陳大力，郭雨萌，李敬民，李雯，王衛(wèi)平，孫春萌

(1.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥物制劑及輔料研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)藥科大學(xué)藥用輔料及仿創(chuàng)藥物研發(fā)評(píng)價(jià)中心，江蘇 南京 210009；2.云南萊德?？萍加邢薰?，云南 昆明 650113)

鈣作為人體必需的常量元素之一，在機(jī)體組成和正常生命活動(dòng)中發(fā)揮著不可或缺的作用，如骨骼牙齒的形成、神經(jīng)沖動(dòng)的產(chǎn)生和傳遞、心臟節(jié)律的維持、激素的分泌、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等[1-3]。為了維持正常生理活動(dòng)，人體每天需要攝入足夠量的鈣元素，但是目前鈣缺乏已成為一個(gè)全球性的營(yíng)養(yǎng)問題，針對(duì)鈣攝取不足或需要額外補(bǔ)鈣的人群，尤其針對(duì)兒童、中老年人、孕期及哺乳期女性群體，選擇合適的鈣補(bǔ)充劑是最直接有效的補(bǔ)鈣方式[4-6]。

隨著人口老齡化趨勢(shì)日趨明顯及鼓勵(lì)生育政策的不斷出臺(tái)，我國(guó)人民對(duì)鈣補(bǔ)充劑的需求日益增加，《“健康中國(guó)2030”規(guī)劃綱要》中也明確提出開展“健康骨骼”專項(xiàng)行動(dòng)。目前常用的鈣補(bǔ)充劑主要包括無機(jī)鈣、有機(jī)鈣和天然鈣等，其中以碳酸鈣為代表的無機(jī)鈣因含鈣量高、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)被廣泛使用，如碳酸鈣咀嚼片、碳酸鈣D3片等[7-9]。但是固體鈣的攝取和吸收過程需要消耗胃酸，會(huì)對(duì)消化功能產(chǎn)生不良影響，甚至可能會(huì)引起堿中毒[10-12]。鑒于兒童、中老年人、孕期及哺乳期女性生理情況的特殊性，固體鈣補(bǔ)充劑引起的副作用更應(yīng)受到關(guān)注和重視。為解決固體鈣補(bǔ)充劑引起的副作用，我們利用酸化反應(yīng)將礦物鈣制成分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的檸檬酸鈣和磷酸鈣的混合水溶性鈣補(bǔ)充劑，與固體鈣相比，該產(chǎn)品中鈣元素的吸收對(duì)胃酸的依賴度較低，可有效避免傳統(tǒng)固體鈣補(bǔ)鈣方式對(duì)消化功能產(chǎn)生的副作用。

本實(shí)驗(yàn)以碳酸鈣為對(duì)照，研究了水溶性鈣補(bǔ)充劑對(duì)大鼠體重、身長(zhǎng)、股骨長(zhǎng)、骨密度、骨鈣含量等關(guān)鍵性生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的影響，探討了水溶性鈣和固體鈣對(duì)大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為新型鈣補(bǔ)充劑的開發(fā)提供了策略和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 水溶性鈣(云南萊德?？萍加邢薰?，鈣含量為24.6%，批號(hào):210312)；碳酸鈣(浙江省建德市正發(fā)藥業(yè)有限公司，鈣含量為39.4%，批號(hào):D2010002)；硝酸(阿達(dá)瑪斯試劑，批號(hào):P1718914)；鹽酸(阿達(dá)瑪斯試劑，批號(hào):P1725043)；鈣單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，標(biāo)準(zhǔn)值1 000 μg·mL-1，唯一標(biāo)識(shí)218015-1)；鈧單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，標(biāo)準(zhǔn)值1 000 μg·mL-1，唯一標(biāo)識(shí)205009)。

1.2 儀器與設(shè)備 DHG-924385-Ⅲ電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；BAS124S電子天平(德國(guó) Sartorius 公司)；MDS-6G微波萃取儀(上海新儀微波化學(xué)科技有限公司)；iCAP RQ電感耦合等離子質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；iNSiGHT VET DXA小動(dòng)物雙能X射線骨密度分析儀(奧斯托醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康4周齡SD斷乳大鼠，雌性，50只，體重55～75 g，由南京君科生物提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(滬)2018-0006。大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2021-0011，室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度 50%～60%，正常晝夜交替，動(dòng)物自由攝取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料，飲用去離子水以避免從飲用水中獲得鈣。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 動(dòng)物飼料 基礎(chǔ)動(dòng)物飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，飼料配方為：10.0%酪蛋白、15.0%黃豆粉、54.0%小麥面粉、4.0%玉米油、2.0%纖維素、2.6%混合礦物鹽、1%混合維生素、0.2%氯化膽堿、0.2% DL-蛋氨酸、11.0%淀粉，調(diào)整鈣含量為0。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物分組、劑量及周期設(shè)置 SD大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，稱量體重，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只。設(shè)置低、中、高劑量水溶性鈣組(鈣含量100、200、400 mg·kg-1)，同時(shí)設(shè)置高劑量碳酸鈣對(duì)照組(鈣含量400 mg·kg-1)和基礎(chǔ)飼料對(duì)照組(僅給予基礎(chǔ)飼料)。按照大鼠體重經(jīng)口灌胃給予受試物，隔日一次。所有組別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均自由飲食，飲用去離子水，以避免從飲用水中獲得鈣，實(shí)驗(yàn)周期為7周。

1.5.2 觀察指標(biāo)

1.5.2.1 體重、身長(zhǎng) 給藥前禁食12 h，測(cè)定各組大鼠體重、身長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)期間，每周測(cè)量體重、身長(zhǎng)一次。

1.5.2.2 股骨干重、股骨長(zhǎng) 給藥結(jié)束，處死大鼠，剝離出雙側(cè)股骨，剔除肌肉和筋膜后，隨機(jī)選取5根左側(cè)股骨于105 ℃烘箱中烘至恒重，稱量股骨干重，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量長(zhǎng)度。

1.5.2.3 骨鈣含量 將恒重的左側(cè)股骨置于消解罐中，加入適量王水，采用微波消解法對(duì)其進(jìn)行消化。消解程序：900 W功率，150 ℃消解10 min，180 ℃消解5 min，210 ℃消解10 min。

然后以鈧元素作為內(nèi)標(biāo)，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)測(cè)定股骨的骨鈣含量(mg·g-1)。以標(biāo)準(zhǔn)品鈣元素的濃度(X)為橫坐標(biāo)，相關(guān)信號(hào)強(qiáng)度(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)響應(yīng)值計(jì)算所測(cè)樣品的鈣濃度。儀器檢測(cè)條件：冷卻氣流速為14 L·min-1；輔助氣流速為0.8 L·min-1；載氣流速為1.0 L·min-1；一級(jí)真空為2 mbar；二級(jí)真空為5×10-7mbar；渦輪轉(zhuǎn)速為999.9 Hz；泵速為40 r·min-1。

1.5.2.4 股骨密度 隨機(jī)選取5跟右側(cè)股骨，利用雙能X射線骨密度分析儀掃描測(cè)定整根股骨的骨密度值(g·cm-2)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果用Mean±standard deviation(SD)表示，數(shù)據(jù)采用Student′s t-test進(jìn)行組間差異分析，以P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)具有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 水溶性鈣對(duì)大鼠體重、身長(zhǎng)的影響 如表1所示，各組大鼠給藥前體重和身長(zhǎng)均無顯著性差異。喂養(yǎng)7周后，對(duì)各組大鼠體重及身長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明中劑量和高劑量水溶性鈣組的體重和身長(zhǎng)均顯著高于基礎(chǔ)飼料組(P<0.05)，并且高劑量水溶性鈣組的體重和身長(zhǎng)顯著高于高劑量碳酸鈣對(duì)照組(P<0.05)。

表1 水溶性鈣對(duì)大鼠體重及身長(zhǎng)的影響(n=10)

2.2 水溶性鈣對(duì)大鼠骨骼發(fā)育的影響 大鼠股骨骨長(zhǎng)及干重結(jié)果如表2所示，高劑量水溶性鈣組大鼠股骨長(zhǎng)顯著高于基礎(chǔ)飼料組和高劑量碳酸鈣對(duì)照組(P<0.05)，低劑量和中劑量水溶性鈣組股骨長(zhǎng)與基礎(chǔ)飼料組無顯著性區(qū)別(P>0.05)；低、中、高劑量水溶性鈣組的股骨干重均顯著高于基礎(chǔ)飼料組(P<0.05)，并且高劑量水溶性鈣組顯著高于高劑量碳酸鈣對(duì)照組(P<0.05)。

表2 水溶性鈣對(duì)大鼠股骨骨長(zhǎng)及干重的影響(n=5)

鈣元素濃度(X)與相關(guān)信號(hào)強(qiáng)度(Y)的線性回歸方程為Y=1 884.507 7X+1 653 585.557 3，R2=0.999 3，大于0.999，表明鈣元素在0～2 000 ppb 范圍內(nèi)線性良好，符合定量分析要求。通過線性方程計(jì)算各組大鼠股骨的骨鈣含量，結(jié)果如表3所示，低、中、高劑量水溶性鈣組大鼠股骨的骨鈣含量均顯著高于基礎(chǔ)飼料組(P<0.05)，高劑量水溶性鈣與高劑量碳酸鈣對(duì)照組相比，骨鈣含量無顯著性區(qū)別(P>0.05)。

大鼠股骨的骨密度結(jié)果如表3所示，低、中、高劑量水溶性鈣組大鼠股骨的骨密度均顯著高于基礎(chǔ)飼料組(P<0.05)，高劑量水溶性鈣與高劑量碳酸鈣對(duì)照組相比，骨密度無顯著性區(qū)別(P>0.05)。

表3 水溶性鈣對(duì)大鼠股骨骨鈣含量及骨密度的影響(n=5)

3 討論與總結(jié)

選擇合適的鈣補(bǔ)充劑是維持人體正常鈣水平的有效措施之一， 但是不同鈣劑發(fā)揮作用的過程和機(jī)理有所不同[13-14]。碳酸鈣因具有含鈣量高、來源廣泛等優(yōu)勢(shì)，已成為目前最常用的鈣源之一，但是碳酸鈣水溶性差，溶解度低，在吸收過程中需要消耗胃酸，會(huì)干擾胃部酸性環(huán)境，對(duì)消化系統(tǒng)產(chǎn)生一定副作用，如消化不良、腹脹、腸胃脹氣、便秘等[10，15]。而水溶性鈣補(bǔ)充劑中鈣元素直接以水溶性鈣離子形式存在，對(duì)胃腸道安全性較高，是解決固體鈣缺陷的有效方式[16-17]。該研究設(shè)計(jì)了低、中、高3個(gè)劑量的水溶性鈣實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)置基礎(chǔ)飼料組和高劑量碳酸鈣組作為對(duì)照，通過對(duì)SD大鼠關(guān)鍵性生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)進(jìn)行分析來探究水溶性鈣補(bǔ)充劑對(duì)大鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況的影響。

機(jī)體中的鈣大部分存在與骨骼和牙齒中，因此骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育情況是評(píng)價(jià)大鼠鈣吸收水平的重要指標(biāo)[18]。通過對(duì)大鼠股骨生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)進(jìn)行分析，可以看出水溶性鈣補(bǔ)充劑具有增加骨密度的功能，表現(xiàn)為低、中、高劑量水溶性鈣組股骨的股骨的骨干重、骨鈣含量和骨密度指標(biāo)均顯著大于基礎(chǔ)飼料組(P<0.05)，且高劑量水溶性鈣組的股骨骨長(zhǎng)顯著高于基礎(chǔ)飼料組(P<0.05)。此外，高劑量水溶性鈣組和高劑量碳酸鈣對(duì)照組大鼠股骨骨鈣含量及骨密度均無顯著性差異(P>0.05)，股骨長(zhǎng)和股骨干重甚至顯著大于高劑量碳酸鈣對(duì)照組(P<0.05)，說明水溶性鈣補(bǔ)鈣效果可達(dá)到甚至優(yōu)于相同劑量的碳酸鈣水平。

實(shí)驗(yàn)過程中觀察到高劑量碳酸鈣對(duì)照組大鼠狀態(tài)持續(xù)不佳，喂養(yǎng)7周后體重和身長(zhǎng)均顯著低于同等劑量的水溶性鈣實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，可能是由于碳酸鈣組大鼠胃酸消耗過多，對(duì)胃腸道產(chǎn)生了較大刺激性，使其消化系統(tǒng)受到了一定損傷，對(duì)大鼠健康狀態(tài)、正常攝食及相關(guān)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收產(chǎn)生不利影響。而水溶性鈣因不需要消耗胃酸，對(duì)大鼠健康狀況基本不會(huì)產(chǎn)生不利影響，攝食及營(yíng)養(yǎng)成分?jǐn)z取正常。體重及身長(zhǎng)數(shù)據(jù)可初步說明固體鈣補(bǔ)充劑對(duì)大鼠健康狀態(tài)影響較大，長(zhǎng)期高頻率服用對(duì)機(jī)體可能具有較大副作用，而水溶性鈣則具有較高的安全性。

綜合以上各項(xiàng)代謝指標(biāo)，說明水溶性鈣具有良好的補(bǔ)鈣效果，對(duì)骨密度的增加具有良好作用，安全性和相容性較高，是作為鈣補(bǔ)充劑的較佳選擇。