陶曉倩，張強(qiáng)，付慧敏，張純剛，2，3*，程嵐*（. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 6620；2. 長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，山西 長(zhǎng)治 046000；3. 祈蒙股份有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024330）

紫蘇葉為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的干燥葉（或帶嫩枝）[1]，是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，是衛(wèi)生部頒布的首批既是食品又是藥品的60種中藥之一[2]。紫蘇葉中含有豐富的揮發(fā)油，主要包括紫蘇酮、紫蘇醛、紫蘇烯、石竹烯、α-法尼烯等31種成分，可分為紫蘇酮（PK）型、紫蘇醛（PA）型、芳香族化合物（PP）型、香薷酮（EK）型、紫蘇烯（PL）型五個(gè)化學(xué)型[3]，其中以紫蘇酮含量較多的PK型和以紫蘇醛及檸檬烯含量較多的PA型為主流化學(xué)型[4]。紫蘇葉揮發(fā)油（以下簡(jiǎn)稱紫蘇葉油）具有多種生物活性，包括抗氧化、抗菌、抗過(guò)敏、抗抑郁、抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等[5]。研究表明，紫蘇葉油中的紫蘇醛是重要的活性成分，具有治療口咽念珠菌病的抗真菌作用[6]；治療結(jié)腸炎小鼠模型的抗炎活性[7]；治療與氧化應(yīng)激有關(guān)疾病的潛在抗氧化作用[8]等。

水蒸氣蒸餾法是最經(jīng)典、最常用的揮發(fā)油提取方法，具有操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求不高、成本低廉、適合工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)[9]，多年來(lái)仍為揮發(fā)油提取的國(guó)標(biāo)方法[10]。紫蘇醛作為紫蘇葉油中重要的有效成分，以其為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化紫蘇葉油的提取工藝尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以紫蘇葉油提取率與紫蘇醛含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以料液比、浸泡時(shí)間、加熱時(shí)間為考察因素，利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇葉油的提取工藝，以期為紫蘇葉的開(kāi)發(fā)利用及深入研究提供參考。

1 材料

1.1 試藥

紫蘇葉購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮教授鑒定為唇形科紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的干燥葉（或帶嫩枝）。紫蘇醛對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111806-201806，純度：95.7%），甲醇（瑞典歐森巴克化學(xué)公司，色譜純），甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純），純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.2 儀器

LC-1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司，包括四元泵，VWD可變波長(zhǎng)掃描紫外檢測(cè)器，Chemstations化學(xué)工作站），CP225D十萬(wàn)分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，SG3300H超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司），TGL-16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），DZTW調(diào)溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），高速多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司），揮發(fā)油提取器（太原三益生物有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫蘇葉油提取

參考《中國(guó)藥典》2020年版（四部）通則2204揮發(fā)油測(cè)定法[11]，取剪碎的紫蘇葉適量，置于燒瓶中，加水適量，搖勻混合后，浸泡一定時(shí)間，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加水，使充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分并溢流入燒瓶時(shí)為止。置電熱套中緩緩加熱至沸，從冷凝管中回流下第一滴油水混合物時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，保持微沸，一定時(shí)間后停止加熱，放置1 h，吸取油層，12 000 r·min-1離心3 min，吸取油層，減重法得紫蘇葉油質(zhì)量（m油），其與紫蘇葉的質(zhì)量（m葉）百分比即為紫蘇葉油提取率（m紫蘇葉油）。

m紫蘇葉油（%）＝m油/m葉×100%

2.2 紫蘇醛含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ChromCore AR C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；預(yù)柱：Phenomenex C18（2.0 mm×4.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（75∶25，V/V）；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱量4.70 mg紫蘇醛對(duì)照品于10 mL量瓶中，加適量甲醇，超聲10 min，放至室溫，定容后搖勻，得450 μg·mL-1的紫蘇醛對(duì)照品儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取0.2 mL紫蘇醛對(duì)照品儲(chǔ)備液于100 mL量瓶中，甲醇定容，即得0.90 μg·mL-1紫蘇醛對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱量5.00 mg紫蘇葉油于10 mL量瓶中，加適量甲醇，超聲10 min，放至室溫，定容后搖勻。準(zhǔn)確移取1 mL至10 mL量瓶中，定容，搖勻，過(guò)0.2 μm有機(jī)濾膜，供高效液相色譜分析用。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取1 mL紫蘇醛對(duì)照品儲(chǔ)備液于10 mL量瓶中，甲醇定容，得45 μg·mL-1的紫蘇醛對(duì)照品溶液。采用逐級(jí)稀釋的方法，將上述紫蘇醛對(duì)照品溶液稀釋成各質(zhì)量濃度為0.11、0.23、0.45、0.90、2.25、4.50、11.25、22.5 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。進(jìn)樣測(cè)定紫蘇醛含量，以對(duì)照品紫蘇醛的質(zhì)量濃度X（μg·mL-1）和峰面積Y繪制回歸曲線，得回歸方程Y＝86.62X-6.437（R2＝0.9999），表明紫蘇醛在0.11～22.5 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別取甲醇（陰性樣品）、紫蘇醛對(duì)照品溶液及紫蘇葉油供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。紫蘇醛色譜峰與其他組分峰可達(dá)基線分離，紫蘇葉油供試品與紫蘇醛對(duì)照品在相同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)同一色譜峰，陰性對(duì)照品無(wú)干擾，紫蘇醛保留時(shí)間為5.241min。

圖1 陰性樣品（A）、紫蘇醛對(duì)照品（B）及紫蘇葉油供試品（C）的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of negative sample（A），perillaldehyde control substance（B）and volatile oil from perillae folium test sample（C）

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取同一紫蘇葉油供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄紫蘇醛峰面積，計(jì)算紫蘇醛含量分別為1.9%、1.6%、1.6%、1.6%、1.6%、1.6%，RSD＜2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的紫蘇葉，按“2.1”項(xiàng)下紫蘇葉油提取方法提取紫蘇葉油樣品6份，按 “2.2.3”項(xiàng)下方法制備紫蘇油供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄紫蘇醛峰面積，計(jì)算紫蘇醛含量分別為1.6%、1.6%、1.6%、1.6%、1.6%、1.6%，RSD＜1%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一紫蘇葉油供試品溶液，在0、2、4、6、8、12、24 h按“2.2.1”項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄紫蘇醛峰面積，計(jì)算紫蘇油中紫蘇醛的含量分別為1.7%、1.6%、1.6%、1.7%、1.7%、1.6%、1.7%，RSD＜2%，表明紫蘇油供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收試驗(yàn) 向6份1 mL已知濃度的紫蘇葉油樣品溶液中分別加入1 mL相同濃度的紫蘇醛對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，測(cè)得平均加樣回收率為99.42%，RSD＜2%。表明測(cè)定方法符合要求。

2.2.10 紫蘇葉油中紫蘇醛含量測(cè)定 精密稱量紫蘇葉油適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算紫蘇醛含量。

m紫蘇醛（%）＝A2C1/A1C2×100%

其中，m紫蘇醛為紫蘇葉油中紫蘇醛的含量，A1為紫蘇醛對(duì)照品的峰面積，A2為紫蘇葉油供試品的峰面積，C1為紫蘇醛對(duì)照品濃度，C2為紫蘇葉油濃度。

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2019b作圖，Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析，GraphPad Prism 9進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 紫蘇葉前處理方式 以紫蘇葉粉碎與剪碎兩種前處理方式處理紫蘇葉。取適量紫蘇葉，分別粉碎過(guò)60目篩、剪碎，以料液比（g/mL）為1∶20加水，浸泡0.75 h，加熱3 h，進(jìn)樣測(cè)定，比較紫蘇葉油提取率及紫蘇醛含量。

由圖2可知，當(dāng)其他試驗(yàn)條件相同時(shí)，紫蘇葉經(jīng)粉碎后揮發(fā)油含量明顯降低，可能是由于粉碎過(guò)程中粉碎機(jī)運(yùn)作時(shí)的產(chǎn)熱作用，導(dǎo)致紫蘇葉油的揮發(fā)，使紫蘇葉油的含量明顯降低；而剪碎與粉碎得到的紫蘇醛含量相差不大，故選擇前處理方式為剪碎。

圖2 前處理方式對(duì)紫蘇葉油提取率及紫蘇醛含量的影響Fig 2 Effect of pretreatment on the extraction yield of volatile oil from perillae folium and perillaldehyde content

2.4.2 料液比 取適量紫蘇葉，剪碎，分別以料液比1∶10、1∶12、1∶15、1∶20、1∶25加水，浸泡0.75 h，加熱3 h，進(jìn)樣測(cè)定，比較紫蘇葉油提取率及紫蘇醛含量。

隨著加水量的增加，紫蘇葉油提取率與紫蘇醛含量均顯著增加，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，紫蘇葉油提取率達(dá)到最高（0.607%），而當(dāng)料液比為1∶12時(shí)紫蘇醛含量達(dá)到最大（10.332%），之后紫蘇葉油提取率與紫蘇醛含量均隨加水量的增加而顯著降低。當(dāng)加水量增大時(shí)，有利于紫蘇葉油及紫蘇醛在水蒸氣中的擴(kuò)散和溶解；但是當(dāng)加水量過(guò)大時(shí)，加熱時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，相同加熱時(shí)間內(nèi)生成的紫蘇葉油及紫蘇醛含量減少，且易造成資源浪費(fèi)。因此選擇料液比1∶12、1∶16、1∶20三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.4.3 浸泡時(shí)間 取適量紫蘇葉，剪碎，以料液比1∶20加水，分別浸泡0、0.5、0.75、1、2 h，加熱3 h，進(jìn)樣測(cè)定，比較紫蘇葉油提取率及紫蘇醛含量。

隨著浸泡時(shí)間的增加紫蘇葉油提取率顯著升高，當(dāng)浸泡時(shí)間達(dá)到0.75 h時(shí)，紫蘇葉油提取率達(dá)到最大值（0.607%）。而紫蘇醛含量隨浸泡時(shí)間的增加呈顯著下降趨勢(shì)，綜合選擇0.5、0.75、1 h進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.4.4 加熱時(shí)間 取適量紫蘇葉，剪碎，以料液比1∶20加水，浸泡0.75 h，加熱1、1.5、2、3、4 h，進(jìn)樣測(cè)定，比較紫蘇葉油提取率及紫蘇醛含量。

隨著加熱時(shí)間的增加紫蘇葉油提取率顯著升高，當(dāng)加熱時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，紫蘇葉油提取率達(dá)到最大值。隨著加熱時(shí)間的增加紫蘇醛含量下降，綜合考慮選擇加熱2、3、4 h進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)考察。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素影響試驗(yàn)結(jié)果，以料液比（A）、浸泡時(shí)間（B）、加熱時(shí)間（C）為考察因素，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平表Tab 1 Factor and level of Box-Behnken design

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)條件進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定不同條件下紫蘇葉油的提取率及紫蘇醛含量，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5.2 回歸模型的建立和方差分析 以紫蘇葉油提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到紫蘇葉油提取率的多元二次回歸方程為R＝0.51+0.048A+0.033B+0.038C-6.725×10-3AB-0.024AC-1.750×10-3BC-0.046A2-0.028B2-6.902×10-3C2。由表3回歸模型方差分析表可知，一次項(xiàng)A、B、C和二次項(xiàng)A2對(duì)提取得到的紫蘇葉油提取率影響極顯著，交互項(xiàng)AC和二次項(xiàng)B2對(duì)提取得到的紫蘇葉油提取率影響顯著，其他因素影響不顯著。影響紫蘇葉油提取率的因素順序?yàn)椋篈＞C＞B，即料液比＞加熱時(shí)間＞浸泡時(shí)間。此模型的P＝0.0005，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到了顯著水平（P＜0.01），失擬項(xiàng)（P＝0.2985＞0.05）不顯著，變異系數(shù)3.93%（＜10%），說(shuō)明非試驗(yàn)因素對(duì)結(jié)果影響不大，模型具有較好的試驗(yàn)穩(wěn)定性。模型相關(guān)系數(shù)R2為0.9578，說(shuō)明實(shí)際試驗(yàn)中約95.78%的結(jié)果可以通過(guò)擬合模型進(jìn)行解釋，擬合效果較好，試驗(yàn)誤差較小。校正后的決定系數(shù)為0.9035，說(shuō)明該模型能解釋響應(yīng)值變化的90.35%，因此該方程能很好地預(yù)測(cè)和解釋紫蘇葉油提取率隨各個(gè)影響因素變化的規(guī)律。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab 2 Response surface test design and results

表3 回歸模型方差分析Tab 3 Variance analysis for the regression model

以紫蘇醛含量為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到紫蘇醛含量的多元二次回歸方程為R＝9.54-0.089A-0.47B-0.99C-0.29AB-0.039AC+0.23BC-1.53A2+0.17B2+0.38C2。由表4回歸模型方差分析表可知，一次項(xiàng)B、C和二次項(xiàng)A2對(duì)提取得到的紫蘇醛含量影響極顯著，二次項(xiàng)C2對(duì)提取得到的紫蘇醛含量影響顯著，其他因素影響不顯著。影響紫蘇醛含量的因素順序?yàn)椋篊＞B＞A，即加熱時(shí)間＞浸泡時(shí)間＞料液比。此模型的P＜0.0001，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01），失擬項(xiàng)（P＝0.9858＞0.05）不顯著，變異系數(shù)3.01%（＜10%），說(shuō)明非試驗(yàn)因素對(duì)結(jié)果影響不大，模型具有較好的試驗(yàn)穩(wěn)定性。模型相關(guān)系數(shù)R2為0.9751，說(shuō)明實(shí)際試驗(yàn)中約97.51%的結(jié)果可以通過(guò)擬合模型進(jìn)行解釋，擬合效果較好，試驗(yàn)誤差較小。校正后的決定系數(shù)為0.9432，說(shuō)明該模型能解釋響應(yīng)值變化的94.32%，因此該方程能很好地預(yù)測(cè)和解釋紫蘇醛含量隨各個(gè)影響因素變化的規(guī)律。

2.5.3 Box-Behnken響應(yīng)面分析交互作用 在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件依據(jù)回歸方程繪制等高線圖及響應(yīng)面圖，分析料液比、浸泡時(shí)間、加熱時(shí)間對(duì)紫蘇葉油提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。等高線圖與響應(yīng)面圖能直觀反應(yīng)交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響程度，曲面越陡，等高線越密集，表示影響越顯著[12-15]。由圖3可知，紫蘇葉油提取率隨料液比、浸泡時(shí)間和加熱時(shí)間的升高變化幅度不同，但均呈現(xiàn)先增大后降低的變化趨勢(shì)。料液比與加熱時(shí)間的響應(yīng)面曲線較彎曲且等高線呈橢圓形，表明料液比與加熱時(shí)間的交互作用對(duì)紫蘇葉油提取率的影響顯著（P＞0.05），料液比與浸泡時(shí)間的交互作用對(duì)紫蘇葉油提取率的影響次之，浸泡時(shí)間與加熱時(shí)間等高線趨于圓形，表明兩者的交互作用對(duì)紫蘇葉油的提取率影響最小。

圖3 各因素交互作用對(duì)紫蘇葉油提取率的影響Fig 3 Effect of interaction of various factors on extraction yield of volatile oil from perillae folium

根據(jù)表4，在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，固定料液比、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間3個(gè)因素中的其中一個(gè)因素，其他兩個(gè)因素間的交互作用對(duì)紫蘇醛含量的影響可通過(guò)繪制等高線圖與響應(yīng)面圖來(lái)表示，結(jié)果見(jiàn)圖4。料液比與浸泡時(shí)間的交互作用對(duì)紫蘇醛含量的影響最大，浸泡時(shí)間與加熱時(shí)間的交互作用對(duì)紫蘇醛含量的影響次之，料液比與加熱時(shí)間的交互作用對(duì)紫蘇醛含量的影響最小，但其交互作用對(duì)紫蘇醛含量的影響均不顯著。

圖4 各因素交互作用對(duì)紫蘇醛含量的影響Fig 4 Effects of interaction of various factors on perillaldehyde content

表4 回歸模型方差分析Tab 4 Variance analysis for the regression model

2.6 優(yōu)化工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面分析軟件得到紫蘇葉油提取的理論最佳工藝條件為：料液比1∶17.12，浸泡時(shí)間0.68 h，加熱時(shí)間2 h。且在此條件下預(yù)測(cè)的紫蘇葉油提取率為0.473%，紫蘇醛含量為11%。結(jié)合試驗(yàn)條件及實(shí)際操作的可能性，確定最佳工藝條件為：料液比1∶17，浸泡時(shí)間0.70 h，加熱時(shí)間2 h。在此條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，得到紫蘇葉油平均提取率為0.468%，紫蘇醛平均含量為10.65%。與預(yù)測(cè)值基本一致，表明該提取條件可靠，能較好地預(yù)測(cè)與分析紫蘇葉油的提取工藝，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

紫蘇葉油的市場(chǎng)潛力巨大，可作為應(yīng)用于香水中的天然香料，作為芳香療法中的芳香藥物，作為食物中的調(diào)味劑和防腐劑，作為調(diào)理人體機(jī)能的保健品，作為治療人類疾病的新型消炎抗菌藥物、抗腫瘤藥物、抗抑郁藥物等[10]。本研究建立了有效測(cè)定紫蘇葉油中紫蘇醛含量的高效液相色譜方法，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)紫蘇葉油的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到了紫蘇葉油提取率與紫蘇醛含量的兩個(gè)多元二次回歸模型，回歸模型擬合好，能很好地預(yù)測(cè)與分析紫蘇葉油的提取工藝。

本研究采用紫蘇葉油提取率與紫蘇醛含量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)優(yōu)化紫蘇葉油的提取工藝，相較于單一地使用其中任意一個(gè)指標(biāo)具有顯著優(yōu)勢(shì)，為獲得較高的紫蘇葉油與紫蘇醛的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論及技術(shù)支持，為紫蘇葉油的深入研究提供較優(yōu)的工藝參數(shù)，為紫蘇葉的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。