張燦燦，張丹丹，王志強，羅福廣，文衍紅，蔣 明，李艷和

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級實驗教學(xué)示范中心，武漢 430070；2.廣西柳州市漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣西柳州 545006；3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

銅銹環(huán)棱螺(Bellamyaaeruginosa)是我國主要的土著淡水螺類群體之一，屬于軟體動物門腹足綱前鰓亞綱中腹足目田螺科環(huán)棱螺屬[1]。據(jù)研究，新鮮螺肉營養(yǎng)價值高，含有人體所必需的7種氨基酸、多種礦物元素及維生素等[2]，具有天然保健功能，使其在多種行業(yè)及水生態(tài)保護修復(fù)中都具有重要作用與突出價值[1]。銅銹環(huán)棱螺的市場需求量逐年增大，但其人工養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展卻較為滯后，目前主要依靠人工捕撈，供應(yīng)量遠小于其市場需求量。因此，深入開展銅銹環(huán)棱螺的人工養(yǎng)殖、營養(yǎng)需求、餌料投喂和繁育特性等研究顯得尤為重要。而動物的食性研究是營養(yǎng)生態(tài)位研究的重要組成部分[3]，可以為動物的食物選擇性、物質(zhì)代謝、繁育特性以及人工養(yǎng)殖等研究提供有價值的參考資料和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[4]。

高通量測序具有較高靈敏性和準(zhǔn)確性，能檢出降解和頻次較低的DNA序列，通過比對捕獲的DNA，可將物種精確分類到種級別分類單元，基于DNA序列數(shù)，還可判斷動物對食物取食的相對量和偏好[5]。顯微鏡鏡檢分析一直是動物食性研究中的傳統(tǒng)方法[6,7]，是一種檢驗動物短期內(nèi)攝食的直接手段，該方法使用顯微鏡觀察并分析腸胃內(nèi)含物中未被消化的食物種類和數(shù)量，可以反映動物在近期內(nèi)的攝食情況。然而，大量的研究表明每一種食性研究方法在實際應(yīng)用中均存在局限性。將鏡檢分析這種傳統(tǒng)的食性研究方法與高通量測序這種新興方法相結(jié)合，可以突破單種方法的局限性，提高對生物食性研究的可靠性[8]。

目前有關(guān)螺類的食性已有較多研究，屈銘志等[9]通過模擬水庫現(xiàn)場，直接觀察銅銹環(huán)棱螺的攝食行為。段曉姣[10]、劉學(xué)勤[11]基于鏡檢分析法，分別對梨形環(huán)棱螺(Bellamyapurificata)、長角涵螺(Alocinmalongicornis)、大沼螺(Parafossaruluseximius)和紋沼螺(Parafossarulusstriatulus)的腸道內(nèi)含物進行鑒定，分析了其食性。而將高通量測序技術(shù)和鏡檢鑒定結(jié)合起來，分析銅銹環(huán)棱螺胃和后腸內(nèi)容物組成的研究較少。本研究選取真核生物18S可變區(qū)V4區(qū)、細菌16S V3V4(a)和真菌ITS1(a)作為標(biāo)記基因，結(jié)合高通量測序技術(shù)和鏡檢鑒別結(jié)果，對銅銹環(huán)棱螺的食性進行研究，以期為開展環(huán)棱螺人工養(yǎng)殖、營養(yǎng)需求、餌料投喂和繁育特性研究提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021年4月2日，在廣西柳州里高鎮(zhèn)螺螄養(yǎng)殖基地某銅銹環(huán)棱螺高產(chǎn)水田隨機采集銅銹環(huán)棱螺樣本若干(60個以上)。采樣后將螺樣放入清水中進行沖洗，去除表面的底泥，用吸水紙吸干表面水分，測量其體高、體重及殼寬。

1.2 顯微鏡鏡檢

將每個螺的胃和后腸移入盛有10～20 μL生理鹽水的培養(yǎng)皿中充分洗滌后制成鏡檢樣品。利用顯微鏡鏡檢法鑒別全部鏡檢樣品。藻類及浮游動物參照文獻[12-15]鑒定到屬。

1.3 高通量測序

隨機選取30個銅銹環(huán)棱螺用無菌鑷子將胃分離，每10個一組，參照文獻[16]中的SDS法對環(huán)棱螺胃含物的基因組DNA進行提取。采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計法檢測DNA質(zhì)量與濃度。DNA檢測合格后，分別選用針對真核生物18S可變區(qū)V4區(qū)、細菌16S V3V4(a)和真菌ITS1(a)區(qū)設(shè)計的三對特異性引物(表1)對其進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、濃度檢測合格后，使用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過定量和檢測，利用NovaSeq 6000 SP Reagent Kit(500 cycles)進行2×250 bp的雙端測序。測序工作在上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 攝食強度分析

參照文獻[17]的判斷方法，對銅銹環(huán)棱螺腸道充塞度進行分級(0～5級)。

1.4.2 食物組成分析

分別計算銅銹環(huán)棱螺的攝食率(FR)、食物出現(xiàn)率(F)、數(shù)量百分比(N)、重量百分比(W)和相對重要性指數(shù)百分比(IRI)，評估銅銹環(huán)棱螺胃和后腸的食物組成情況，計算方法如下：

FR=(含有食物的腸道數(shù)量÷解剖的總腸道數(shù)量)×100%

F=(包含某食物的腸道數(shù)量÷解剖的總腸道數(shù)量)×100%

N=(某食物成分的數(shù)量÷全部食物的數(shù)量)×100%

W=(某食物成分的重量÷全部食物的重量)×100%

相對重要性指數(shù)=F×(個數(shù)百分比N%+重量百分比W%)

IRI=(相對重要性指數(shù)÷相對重要性指數(shù)總和)×100%

1.4.3 測序數(shù)據(jù)分析

首先對測序原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體。對每個OTU的代表序列，在QIIME2軟件中使用默認參數(shù)，使用Naive Bayes分類器進行物種分類注釋。比對Greengenes數(shù)據(jù)庫[18]，統(tǒng)計每個樣本的胃含物在界、門、綱、目、科、屬、種分類水平的組成。

2 結(jié)果

2.1 銅銹環(huán)棱螺的攝食強度

共分析30只銅銹環(huán)棱螺，體高分布范圍為13.48～22.41 mm，體質(zhì)量分布范圍為0.44～2.27 g，結(jié)果表明取樣隨機，大小均有，可以反映養(yǎng)殖階段銅銹環(huán)棱螺胃含物組成的共性。其中，26個腸道含食物，4個腸道完全無食物，攝食率為86.87%。由圖1可看出，銅銹環(huán)棱螺的充塞度主要集中在1級，即食物占腸管的1/4，其次主要是2級，食物占腸管的1/2，而充塞度為5級的最少為0。

圖1 銅銹環(huán)棱螺腸道充塞度情況

2.2 鏡檢分析銅銹環(huán)棱螺胃和后腸中食物組成情況

總共有30個樣本用于食物組成分析，殼寬在8.89～15.09 mm之間。由表2可以看出，從銅銹環(huán)棱螺胃中檢出藻類8門33屬，解剖發(fā)現(xiàn)銅銹環(huán)棱螺的胃腸道里主要食物是浮游植物，如裸藻、顫藻、扁裸藻、黃絲藻等(圖2)，還有較多的泥沙和有機碎屑，以及少量的水生植物碎屑。

圖2 顯微鏡視野下的銅銹環(huán)棱螺胃內(nèi)部分食物種類

從出現(xiàn)率來看，胃中小球藻最高為63.33%，其次黃絲藻為46.67%；后腸隱藻最高為43.33%，其次小球藻和黃絲藻均為33.33%，顫藻為30%，席藻、柵藻、雙菱藻、羽紋藻、實球藻、卵囊藻、小環(huán)藻、黃管藻和三毛金藻最低為3.33%。從數(shù)量百分比來看，胃中小球藻最高為34.42%，席藻、蹄形藻最低為0.05%；后腸顫藻最高為21.85%，席藻、柵藻、雙菱藻和羽紋藻最低為0.18%。除去泥沙，從重量百分比來看，胃中裸藻門為46.16%，綠藻門為35.70%，藍藻門為6.68%，硅藻門為6.19%，隱藻門為5.27%，其中裸藻最高為46.16%，其次為衣藻22.74%；后腸藍藻門為39.96%，隱藻門為18.19%，綠藻門為16.76%，裸藻門為15.59%，硅藻門為9.49%，其中顫藻最高為39.96%，其次隱藻為18.19%。從相對重要指數(shù)百分比來看，胃中小球藻最高為37.66%，其次衣藻為23.09%；后腸中顫藻最高為35.74%，其次隱藻為25.58%(表2)。

表2 銅銹環(huán)棱螺的食物組成

續(xù)表2

續(xù)表2

從表3可看出，鏡檢結(jié)果顯示銅銹環(huán)棱螺的胃含物中小球藻的F、N和IRI最高，裸藻的W最高，而后腸內(nèi)容物中顫藻的N、W和IRI居首，隱藻的F較其他藻類更大，表明銅銹環(huán)棱螺胃內(nèi)主要的食物成分是小球藻和裸藻，后腸中則以隱藻和顫藻為主。

表3 銅銹環(huán)棱螺胃和后腸的食物百分比

2.3 高通量分析銅銹環(huán)棱螺胃內(nèi)食物組成情況

2.3.1 細菌成分分析

采用Illumina測序平臺對3組樣品的16S rRNA基因V3-V4區(qū)進行測序，共得到有效序列249 343條，鑒定出23門37綱55目85科88屬39種。高通量測序分析表明銅銹環(huán)棱螺的胃內(nèi)細菌菌群主要由變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)等23門(圖3)和鹽單胞菌屬(Halomonas)、乳球菌屬(Lactococcus)、肉桿菌屬(Carnobacterium)、不動桿菌屬(Acinetobacter)及節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、鏈霉菌屬(Streptomyces)等88屬組成(圖4)。

圖3 基于門水平的銅銹環(huán)棱螺胃中細菌菌群結(jié)構(gòu)

圖4 基于屬水平的銅銹環(huán)棱螺胃中細菌菌群結(jié)構(gòu)

2.3.2 真核生物成分分析

通過對Reads進行剪切過濾，平均每個樣品測得143 663條Reads，通過質(zhì)控，平均得到135 756條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效率達94.50%。以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，共得到51個OTUs，然后與Silva132、NCBI數(shù)據(jù)庫進行物種注釋，經(jīng)過篩選之后一共獲得16門29綱32目36科38屬。

測序結(jié)果表明：本次共檢測到了包括軟體動物門(Mollusca)、領(lǐng)鞭毛蟲門(Choanoflagellata)、脊索動物門(Chordata)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、節(jié)肢動物門(Arthropoda)、纖毛門(Ciliophora)、綠藻門(Chlorophyta)、金藻綱(Chrysophyceae)、甲藻綱(Dinophyceae)、Streptophyta、真眼點藻綱(Eustigmatophyceae)、Discosea、絲足蟲類(Cercozoa)、隱藻綱(Cryptophyceae)、腹毛綱(Gastrotricha)等在內(nèi)的16門(圖5)。在屬水平上共檢測到了棕鞭藻屬(Ochromonas)、微芒藻(Micractinium)、小球藻屬(Chlorella)、Dolicholatirus、Phymorhynchus、Polyoeca、斑紋海豚屬(Lagenorhynchus)、跗線螨屬AD1063(Tarsonemidaegen.sp.AD1063)、內(nèi)生真菌屬(Gloeotinia)、Jaminaea、微擬球藻屬(Nannochloropsis)等在內(nèi)的38屬(圖6)。

圖5 銅銹環(huán)棱螺胃含物基于門分類水平的真核生物分布

圖6 銅銹環(huán)棱螺胃含物基于屬分類水平的真核生物分布

2.3.3 真菌成分分析

在對銅銹環(huán)棱螺胃內(nèi)真菌菌群組成分析中，主要選擇最具有代表性的門和屬兩個相對豐度水平對真菌菌群組成進行分析。從真菌門水平分析，三十個環(huán)棱螺胃含物中可注釋到門水平的有子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、被孢霉(Mortierellomycota)、毛霉門(Mucoromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)共5個門，其中子囊菌門和擔(dān)子菌門為主要優(yōu)勢菌門(圖7)。

圖7 銅銹環(huán)棱螺胃含物基于門分類水平的真菌結(jié)構(gòu)

樣品在屬水平上共注釋到50個屬，平均豐度占比均低于1%，分別是馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)、曲霉菌屬(Aspergillus)、被孢霉屬(Mortierella)、紅菇屬(Russula)、炭團菌屬(Hypoxylon)、蠟殼菌屬(Sebacina)、嗜熱真菌屬(Thermomyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、擬棘殼孢屬(Pyrenochaetopsis)、鑲刀菌屬(Fusarium)、畢赤酵母屬(Pichia)、支頂孢屬(Acremonium)、Solicoccozyma等(圖8)。

圖8 銅銹環(huán)棱螺胃含物基于屬分類水平的真菌結(jié)構(gòu)

3 討論

本研究運用高通量測序技術(shù)和鏡檢方法對螺螄養(yǎng)殖高產(chǎn)水田里的銅銹環(huán)棱螺胃含物進行了分析，經(jīng)鑒定，胃含物中包含細菌18門88屬，真核生物16門38屬，真菌5門50屬。至于養(yǎng)殖銅銹環(huán)棱螺與非養(yǎng)殖銅銹環(huán)棱螺的食性是否存在不同則需要進一步的研究。從本次的采樣情況來看，30個銅銹環(huán)棱螺中有4個腸道不含食物，攝食率為86.87%，空腸率為13.13%。在本次采樣解剖時發(fā)現(xiàn)部分銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)含有仔螺，一方面猜測采樣時處于環(huán)棱螺的繁殖期，在繁殖季節(jié)環(huán)棱螺會減少攝食，導(dǎo)致空腸率偏高。另一方面可能是采樣時間為春天，而有研究表明梨形環(huán)棱螺因攝食強度不同，在春季空腸率較大[10]。因此，在銅銹環(huán)棱螺繁殖季節(jié)，根據(jù)其胃含物分析結(jié)果表明，在養(yǎng)殖中此階段需注意不宜過多投喂飼料造成不必要的浪費，而以肥水和培養(yǎng)藻類為主則較好。

高等動物都會與豐富多樣的微生物群落有聯(lián)系，絕大部分的微生物又主要存在于胃腸道內(nèi)[19]。本次測序發(fā)現(xiàn)，銅銹環(huán)棱螺胃含物中變形菌門的含量遠遠大于其他菌門，為銅銹環(huán)棱螺胃腸道中的絕對優(yōu)勢菌，其次主要是放線菌門、擬桿菌門和厚壁菌門。這與齒紋蜒螺[19]、玫瑰高原鰍[20]等的腸道菌群組成類似，只是比例不同。變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門普遍存在于動物胃腸道[21]，其中變形菌門是細菌中最大的一門，對宿主的營養(yǎng)代謝十分重要[22]。擬桿菌門和厚壁菌門都可以促進宿主的營養(yǎng)物質(zhì)吸收，擬桿菌門主要參與宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育，而厚壁菌門可以產(chǎn)生多種消化酶幫助宿主分解各種物質(zhì)[23,24]。在屬水平上優(yōu)勢菌群主要有乳球菌屬、肉桿菌屬、曲霉菌屬、被孢霉屬及畢赤酵母屬等。其中乳球菌和肉桿菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的益生菌，可提高機體的免疫力，抑制消化道有害菌生長[25]。曲霉屬和被孢霉屬菌株可產(chǎn)專一性催化水解殼聚糖的殼聚糖酶，也有助于宿主清除體內(nèi)垃圾、預(yù)防疾病[26]。畢赤酵母屬則能生產(chǎn)植酸酶，對改善動物的生產(chǎn)性能和減少環(huán)境污染具有十分重要的意義[27]。

本研究發(fā)現(xiàn)銅銹環(huán)棱螺的胃含物以浮游植物和碎屑為主，其中藻類是最主要的食物，有機碎屑次之，原生動物含量較低，這與段曉姣[10]對生態(tài)溝渠中梨形環(huán)棱螺的食性研究相似，而與劉學(xué)勤[11]對湖泊底棲動物食物組成的研究有一定的差異，其調(diào)查結(jié)果為環(huán)棱螺的主要食物是有機碎屑，造成這種現(xiàn)象的原因推測一方面是采樣位置的不同；另一方面是研究方法的差異，劉學(xué)勤采用的是傳統(tǒng)的鏡檢技術(shù)，而光學(xué)顯微鏡很難對粒徑較小的浮游植物分類鑒定[28]。

在本研究中，利用高通量測序方法對30個銅銹環(huán)棱螺樣品的胃含物分別進行16S、18S、ITS測序，鑒定出細菌18門88屬、真核生物16門38屬、真菌5門50屬；采用顯微鏡鏡檢技術(shù)對30個銅銹環(huán)棱螺的胃含物和后腸內(nèi)容物進行鑒定，在胃中觀察到藻類8門33屬和原生動物如無節(jié)幼體、表殼蟲、砂殼蟲，在后腸中則發(fā)現(xiàn)藻類7門25屬，其中銅銹環(huán)棱螺胃內(nèi)主要的食物成分是小球藻、裸藻和衣藻，后腸中則主要是隱藻和顫藻，推測銅銹環(huán)棱螺可能更喜食小球藻、裸藻和衣藻，而對隱藻和顫藻表現(xiàn)出較低選擇性。結(jié)果顯示高通量測序和顯微鏡鏡檢食性研究兩種方法都鑒定出的食物成分只有綠藻門的小球藻屬，充分證明了銅銹環(huán)棱螺對小球藻的選擇性。

本研究和其他研究都可以表明高通量測序可以檢出主要的食物成分以及肉眼無法鑒定的成分[29,30]。鏡檢分析法可直接檢驗動物短期內(nèi)攝食情況，但其在很大程度上取決于觀察者的鑒定方法和食物的消化程度。高通量測序技術(shù)雖能克服這些問題，卻無法根據(jù)檢測到的食物成分DNA分析出食物的體積和重量，只能進行多樣性分析。關(guān)于這一點本研究結(jié)合高通量測序和顯微鏡鏡檢法，從銅銹環(huán)棱螺胃內(nèi)菌群到胃和后腸內(nèi)含物組成進行分析，了解了其食物組成和攝食強度[31]，極大增強了描述環(huán)棱螺食性的能力，可為開展環(huán)棱螺人工養(yǎng)殖、營養(yǎng)需求、餌料投喂和繁育特性提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和資料。

致謝

感謝華中農(nóng)業(yè)大學(xué)石瑞雪、肖作銘和田子楷在實驗器材的使用以及實驗技術(shù)方面的指導(dǎo)！