趙雨鑫，張然，盧海巖，李凌智，王學(xué)靜,2，周曙光，鄭金環(huán)，劉聚祥，許利軍★，陳立功★

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071000；3.保定市畜牧工作站，河北 保定 071051）

近年來，我國多個地區(qū)報道了一種以呼吸困難、支氣管有干酪樣物質(zhì)阻塞為特征而被稱為雞“支氣管阻塞”或“支氣管栓塞”的疾病，該病病程較長，治療效果不顯著，病雞死亡率較高，給我國養(yǎng)雞生產(chǎn)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。據(jù)報道，表現(xiàn)“支氣管阻塞”雞群與感染H9 亞型禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV)、傳染性支氣管炎病毒 （Infectious bronchitis virus，IBV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）等病原有關(guān)，其中H9 亞型AIV 所占比例更高。禽流感（Avian Influenza，AI）是由A 型流感病毒引起的一種禽類急性、高度接觸性傳染病，根據(jù)AIV的致病力和毒力的不同，將禽流感分為高致病性禽流感 （Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI）、低致病性禽流感（Low Pathogenic Avian Influenza，LPAI）。HPAI 包括H5 亞型禽流感和H7 亞型禽流感，雞的LPAI 主要是H9 亞型AIV引發(fā)。目前少見關(guān)于河北省肉雞“支氣管阻塞”與禽流感病毒相關(guān)性的報道，因此對河北省表現(xiàn)“支氣管阻塞”的某肉雞場進行了H5 亞型、H7 亞型和H9 亞型禽流感分子生物學(xué)、病原學(xué)和血清學(xué)的調(diào)查與分析，有關(guān)結(jié)果可為肉雞呼吸道疾病的綜合防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

2021 年秋季，自河北某雞場表現(xiàn)“支氣管阻塞”的肉雞群采集2 份病料 （支氣管和肺臟），于-80℃凍存；于7 日齡、14 日齡、28 日齡和42 日齡采集該發(fā)病雞群血樣，每次采集60 份，析出血清，于-20℃凍存。Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR 試驗相關(guān)試劑均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。H5 亞型、H7N9 亞型、H9 亞型禽流感病毒HI 試驗抗原及陽性血清均為哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品。雞新城疫HI 試驗陽性血清，為青島易邦生物工程有限公司產(chǎn)品。無菌采取健康公雞血，用肝素鈉抗凝后按常規(guī)方法制備1%紅細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆?。自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司購買SPF 雞蛋，分別用于病毒分離、鑒定。

1.2 病料中AIV、NDV、IBV 的RT-PCR 檢測

無菌操作將1.1 中病料充分研磨、反復(fù)凍融3 次，8000 轉(zhuǎn)/分鐘離心15 分鐘，離心上清液過濾除菌。按照Trizol 說明書流程提取RNA 并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA 按文獻方法進行AIV、NDV 和IBV 的RT-PCR 檢測，相關(guān)引物（見表1）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR 相關(guān)引物

1.3 病毒分離與鑒定

取1.2 中PCR 檢測呈現(xiàn)陽性的病料上清，參考文獻方法進行病毒分離。按文獻方法測定各代尿囊液HA 效價，HA 陽性樣品分別用禽流感病毒（H5、H7、H9 亞型）陽性血清和雞新城疫血凝抑制試驗陽性血清進行HI 試驗。鑒定的含毒尿囊液經(jīng)有限稀釋法純化后經(jīng)SPF 雞胚復(fù)壯，收集尿囊液作為種毒，-80℃凍存。經(jīng)血清學(xué)鑒定的含毒尿囊液進行對應(yīng)亞型的HA 基因鑒定；按文獻方法擴增分離毒株的N1、N2 亞型NA 基因片段。

1.4 血清AIV 抗體檢測

1.1 中血清樣品經(jīng)56℃滅活30 分鐘，參考禽流感病毒HI 試驗抗原說明書程序進行血清中H5 亞型、H7 亞型和H9 亞型AIV 抗體的檢測與結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2.1 病料RT-PCR 檢測結(jié)果

RT-PCR 檢測結(jié)果表明，采集的發(fā)病肉雞病料均呈H9 亞型AIV 陽性，均未檢出H5 亞型AIV、H7 亞 型AIV、NDV和IBV（圖1）。

圖1 病料中AIV、NDV、IBV 的RT-PCR 檢測結(jié)果

2.2 病毒分離、鑒定結(jié)果

自采集的呈H9 亞型AIV 陽性的支氣管阻塞病料中分離、純化獲得2 株具有HA 活性的病毒，分離毒株的HA 活性僅能被禽流感病毒H9亞型陽性血清抑制；對分離毒株HA基因進行RT-PCR，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳均可見符合預(yù)期大小的目的條帶（圖2）；分離毒株均呈N2 亞型NA 基因陽性。因此，判定該雞場發(fā)病肉雞采集的病料分離毒均為H9N2亞型AIV。

圖2 病料分離毒HA 基因RT-PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 血清AIV 抗體檢測結(jié)果

2.3.1 H5 亞型AIV 抗體檢測結(jié)果

HI 試驗結(jié)果表明，7 日齡、14 日齡、28 日齡和42 日齡血清的H5 亞型AIV 抗體陽性率分別為40.0%、3.3%、0 和0，平均滴度分別為3.1 log2、1.5 log2、0 log2 和0.2 log2，均低于臨界值（4log2）（詳見表2，圖3）。

圖3 支氣管阻塞雞群禽流感抗體監(jiān)測結(jié)果

2.3.2 H7 亞型AIV 抗體檢測結(jié)果

HI 試驗結(jié)果表明，7 日齡、14 日齡、28 日齡和42 日齡血清的H7 亞型AIV 抗體陽性率分別為10.0%、0、0 和0，平均滴度分別為1.9 log2、0.2 log2、0 log2 和0 log2，均低于臨界值（4log2）（詳見表2，圖3）。

2.3.3 H9 亞型AIV 抗體檢測結(jié)果

HI 試驗結(jié)果表明，7 日齡采集血清的H9亞型AIV 抗體陽性率為96.7%，平均滴度為6.1 log2；14 日齡和28 日齡血清的H9 亞型AIV 抗體陽性率為65.0%和30.0%，平均滴度分別為3.9 log2 和2.3 log2，均低于臨界值 （4log2）；42 日齡時肉雞H9 亞型AIV 抗體陽性率為76.7%，平均滴度為5.4 log2（詳見表2，圖3）。隨著肉雞日齡的增長，H9 亞型AIV 抗體陽性率與平均滴度均呈先降（低于臨界值）后升（高于臨界值）的走勢（詳見圖3）。

表2 支氣管阻塞雞群AIV 抗體監(jiān)測結(jié)果

3 討論

對河北省表現(xiàn)“支氣管阻塞”病變的肉雞群病料進行分子生物學(xué)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病料僅呈H9 亞型AIV 陽性，且未檢出H5 亞型AIV、H7 亞型AIV、NDV 和IBV；自上述病料分離、純化獲得2 株H9N2 亞型AIV。

表現(xiàn)“支氣管阻塞”臨床病例剖檢病變除支氣管阻塞干酪樣分泌物外，多伴有心包炎、肝周炎和氣囊炎等病變。據(jù)報道，表現(xiàn)“支氣管阻塞”臨床病雞多為混感病例，即“支氣管阻塞”病變的形成可能是不同病原聯(lián)合或混合感染所致。因此，本項目組后續(xù)擬用已鑒定的H9 亞型分離毒與其他病原（如IBV、銅綠假單胞菌）進行協(xié)同致病性研究，以對“支氣管阻塞”相關(guān)疾病的防控進行深入探討。

血清學(xué)監(jiān)測結(jié)果表明，隨著肉雞日齡的增大，H9 亞型AIV 抗體陽性率與平均滴度均呈先降（低于臨界值）后升（高于臨界值）的走勢；同時發(fā)現(xiàn)7 日齡和42 日齡時的H9 亞型AIV 抗體陽性率大于70%，而14 日齡和28 日齡時該抗體陽性率均小于70%。據(jù)調(diào)查，采樣肉雞均為同批次購入的同日齡雞苗，出殼當天均曾接種了雞新城疫-禽流感 （H9 亞型）-傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗，雛雞到場飼養(yǎng)至出欄期間未接種禽流感疫苗。綜合分析表明，該場肉雞在飼養(yǎng)過程中表現(xiàn)的“支氣管阻塞”可能與H9 亞型AIV 野毒感染密切相關(guān)。此外，整個飼養(yǎng)期內(nèi)所調(diào)查肉雞群的H5 和H7 亞型AIV 抗體平均滴度均低于臨界值 （4log2），這兩種不同亞型的AIV 抗體陽性率均低于70%，提示該飼養(yǎng)周期內(nèi)肉雞患HPAI 風(fēng)險較大，建議規(guī)?；怆u養(yǎng)殖企業(yè)應(yīng)進一步做好春季HPAI 的防控工作。本次調(diào)查結(jié)果給當?shù)厝怆u呼吸道疾病防控工作提供了有益參考。當前我國禽流感的防控工作重點依舊在于防，雞群AIV 抗體水平低，容易受到野毒感染。因此，肉雞飼養(yǎng)過程中要嚴格執(zhí)行良好的生物安全措施，既要防范LPAI 野毒株對肉雞的感染，還要警惕HPAI 的發(fā)生。

4 結(jié)論

調(diào)查結(jié)果表明，河北某肉雞群發(fā)生“支氣管阻塞”與H9 亞型AIV 感染密切相關(guān)。