(jí)沉淀物在 55～70 kDa分布一個(gè)較為清晰的條帶，通俗環(huán)毛蚓乙醇分級(jí)沉淀物在 25～35 kDa 分布一個(gè)較為清晰的條帶。3種蚯蚓的乙醇分級(jí)沉淀物均在 10～15 kDa 有一條較寬的條帶。

圖3 3種蚯蚓乙醇沉淀物的 SDS-PAGE 圖Fig 3 SDS-PAGE of ethanol precipitates from three earthworms

4 討論

雖然形態(tài)鑒定是傳統(tǒng)鑒定方法，但地龍的外表形態(tài)特征相似，僅通過(guò)形態(tài)鑒定無(wú)法確定品種，容易受主觀因素影響，且混雜品種較多，采用 DNA 分子鑒定可以更準(zhǔn)確、高效地鑒定地龍品種。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基于COI基因?qū)︴r體地龍進(jìn)行DNA 分子鑒定，序列結(jié)果與 NCBI 中的基因庫(kù)對(duì)比，與已知地龍品種的序列相似度均在 98% 以上，以此相似度可確定品種，有效鑒定出參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓和赤子愛勝蚓。

不同地龍含有的抗血栓活性蛋白有所區(qū)別，抗血栓的能力也有差別。本研究結(jié)果表明，參環(huán)毛蚓的水提液抗凝比活和纖溶比活最強(qiáng)；參環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的纖溶比活最強(qiáng)，而通俗環(huán)毛蚓乙醇沉淀物的抗凝比活最強(qiáng)；赤子愛勝蚓的水提液和乙醇沉淀物的抗凝比活和纖溶比活都遠(yuǎn)小于前兩者。赤子愛勝蚓中發(fā)揮抗血栓作用的主要是蚓激酶，這說(shuō)明藥典內(nèi)的兩種地龍?bào)w內(nèi)含有除蚓激酶之外獨(dú)特的蛋白，其具有較高的抗血栓活性。通過(guò)縱向?qū)Ρ?，蚯蚓乙醇沉淀物的抗凝比活與纖溶比活均強(qiáng)于蚯蚓的水提液，可知通過(guò)乙醇沉淀法可以有效純化富集抗血栓地龍蛋白。

參環(huán)毛蚓的水提液抗凝活性更強(qiáng)，而通俗環(huán)毛蚓的乙醇沉淀物抗凝活性更強(qiáng)，可能因?yàn)橥ㄋ篆h(huán)毛蚓水提液中含有非抗凝血蛋白和非蛋白物質(zhì)含量較高，且雜蛋白中可能有促凝血的蛋白，用乙醇純化后，去除了部分雜質(zhì)，使得通俗環(huán)毛蚓中抗凝蛋白能更充分地發(fā)揮其作用。同時(shí)也說(shuō)明地龍蛋白是主要具有抗凝活性的物質(zhì)，且純度越高作用越明顯。赤子愛勝蚓用水提取后的蛋白含量在三者間最高，再用乙醇純化后蛋白含量反而最低，推測(cè)赤子愛勝蚓體內(nèi)含有大量非抗血栓活性蛋白和非蛋白物質(zhì)，或者用乙醇純化赤子愛勝蚓蛋白效率較低，應(yīng)該另尋找更適合的純化方法。

3種蚯蚓乙醇沉淀物在 25～40 kDa 均有較明顯的條帶，說(shuō)明地龍具有抗血栓活性的獨(dú)特蛋白分子量分布于此，但條帶分布有明顯差異，說(shuō)明3種蚯蚓中具有抗血栓活性蛋白有所差異。

從本研究結(jié)果可看出，藥典內(nèi)的兩種蚯蚓的水提液和乙醇沉淀物的抗凝活性和纖溶活性都遠(yuǎn)強(qiáng)于赤子愛勝蚓，而目前研究較多的是藥典以外的蚯蚓品種（赤子愛勝蚓、粉正蚓）等，關(guān)于藥典內(nèi)的地龍研究較少，且通俗環(huán)毛蚓和參環(huán)毛蚓分布廣，數(shù)量多，因此深入研究藥典內(nèi)地龍的基原蚯蚓的抗血栓活性蛋白具有重大意義。本實(shí)驗(yàn)僅研究了3種蚯蚓水提液和乙醇沉淀物的纖溶和抗凝活性，后續(xù)可進(jìn)一步純化參環(huán)毛蚓和通俗環(huán)毛蚓蛋白的抗血栓活性部位，研究其體內(nèi)外的活性及物質(zhì)基礎(chǔ)。