董宇曦，余卓營，馮義超，王建勛

北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488

近年來，嵌合抗原受體（CAR）-T 療法在腫瘤相關(guān)研究領(lǐng)域發(fā)展迅速，CAR-T 細(xì)胞在腫瘤治療中發(fā)揮著日益重要的作用［1］。然而，由于免疫抑制腫瘤微環(huán)境、腫瘤特異性抗原缺乏、低水平CAR-T 細(xì)胞浸潤和腫瘤抗原逃逸等因素，以及CAR-T 細(xì)胞治療可能導(dǎo)致靶向非腫瘤效應(yīng)、神經(jīng)毒性和細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）等不良反應(yīng)，使得CAR-T 療法的應(yīng)用受到限制［2］。因此，研究人員提出用NK 細(xì)胞替代T 細(xì)胞表達(dá)CAR。相對于CAR-T 細(xì)胞，CAR-NK 細(xì)胞可以從多種來源獲得，如NK92 細(xì)胞系、臍帶血單核細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞及誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞等［3-4］。CAR-NK 細(xì)胞在血循環(huán)中壽命有限，對正常組織的靶向/脫靶毒性風(fēng)險(xiǎn)相對較低，不易發(fā)生CRS和神經(jīng)毒性，安全性更高，且不受供體—患者匹配影響［5-9］?，F(xiàn)階段CAR-NK 細(xì)胞相關(guān)研究中所使用的CAR 結(jié)構(gòu)大多為CAR-T 細(xì)胞的CAR 結(jié)構(gòu)。雖然CAR-NK 細(xì)胞和CAR-T 細(xì)胞殺傷腫瘤的方式相似，但它們的激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不同。因此，設(shè)計(jì)開發(fā)出能有效激活NK 細(xì)胞的CAR 結(jié)構(gòu)將有助于提高CAR-NK 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。基于此，2021 年3 月—2022 年6 月，本 研 究設(shè)計(jì)了2 種契合NK 細(xì)胞自身信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶向分化群抗原19（CD19）的二代CAR 結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了靶向CD19的CARNK細(xì)胞，并觀察其對多種腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)試劑 逆病毒包裝細(xì)胞系及人骨髓瘤B 細(xì)胞RPMI-8226 細(xì)胞、人Burkkit 淋巴瘤Daudi 細(xì)胞購于美國ATCC 細(xì)胞庫，人結(jié)直腸腺癌SW620 細(xì)胞購于國家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫，NK92細(xì)胞購自中國武漢普諾賽生命科技有限公司，黑人Burkitt 淋巴瘤Raji-luc 細(xì)胞由北京維通達(dá)生物科技有限公司惠贈(zèng)。RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS 緩沖液、胰酶、Penicillin Streptomycin 購自美國Gibco 公司，F(xiàn)uGene HD 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Promega公司，α-MEM 培養(yǎng)基、熱滅活馬血清購自以色列BI 公司，Myc-PE、BCMA-PE、CD19-APC等抗體購自美國BD 公司。人γ-干擾素ELISA 檢測試劑盒購自中國百諾威生物科技有限公司，ClonExpress Ulter One StepCloning Kit 無縫克隆試劑盒、膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒、Bright-Lumi Ⅱ螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒、Annexin V-Alexa Flour 647/PI凋亡檢測試劑盒、病毒RNA 提取試劑盒、Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ、First-strand cDNA Synthesis Mix 去基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DH5a化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、XhoⅠ/NotⅠ限制性內(nèi)切酶、BamHI-HF 內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase 連接酶等購自北京蘭博利德有限公司。

1.2 CAR001、CAR002 質(zhì)粒構(gòu)建 靶向CD19 的單鏈可變區(qū)（SCFV）來自實(shí)驗(yàn)室早期篩選的具有較強(qiáng)親和力的靶向CD19 的CAR 結(jié)構(gòu)，SCFV 與CD8跨膜區(qū)及2B4、DAP12 或CD3ζ 胞內(nèi)區(qū)進(jìn)行串聯(lián)，在此結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上加入SP 信號肽和MYC 檢測標(biāo)簽。用XhoI/NotI 限制性內(nèi)切酶將SCFV 與pMFG 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行雙酶切，回收純化片段后用T4 DNA Ligase 連接酶將目的片段與載體進(jìn)行連接。使用DH5a 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞對連接后的DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物離心，棄500 μL 上清后均勻涂板，將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 ～ 16 h，待平板上長出菌落后挑取單克隆菌落，將其加入到含有氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 ～ 16 h，用培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取并送至測序公司測序。CAR001、CAR002 質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 CAR001、CAR002質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

1.3 CAR001-NK92、CAR002-NK92 細(xì)胞的構(gòu)建將測序正確的CAR001、CAR002 質(zhì)粒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝，收集逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并進(jìn)行滴度檢測，用滴度較高（高于106copies/mL）的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行后續(xù)NK92 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)操作如下：用Retronectin 進(jìn)行過夜鋪板，第2天將Retronectin 吸出并加PBS 潤洗，棄掉PBS；各取CAR001、CAR002 質(zhì)粒成功包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體1 mL 于細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)板上，離心后棄掉液體；加入NK92細(xì)胞繼續(xù)離心，離心后棄掉液體，加入培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)到6孔板繼續(xù)培養(yǎng)3 d；第4天用Alexflour 488 anti-c-MYC 對轉(zhuǎn)導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；第7天使用流式細(xì)胞儀分選出經(jīng)Alexflour 488 anti-c-MYC 染色后MYC抗體呈陽性的NK92細(xì)胞，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，96 h后檢測分選后細(xì)胞MYC 表達(dá)情況；繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，4個(gè)月后取適量NK92 細(xì)胞、CAR001-NK92 細(xì)胞、CAR002-NK92 細(xì)胞 分別 與CD19 Protein-FITC 抗 體共孵育培養(yǎng)1 h，用流式細(xì)胞儀檢測兩種CAR-NK92細(xì)胞對CD19 抗原的結(jié)合能力，若結(jié)合力強(qiáng)，證明靶向CD19抗原的CAR-NK92細(xì)胞系構(gòu)建成功。

1.4 表達(dá)CD19 抗原的腫瘤細(xì)胞的構(gòu)建及驗(yàn)證購買含人源CD19 抗原序列的質(zhì)粒，構(gòu)建表達(dá)CD19抗原的Raji-luc、SW620-EGFP、RPMI-hCD19-copGFP細(xì)胞。取不染色的腫瘤細(xì)胞Daudi、Raji-luc、SW620-EGFP、RPMI-hCD19-copGFP 細(xì)胞作為陰性對照，離心去上清，再加入PBS清洗后棄上清，使用APC antihuman CD19 抗體對Daudi、Raji-luc、SW620-EGFP、RPMI-hCD19-copGFP 細(xì)胞進(jìn)行染色，離心去上清，使用含10%血清的PBS 重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞中的CD19抗原。

1.5 靶向CD19的CAR-NK92細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用觀察

1.5.1 CAR-NK92 細(xì) 胞 對RPMI-hCD19-copGFP 細(xì)胞的殺傷作用觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。以RPMIhCD19-copGFP 細(xì)胞為靶細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL、每孔100 μL。分別將NK92細(xì)胞、CAR001-NK92 細(xì)胞、CAR002-NK92 細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，將靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞分別按1∶4、1∶2、1∶1、2∶1效靶比（當(dāng)效靶比為1∶1時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞密度為2×105/mL、每孔100 μL）在5% CO2、37 ℃條件下共孵育，設(shè)置僅含靶細(xì)胞的對照孔。共孵育6 h后，300 g、5 min 離心棄上清，收集細(xì)胞，用染色緩沖液進(jìn)行清洗，再加入BCMA-PE抗體進(jìn)行染色，在4 ℃冰箱孵育1 h。終止染色，離心去上清，再加入Annexin-V染色，在4 ℃冰箱孵育45 min后終止染色，離心去上清。使用染色緩沖液重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡率。效應(yīng)細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率=實(shí)驗(yàn)孔靶細(xì)胞凋亡率-對照孔細(xì)胞凋亡率。

1.5.2 CAR-NK92 細(xì)胞對Raji-luc 細(xì)胞的殺傷作用觀察 采用熒光素酶報(bào)告基因法。以Raji-luc 細(xì)胞為靶細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，以4×105/mL、每孔50 μL接種于96 孔板。分別將NK92 細(xì)胞、CAR001-NK92細(xì)胞、CAR002-NK92細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，將靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞分別按1∶4、1∶2、1∶1、2∶1效靶比在5% CO2、37 ℃條件下共孵育6 h，設(shè)置僅含靶細(xì)胞的對照孔和僅含培養(yǎng)基的空白孔。使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。細(xì)胞殺傷效率=［1-（實(shí)驗(yàn)孔OD 值-空白孔OD 值）/（最大釋放孔OD值-空白孔OD值）］×100%。

1.5.3 CAR-NK92 細(xì)胞對SW620-EGFP 細(xì)胞的殺傷作用觀察 采用IncuCyte 法。將SW620-EGFP 作為靶細(xì)胞，以4×104/孔、每孔100 μL接種于96孔板。分 別將NK92 細(xì)胞、CAR001-NK92 細(xì) 胞、CAR002-NK92細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，將靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞分別按1∶4、2∶1 效靶比在5% CO2、37 ℃條件下共孵育18 h。以每孔0 h 時(shí)的熒光面積作為原始對照。殺傷效率=（原始熒光面積-當(dāng)前拍照時(shí)熒光面積）/原始熒光面積×100%。

1.5.4 CAR-NK92細(xì)胞對Daudi細(xì)胞增殖的影響觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。使用Daudi細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以2×105/mL、每孔100 μL 接種于96 孔板，分別將NK92細(xì)胞、CAR001-NK92細(xì)胞、CAR002-NK92細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞（分別為NK92 組、CAR001-NK92 組、CAR002-NK92組）共培養(yǎng)，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS 清洗。加入CFSE 溶液重懸細(xì)胞，37 ℃水浴避光孵育30 min 后加入PBS 終止染色，離心去上清，用α-MEM完全培養(yǎng)基重懸制成2×105/mL的細(xì)胞懸液，加入96孔板中，每孔加入100 μL，將培養(yǎng)板置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測CFSE平均熒光強(qiáng)度，表示細(xì)胞增殖能力。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶 向CD19 的CAR001-NK92、CAR002-NK92細(xì)胞構(gòu)建情況 CAR001-NK92、CAR002-NK92 細(xì)胞CAR 表達(dá)率分別為99.0%和98.4%，CD19 表達(dá)率分別為99.6%和99.3%。成功構(gòu)建靶向CD19 的CAR001-NK92、CAR002-NK92細(xì)胞。

2.2 表達(dá)CD19抗原腫瘤細(xì)胞的構(gòu)建情況 Daudi、Raji-luc、SW620-EGFP、RPMI-hCD19-copGFP 細(xì)胞的CD19 抗原表達(dá)率分別為99.0%、100%、100%、99.5%，表達(dá)CD19抗原的腫瘤細(xì)胞構(gòu)建成功。

2.3 CAR-NK92 細(xì)胞 對RPMI-hCD19-copGFP 細(xì)胞的殺 傷效果 NK92 細(xì)胞、CAR001-NK92 細(xì)胞、CAR002-NK92 細(xì)胞在不同效靶比下對RPMIhCD19-copGFP 細(xì)胞的殺傷效率依次增高（P均＜0.01）。三種細(xì)胞對RPMI-hCD19-copGFP 細(xì)胞的殺傷效率隨效靶比增高而增高。見表1。

2.4 CAR-NK92 細(xì)胞對Raji-luc 細(xì)胞的殺傷效果 CAR002-NK92 細(xì)胞在不同效靶比下對Raji-luc 細(xì)胞的殺傷效率均高于CAR001-NK92 細(xì)胞（P均＜0.01）。三種細(xì)胞對Raji-luc細(xì)胞的殺傷效率隨效靶比增高而增高。見表1。

2.5 CAR-NK92 細(xì)胞對SW620-EGFP 細(xì)胞的殺傷效果 NK92 細(xì)胞、CAR001-NK92 細(xì)胞、CAR002-NK92 細(xì)胞在不同效靶比下對SW620-EGFP 細(xì)胞的殺傷效率依次增高（P均＜0.05）。三種細(xì)胞對SW620-EGFP 細(xì)胞的殺傷效率隨效靶比增高而增高。見表1。

表1 CAR-NK 細(xì)胞與NK92 細(xì)胞不同效靶比下對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率比較（%，± s）

表1 CAR-NK 細(xì)胞與NK92 細(xì)胞不同效靶比下對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率比較（%，± s）

注：與NK92細(xì)胞相比，*P＜0.01；與CAR001-NK92細(xì)胞相比，#P＜0.01。

殺傷細(xì)胞殺傷效率RPMI-hCD19-copGFP細(xì)胞Raji-luc細(xì)胞SW620-EGFP細(xì)胞CAR001-NK92細(xì)胞 效靶比1∶4 效靶比1∶2 效靶比1∶1 效靶比2∶1 CAR002-NK92細(xì)胞 效靶比1∶4 效靶比1∶2 效靶比1∶1 效靶比2∶1 NK92細(xì)胞 效靶比1∶4 效靶比1∶2 效靶比1∶1 效靶比2∶1 13.3 ± 0.5*20.0 ± 1.7*35.0 ± 3.3*56.3 ± 3.4*6.2 ± 1.8 15.3 ± 4.4 22.0 ± 2.2 55.2 ± 7.0-40.3 ± 2.1*49.0 ± 5.6*15.8 ± 0.6*#26.4 ± 0.5*#45.3 ± 3.5*#65.2 ± 1.4*#17.0 ± 3.5#33.6 ± 5.1#62.1 ± 1.4#79.1 ± 3.7*22.3 ± 2.5*72.7 ± 0.6*-2.4 ± 0.9 0.3 ± 1.8 3.4 ± 0.4 8.6 ± 0.6 13.8 ± 3.0 31.8 ± 3.8 53.5 ± 5.6 73.9 ± 4.5-56.7 ± 3.8-15.0 ± 5.3

2.6 CAR-NK92 細(xì)胞對Daudi 細(xì)胞增殖能力的影響 NK92組、CAR001-NK92組、CAR002-NK92組熒光強(qiáng)度分別為10 464.7 ± 624.2、9 186.3 ± 399.1、10 217.7 ± 107.5。NK92 組和CAR002-NK92 組細(xì)胞增殖能力低于CAR001-NK92組（P均＜0.05）。

3 討論

NK 細(xì)胞是先天淋巴樣細(xì)胞家族成員［10-11］，可以對病毒感染、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞作出反應(yīng)，具有多種效應(yīng)功能，主要是細(xì)胞殺傷和產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子［11-14］。與T細(xì)胞相反，NK細(xì)胞是缺乏抗原特異性受體的淋巴細(xì)胞，但大量表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，也被稱為CD56［15］。兩 個(gè) 最 具 特 征 的NK 細(xì) 胞 亞 群 是CD56brightCD16-dim和CD56dimCD16*bright［16］。組 織 常駐NK 細(xì)胞主要是CD56bright，外周血中CD56bright數(shù)量較少，循環(huán)中90%的NK細(xì)胞是CD56dim［17］。NK細(xì)胞上受體信號輸入情況決定了NK細(xì)胞是否激活并產(chǎn)生細(xì)胞毒性，當(dāng)抑制受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)總體水平超過激活受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，NK細(xì)胞激活受到阻礙，導(dǎo)致產(chǎn)生細(xì)胞耐受［16］。在病毒感染或轉(zhuǎn)化時(shí)，NK細(xì)胞激活受體（如NKG2D）的刺激配體（如MHC-Ⅰ同源分子MICA、MICB）表達(dá)上調(diào)［18］，誘導(dǎo)的激活信號水平超過抑制性受體（如NKG2A）的信號，從而激活NK 細(xì)胞細(xì)胞因子的釋放和針對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性［16］。CD56brightNK細(xì)胞是強(qiáng)大的細(xì)胞因子生產(chǎn)者［16］，而CD56dimNK細(xì)胞群可介導(dǎo)感染和針對惡性細(xì)胞的殺傷作用［19］。

CAR-NK 細(xì)胞療法與CAR-T 治療相比，其優(yōu)勢包括：①免疫細(xì)胞的獲得不再局限于自體細(xì)胞［20］，CAR-NK 細(xì)胞療法的免疫細(xì)胞來源包括人外周血NK 細(xì)胞、臍帶血NK 細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、NK92細(xì)胞系等［3-4］。②使用CAR-NK 治療的患者CRS 和神經(jīng)毒性發(fā)生率較CAR-T 治療更低［20-21］，CAR-T 細(xì)胞和CAR-NK 細(xì)胞毒性的差異可能是由細(xì)胞活化時(shí)釋放的細(xì)胞因子的差異引起的［20］，CAR-T 細(xì)胞活化導(dǎo)致炎癥因子（如腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素6）釋放［22］，而CAR-NK 細(xì)胞釋放不同類型的細(xì)胞因子，如粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）［23］。③除了CAR 途徑外，NK 細(xì)胞還具有多種靶向和消滅腫瘤細(xì)胞的機(jī)制，包括NK 細(xì)胞可介導(dǎo)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，也可以通過接觸和（或）脫離細(xì)胞表面的殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體來殺死腫瘤細(xì)胞［24-25］。

本研究使用病毒包裝和流式分選的方法成功構(gòu)建出靶向CD19 的CAR001-NK92 細(xì)胞和CAR002-NK92 細(xì)胞，且CAR-NK92 細(xì)胞能與靶抗原CD19 特異性結(jié)合。為了驗(yàn)證構(gòu)建的CAR-NK92細(xì)胞對腫瘤具有殺傷能力，本研究構(gòu)建并采用表達(dá)CD19 抗原的RPMI-hCD19-copGFP 細(xì)胞、Raji-luc 細(xì)胞、SW620-EGFP 細(xì)胞和Daudi 細(xì)胞作為靶細(xì)胞，采用不同細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)檢測了NK92 細(xì)胞和CAR-NK92 細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效率，結(jié)果顯示，NK92 細(xì)胞、CAR001-NK92 細(xì)胞、CAR002-NK92 細(xì)胞在不同效靶比下對RPMI-hCD19-copGFP 細(xì)胞和SW620-EGFP 細(xì)胞的殺傷效率依次增高；CAR002-NK92 細(xì)胞在不同效靶比下對Raji-luc 細(xì)胞的殺傷效率均高于CAR001-NK92細(xì)胞；NK92 組和CAR002-NK92 組細(xì)胞增殖能力低于CAR001-NK92組。由此可以看出，本研究設(shè)計(jì)的CAR 結(jié)構(gòu)在構(gòu)建CAR-NK 細(xì)胞后可有效殺傷表達(dá)CD19抗原的腫瘤細(xì)胞，且殺傷作用隨效靶比的增高而增強(qiáng)。CAR-NK 細(xì)胞治療方案在血液腫瘤和實(shí)體瘤治療方面具有較好的應(yīng)用前景，然而本研究為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，未來將進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床治療試驗(yàn)，驗(yàn)證CAR-NK細(xì)胞的具體療效。