梁延達(dá)，楊美玲，徐 斌，黃俊旗，于 輝，楊 映

(1．佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ，廣東省動(dòng)物分子設(shè)計(jì)與精準(zhǔn)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東佛山 528231;2．佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528231;3．廣東海興農(nóng)集團(tuán)有限公司，廣州 511400)

牛蛙(Ranacatesbeiana)原產(chǎn)于北美洲地區(qū)，在上世紀(jì)50年代從古巴引入中國(guó)養(yǎng)殖，屬于兩棲綱(Amphibian)無(wú)尾目(Anura)新蛙亞目(Neobatrachia)蛙科(Ranidae)[1]。在我國(guó)牛蛙的養(yǎng)殖分布在全國(guó)各地，2020年淡水養(yǎng)殖蛙產(chǎn)量137 999 t，增長(zhǎng)幅度為28.55%[2]。牛蛙肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含銅、鋅、錳和鐵等多種微量元素，其肌肉脂肪含量?jī)H有2.1%，而蛋白質(zhì)含量高達(dá)18.90%，深受消費(fèi)者的青睞[3]。養(yǎng)殖牛蛙易發(fā)生多種病害 ，如布韋不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbouvetii)和變形桿菌(Proteus)導(dǎo)致的腐皮病[4-5]，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)導(dǎo)致的紅腿病[6]，淺黃假單胞菌(P.luteola)導(dǎo)致的歪頭病[7],洛菲不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffii)導(dǎo)致的腹水病[8]等。在病害治療期間，由于養(yǎng)殖戶沒(méi)有針對(duì)性地使用抗生素，導(dǎo)致病原出現(xiàn)耐藥性。

2021年9月廣東番禺某牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)爆發(fā)疾病，發(fā)病蛙表現(xiàn)為精神不濟(jì)、行動(dòng)遲緩、食欲不振且背部和腹部出現(xiàn)腫脹，隨著病情加重，背部皮膚因積液過(guò)多發(fā)生破裂，最終死亡。本實(shí)驗(yàn)室從牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)用保溫箱帶回5只具有相同癥狀且瀕臨死亡的牛蛙，解剖發(fā)現(xiàn)其背部、肝臟、脾臟腫大，腹腔中出現(xiàn)血紅色的積液，從病變部位進(jìn)行細(xì)菌的分離純化出優(yōu)勢(shì)菌，并通過(guò)革蘭氏染色、16S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序、進(jìn)化樹構(gòu)建、生化鑒定和人工感染回歸實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，進(jìn)行細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)確定其對(duì)于各種抗生素的敏感性。期望能明確該病的致病原因，為牛蛙細(xì)菌性疾病的預(yù)防和治療提供方向和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在廣東番禺某養(yǎng)殖場(chǎng)采集5只瀕死的牛蛙，均質(zhì)量為(150.0 ± 1.0)g，加上冰袋裝進(jìn)泡沫箱帶回實(shí)驗(yàn)室。健康蛙均重為(160.0 ± 3.0)g，與患病蛙取自同一養(yǎng)殖場(chǎng)，在實(shí)驗(yàn)室水箱中暫養(yǎng)7 d，暫養(yǎng)水溫在(28 ± 1)℃，每日投喂兩次，喂食量為體重的1%，未見(jiàn)任何發(fā)病狀況。在人工回歸感染實(shí)驗(yàn)之前隨機(jī)抽取三只健康蛙解剖觀察，并取其內(nèi)臟組織涂板于BHI營(yíng)養(yǎng)瓊脂上進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)，確定是否有感染病原菌。

SuperMix溶液、核酸染料和DNA Marker購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和微量生化鑒定管購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司； 藥敏片購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司。

1.2 病原菌的分離和培養(yǎng)

無(wú)菌操作取病蛙的肝臟、脾臟和背部積液，接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置于恒溫培養(yǎng)生化箱37 ℃下培養(yǎng)24 h后，選取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行重復(fù)劃線純化，得到形態(tài)大小一致的兩種純菌落，分別為GPY923和GPX924。然后取純化菌株用普通營(yíng)養(yǎng)肉湯在37 ℃的氣浴恒溫?fù)u床培養(yǎng)16 h，每種分裝10只2 mL的EP管中加入甘油進(jìn)行保種，放在- 20 ℃冰箱備用。

1.3 16S rRNA與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

使用裂解法提取兩種細(xì)菌的總DNA作為模板，采用16S rRNA的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃ 變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 90 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 終延伸5 min；PCR反應(yīng)體系：14 μL 2x Easy Taq Super Mix ，1 μL 10 mmol/L正向和反向引物，2 μL模板DNA，ddH2O 32 μL共50 μL。16S rRNA的引物序列如下，F(xiàn)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。陰性對(duì)照將細(xì)菌模板替換成無(wú)菌水。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳和凝膠成像系統(tǒng)后在1 500 bp位置得到目的條帶后，送去上海生工測(cè)序。

1.4 革蘭氏染色及生理生化特性鑒定

將之前備用的純化細(xì)菌涂在BHI平板上，在生化培養(yǎng)箱37 ℃重新培養(yǎng)18 h后觀察菌落形態(tài)，再選取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，染色完畢后用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)及顏色，判斷細(xì)菌屬性。然后將平板上的單菌落按照說(shuō)明書要求進(jìn)行生化鑒定。

1.5 人工回歸感染實(shí)驗(yàn)

將40只健康牛蛙隨機(jī)分為4組，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(GPY923細(xì)菌感染組、GPX924細(xì)菌感染組、GPY923和GPX924混合細(xì)菌感染組。) ，1個(gè)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組注射病原菌的無(wú)菌PBS緩沖液重懸液，濃度為1.0×108cfu/mL,每只注射劑量為0.3 mL，對(duì)照組注射等量無(wú)菌PBS緩沖液，均在背部的肌肉進(jìn)行注射。注射后連續(xù)14 d觀察并記錄牛蛙的死亡數(shù)量、死亡時(shí)間，并對(duì)瀕死的蛙進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.6 肝臟切片觀察

分別取瀕死牛蛙的肝、脾和潰爛的皮膚與健康牛蛙的肝、脾和皮膚，固定于多聚甲醛固定液常溫固定24 h，制作石蠟切片，經(jīng)蘇木精—伊紅法染色后用光學(xué)顯微鏡觀察。

1.7 藥物敏感實(shí)驗(yàn)

將兩種細(xì)菌用比濁法調(diào)濃度至1.0×108cfu/mL的病原菌涂布于BHI平板上，然后用無(wú)菌的鑷子將林可霉素、丁胺卡那、紅霉素、氯霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢氨芐、卡那霉素、阿奇霉素、氨芐西林、青霉素、環(huán)丙沙星、新霉素、羧芐西林、氟苯尼考、阿莫西林、四環(huán)素、利福平、慶大霉素、磺胺異噁唑、苯唑西林和麥迪霉素共24種不同的藥敏片貼附于平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)量并記錄抑菌環(huán)的直徑。根據(jù)說(shuō)明書推薦的判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷細(xì)菌對(duì)于藥物的敏感程度。每種藥敏片重復(fù)操作3次。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 發(fā)病牛蛙的臨床癥狀

自然發(fā)病牛蛙初期(圖1-a)和中期(圖1-b)出現(xiàn)背部隆起和背部出血的癥狀，隨著背部的積液增多，皮膚逐漸變薄，最終破裂(圖1-c)。在這期間，牛蛙食欲不振，神情呆滯，行動(dòng)緩慢，體色變黑。解剖死蛙發(fā)現(xiàn)其肝臟出現(xiàn)花斑且呈棕色，脾臟腫大變黑，膽囊發(fā)黑，腹部出現(xiàn)紅色的積液且肌肉出現(xiàn)出血的現(xiàn)象(圖1-d)。

圖1 自然發(fā)病牛蛙感染初、中、末期及解剖圖

2.2 16S rRNA基因序列分析

將測(cè)序結(jié)果在NCBI的GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，初步鑒定菌株GPY923為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，菌株GPY924為海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)，然后用MEGA10的N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。兩株細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果如圖2與圖3所示，菌株GPY923與嗜水氣單胞菌、GPY924與海豚鏈球菌親緣關(guān)系最近，聚在同一枝上，置信度分別為97%和100%。

圖2 菌株GPY923系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果

圖3 菌株GPY924系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果

2.3 革蘭氏染色與生理生化特性結(jié)果

從患病牛蛙的背部積液、肝、脾的部位分離純化出兩株細(xì)菌，革蘭氏染色后用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，GPY923為革蘭氏陰性短桿菌，GPX924為革蘭氏陽(yáng)性球菌(如圖4和圖5所示)。在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24 h后觀察到，GPY923菌落為中央凸起圓形，顏色呈灰白色；GPX924菌落則為短鏈狀白色小圓點(diǎn)。再將兩株細(xì)菌接種在血瓊脂平板上，菌落周圍均出現(xiàn)透明的溶血環(huán)，為β型溶血。根據(jù)分離的兩株細(xì)菌的形態(tài)顏色及生理生化特性結(jié)果，結(jié)合《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[10]判斷菌株GPY923為嗜水氣單胞菌，GPX924為海豚鏈球菌。分離菌株的生理生化鑒定結(jié)果如表1所示。

圖4 GPY923革蘭氏染色結(jié)果

圖5 GPY924革蘭氏染色結(jié)果

表1 分離菌株的生理生化鑒定結(jié)果

2.4 組織病理學(xué)觀察

組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示，所有病蛙的肝臟中均出現(xiàn)肝細(xì)胞局灶性裂解壞死現(xiàn)象，圖6-g壞死程度最大，圖6-a和圖6-d部分出現(xiàn)黑色素巨噬細(xì)胞。病蛙的脾臟出現(xiàn)不同程度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和紅髓細(xì)胞間隙增寬現(xiàn)象，部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，圖6-b中細(xì)胞裂解壞死殘存細(xì)胞碎片。圖6-c、 圖6-f和圖6-i的皮膚纖維細(xì)胞均有損傷，圖6-c和圖6-i的纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列疏松，出現(xiàn)斷裂，真皮層下的組織也發(fā)生斷裂。

圖6 人工感染牛蛙組織學(xué)觀察

2.5 人工回歸感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3個(gè)實(shí)驗(yàn)組在感染的第3 d后，出現(xiàn)精神萎靡，食欲不振，背部注射部位腫脹的現(xiàn)象，而對(duì)照組正常。第7 d，混合細(xì)菌感染組的背部腫脹程度比其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組更嚴(yán)重，其背部皮膚變薄，出現(xiàn)了死亡現(xiàn)象。第14 d，混合細(xì)菌感染組只剩下兩只瀕死牛蛙；GPY923細(xì)菌感染組和GPX924細(xì)菌感染組死亡數(shù)均為6只，其余牛蛙狀態(tài)萎靡。16 d后實(shí)驗(yàn)組牛蛙均死亡。對(duì)照組狀態(tài)正常，未出現(xiàn)死亡。將瀕死牛蛙解剖觀察，GPY923和GPX924混合細(xì)菌感染組與自然感染的特征一致；而GPY923細(xì)菌感染組背部腫脹程度小于GPX924細(xì)菌感染組，其內(nèi)部器官亦呈現(xiàn)出不同程度的充血和出血現(xiàn)象。

2.6 藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如表2中所示,菌株GPY923對(duì)丁胺卡那、頭孢他啶、頭孢呋辛、青霉素和氟苯尼考敏感，對(duì)紅霉素、多西環(huán)素、頭孢氨芐、卡那霉素和新霉素中度敏感，對(duì)林可霉素、氯霉素、恩諾沙星、阿奇霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、羧芐西林、阿莫西林、四環(huán)素、利福平、慶大霉素、磺胺異噁唑、苯唑西林和麥迪霉素不敏感。菌株GPY924對(duì)丁胺卡那、紅霉素、氯霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、頭孢氨芐、卡那霉素、阿奇霉素、氨芐西林、青霉素、環(huán)丙沙星、新霉素、羧芐西林、氟苯尼考、阿莫西林、四環(huán)素、利福平、慶大霉素、磺胺異噁唑、苯唑西林和麥迪霉素敏感，對(duì)頭孢他啶中度敏感，對(duì)林可霉素和頭孢呋辛不敏感。

表2 牛蛙分離菌的藥物敏感性試驗(yàn)

3 討論

嗜水氣單胞菌屬于革蘭氏陰性短桿菌，廣泛存在于水體環(huán)境中，能感染多種生活在水體環(huán)境的動(dòng)物，包括草魚(Ctenopharyngodonidella)、羅非魚(Oreochromismossambicus)、黃鱔(Monopterusalbus)和中華鱉(Pelodiscussinensis)等[13-16]。感染動(dòng)物主要特征為局部皮膚發(fā)生潰爛和肌肉或內(nèi)臟充血出血,本試驗(yàn)的人工感染試驗(yàn)患病牛蛙癥狀與之一致。本研究中嗜水氣單胞菌接種在血瓊脂平板時(shí)產(chǎn)生β型溶血環(huán)證明其有較強(qiáng)的溶血性，推測(cè)其原因?yàn)榉蛛x出的嗜水氣單胞菌能產(chǎn)生外毒素中的溶血素導(dǎo)致動(dòng)物內(nèi)出血[17]。海豚鏈球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，感染動(dòng)物包括羅非魚和鱘(Acipensersinensis)等[18-19],感染的臨床癥狀為肝、脾、腎腫脹出血，體表出血潰瘍，海豚感染則表現(xiàn)為皮膚膿腫[20]。海豚鏈球菌感染其它物種的典型特征與本研究中患病牛蛙相符，其部分不同特征產(chǎn)生的原因推測(cè)可能是物種的差異性導(dǎo)致的。海豚鏈球菌在溶血試驗(yàn)中出現(xiàn)β型溶血環(huán)，證明此致病菌有較強(qiáng)的溶血性。廣東南部地區(qū)夏秋季的水溫偏高，普遍在25 ℃以上，非常適宜嗜水氣單胞菌和海豚鏈球菌的快速繁殖，并且牛蛙的養(yǎng)殖模式為高密度養(yǎng)殖，在攝食斗爭(zhēng)或求偶時(shí)容易導(dǎo)致體表?yè)p傷繼而引發(fā)感染。有學(xué)者研究表明[21]嗜水氣單胞菌是抑制蛙類的自身免疫力的重要因素，當(dāng)牛蛙感染了嗜水氣單胞菌后，自身免疫力下降，使其更容易感染海豚鏈球菌。海豚鏈球菌則在牛蛙的背部產(chǎn)生膿腫，加重牛蛙的病情，使牛蛙加速走向死亡。海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌都有較強(qiáng)的溶血性，兩者協(xié)同使牛蛙死于敗血癥。

本研究中患病牛蛙在背部出現(xiàn)腫脹癥狀，在牛蛙常見(jiàn)的腐皮病、腹水病、紅腿病和消化道疾病中尚未發(fā)現(xiàn)此癥狀。本試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明嗜水氣單胞菌對(duì)丁胺卡那、頭孢他啶、頭孢呋辛、青霉素和氟苯尼考敏感，對(duì)多種藥物耐藥；海豚鏈球菌對(duì)林可霉素和頭孢呋辛耐藥，對(duì)頭孢他啶中度敏感，其余藥物均敏感。嗜水氣單胞菌的藥敏實(shí)驗(yàn)中使用了24種抗生素只有6種抗生素為敏感，接近3/4的抗生素耐藥。嗜水氣單胞菌的耐藥程度非常高，其可能與人們長(zhǎng)期濫用和盲目使用抗生素有關(guān)。為了避免以后無(wú)藥可用的情況發(fā)生，學(xué)者們需極力尋找抗生素的替代品。有研究表明中草藥能有效防治細(xì)菌性疾病，并減少環(huán)境的污染，如訶子和秦皮能抑制和殺死嗜水氣單胞菌，抑菌環(huán)直徑達(dá)到20 mm以上[22]。黃連和黃柏等藥物對(duì)抑制海豚鏈球菌較強(qiáng)[23]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)確定海豚鏈球菌和嗜水氣單胞菌為牛蛙患病的主要病原，綜合感染后可導(dǎo)致牛蛙背部腫脹，多個(gè)器官病理?yè)p傷，最后因嚴(yán)重的出血和功能障礙死亡。其中的嗜水氣單胞菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥性，對(duì)頭孢類藥物敏感；但海豚鏈球菌對(duì)頭孢類藥物有耐藥性，綜合兩者特性，在藥物的選擇上要使用丁胺卡那、紅霉素和氟苯尼考等抗生素或使用中草藥進(jìn)行抑菌殺菌。