兀琦，宋書祎，陳啟梅，袁曉慶，劉其聳，尹雷，楊愛琳*，張加余*

(1.濱州醫(yī)學(xué)院,山東 煙臺 264003;2.煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司,山東 煙臺 265505)

過敏性疾病是由機體受到抗原刺激引起組織損傷或功能紊亂的病理性免疫反應(yīng)，臨床常見包括過敏性哮喘、特應(yīng)性皮炎(過敏性皮炎)、過敏性鼻炎和過敏性腸炎等[1-2]。目前，全球共逾3億人患有過敏性哮喘。新近發(fā)表在《The Lancet》雜志上的一份流行病學(xué)研究報道顯示，我國20歲及以上罹患過敏性哮喘的患者已達4 570萬人[3]。因其反復(fù)發(fā)作和難以根治的特點，過敏性疾病已成為世界性健康問題。

目前，過敏性疾病的主要防治方式包括潤膚、避免接觸過敏原、外用激素或鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑進行抗炎等，嚴(yán)重者可采用射線療法或系統(tǒng)免疫抑制劑。這些治療方式無法根治疾病，且長期使用會引發(fā)耐藥性、毛細(xì)血管擴張、皮膚變薄、萎縮等不良反應(yīng)[4-5]。如何真正控制過敏性疾病進程從而實現(xiàn)有效治療、改善過敏體質(zhì)、減少疾病復(fù)發(fā)成為令人關(guān)注的問題。本課題組研制的抗過敏組方KGM由半乳糖、甘露糖、低聚甘露糖、葡萄糖及赤蘚糖醇5種糖類組成。本文基于透明質(zhì)酸酶活性檢測及小鼠耳郭腫脹動物模型系統(tǒng)評價KGM的抗炎抗過敏作用，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討其起效機制，以期為開發(fā)具有抗炎抗過敏產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 KGM(煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司生產(chǎn))；透明質(zhì)酸酶(上海麥克林生化科技有限公司)；冰醋酸、醋酸鈉、乙酰丙酮、無水乙醇、二甲苯(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸(沈陽市新光化工試劑廠)；無水氯化鈣(天津市巴斯夫化工有限公司)；Chemdraw 19.0(美國Cambridge Soft公司)，所用數(shù)據(jù)庫名稱及其網(wǎng)址見表1。

表1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究采用的數(shù)據(jù)庫

1.2 儀器 SpectraMAX M2多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；6mm直徑打耳器(上海博睿達公司)；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州德科儀器制造有限公司)；AUW120D電子分析天平(日本島津公司)。

2 實驗方法

2.1 透明質(zhì)酸酶抑制率試驗

2.1.1 溶液配制 Buffer：溶液A(0.2 mol·L-1醋酸:11.55 mL冰醋酸溶于1 L蒸餾水中)4.8 mL，溶液B(0.2 mol·L-1醋酸鈉：16.4 g無水醋酸鈉或27.2 g三水合醋酸鈉溶于1 L蒸餾水中)45.2 mL，混合稀釋至100 mL，配制成pH為5.6的醋酸緩沖液；將透明質(zhì)酸酶和透明質(zhì)酸鈉均溶于醋酸緩沖液，使終濃度分別為500 U·mL-1和0.5 mg·mL-1；乙酰丙酮溶液：50 mL 1.0 mol·L-1碳酸鈉溶液和3.5 mL乙酰丙酮溶液混合均勻；P-DAB顯色劑：0.8 g對二甲氨基苯甲醛溶于15 mL濃鹽酸和15 mL無水乙醇混合均勻；氯化鈣溶液(CaCl2)：2.5 mol·L-1；氫氧化鈉溶液(NaOH)：5 mol·L-1；樣品濃度：125 mg·mL-1。

2.1.2 操作方法 A管：將0.5 mL的樣品液加入0.5 mL透明質(zhì)酸酶中；B管：將0.5 mL的樣品液加入0.5 mL醋酸緩沖液中；C管：將0.5 mL的透明質(zhì)酸酶加入0.5 mL醋酸緩沖液中；D管：0.5 mL醋酸緩沖液。37 ℃保溫20 min。每管分別加入CaCl2溶液0.1 mL，37 ℃保溫20 min。每管分別加入透明質(zhì)酸鈉0.5 mL，并在D管中加入醋酸緩沖液0.5 mL，37 ℃保溫40 min，之后放置室溫10 min。每管分別加入蒸餾水0.5 mL，NaOH溶液0.1 mL，乙酰丙酮溶液0.5 mL，沸水浴15 min，冰浴10 min，放置室溫10 min。每管加入P-DAB顯色劑1 mL，各管充分振蕩后加無水乙醇至8 mL，每管設(shè)置5個重復(fù)，放置室溫30 min后于530 nm處測定吸光值(A)。

透明質(zhì)酸酶抑制率(%)=[(C-D)-(A-B)]/(C-D)×100%

式中：A：試樣溶液(透明質(zhì)酸酶+樣品+透明質(zhì)酸鈉)的OD值；B：試樣空白(醋酸緩沖液+樣品+透明質(zhì)酸鈉)的OD值；C：對照溶液(透明質(zhì)酸酶+醋酸緩沖液+透明質(zhì)酸鈉)的OD值；D：對照空白(醋酸緩沖液+醋酸緩沖液+透明質(zhì)酸鈉)的OD值。

2.2 二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹試驗 取昆明小鼠10只，雌雄各半，隨機分為A、B兩組，每組5只。A組小鼠于右耳涂抹蒸餾水作為對照，B組小鼠右耳涂抹藥物，每天1次，連續(xù)3 d。B組小鼠右耳涂抹藥物。末次給藥30 min后，分別精密吸取二甲苯20 μL均勻涂抹于A、B兩組各鼠右耳上前后兩面。保持30 min，后處死小鼠，沿耳郭基線剪下兩耳，采用6 mm直徑打孔器于左右耳對稱部位打下耳片。用精密電子天平稱取各鼠耳質(zhì)量，計算小鼠耳郭腫脹度和小鼠耳腫脹抑制率。小鼠的耳郭腫脹度=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量；小鼠耳腫脹抑制率=(模型對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型對照組腫脹度×100%。

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.3.1 KGM作用靶點搜集 基于PubChem數(shù)據(jù)庫，分別輸入KGM(半乳糖、甘露糖、低聚甘露糖、葡萄糖及赤蘚糖醇)英文名得到相關(guān)成分的Canonical SMILESS，將其輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站搜索得到成分作用靶點信息。

2.3.2 炎癥、過敏和免疫相關(guān)作用靶點的篩選與預(yù)測 炎癥、過敏、免疫相關(guān)靶點的篩選通過GeneCards(http://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫搜索與免疫、炎癥及過敏關(guān)聯(lián)的所有受體及基因信息，通過繪制韋恩圖得到KGM和疾病共同靶點。將成分-靶點-疾病的相關(guān)信息整理成Excel表格，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

2.3.3 基因功能與通路分析 使用Metascape(http://metascape.org/)數(shù)據(jù)庫對KGM作用于炎癥、過敏及免疫的相關(guān)靶點進行Gene Ontology(GO)分析，設(shè)定物種為homo sapiens，閾值P<0.01，篩選前20條生物過程。同時，對KGM作用于炎癥、過敏及免疫的相關(guān)靶點進行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析，設(shè)定物種為homo sapiens，閾值P<0.01，并篩選前20條通路。

2.4 統(tǒng)計與分析 應(yīng)用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，實驗結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，每組至少重復(fù)5次，組間數(shù)據(jù)采用方差分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 透明質(zhì)酸酶抑制率試驗 具體數(shù)值如表2所示。當(dāng)產(chǎn)品濃度為125 mg·mL-1時，KGM對透明質(zhì)酸酶的抑制率為41%。當(dāng)30%≤藥物對透明質(zhì)酸酶的抑制率<50%被評價為一般抗過敏作用[6]。由此可見KGM具有一般抗過敏作用。

表2 透明質(zhì)酸酶抑制率試驗結(jié)果(530 nm)

3.2 二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹試驗 試驗研究結(jié)果如表3所示。模型對照組平均腫脹度為0.008 18 g，給藥組平均腫脹度為0.004 568 g，小鼠耳腫脹抑制率約為44%，說明KGM可明顯降低二甲苯所致小鼠耳朵腫脹程度，差異具有極顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。上述結(jié)果表明KGM具有較好的抗炎作用。

表3 各組小鼠耳郭腫脹度(n=5)

3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.3.1 KGM作用靶點搜集結(jié)果 通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站對KGM作用靶點進行搜集，得到葡萄糖作用靶點84個，低聚甘露糖作用靶點100個，甘露糖作用靶點84個，半乳糖作用靶點93個，赤蘚糖醇作用靶點31個，刪除重復(fù)靶點，共得到219個潛在作用靶點。

3.3.2 炎癥、過敏和免疫相關(guān)作用靶點的篩選與預(yù)測 在GeneCards數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞immunity，allergy及inflammation檢索到與免疫相關(guān)的靶點16 662個、5 018個、10 868個，刪除重復(fù)基因共得到19 212個共同靶點，取成分-疾病靶點交集部分，整合得到KGM對過敏、炎癥及免疫的潛在作用靶點209個(見圖1)。將成分-靶點-疾病的相關(guān)信息整理成Excel表格，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。

3.3.3 基因功能與通路分析 基于Metascape(http://metascape.org/)數(shù)據(jù)庫對KGM作用于炎癥、過敏及免疫的相關(guān)靶點進行GO和KEGG富集分析，設(shè)定物種為人，并篩選前20條生物過程或通路。

圖1 成分-疾病靶點交集韋恩圖

圖2 成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

GO富集分析(見圖3)結(jié)果顯示，相關(guān)靶點功能主要涉及腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體信號通路反應(yīng)(adenylate cyclase-modulating G protein-coupled receptor signaling pathway)、系統(tǒng)過程調(diào)節(jié)反應(yīng)(regulation of system process)、調(diào)節(jié)分泌反應(yīng)(regulation of secretion)、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路，偶聯(lián)環(huán)核苷酸第二信使反應(yīng)(G protein-coupled receptor signaling pathway,coupled to cyclic nucleotide second messenger)、離子輸運調(diào)節(jié)反應(yīng)(regulation of ion transport)等。其中，G蛋白偶聯(lián)受體是涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞膜受體中最大的一個家族，這類受體與G蛋白偶聯(lián)介導(dǎo)信號傳遞，G蛋白即異源三聚體鳥苷酸結(jié)合蛋白，也叫GTP結(jié)合蛋白，它們參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，免疫或炎癥中的多種介質(zhì)如組胺、嘌呤核苷、前列腺素等都通過G蛋白偶聯(lián)受體傳遞信號，其在I型過敏反應(yīng)的發(fā)生過程中具有重要作用[7]。

圖3 預(yù)測靶點的GO富集分析結(jié)果

KEGG通路分析(見圖4)結(jié)果顯示，相關(guān)靶點通路主要涉及刺激神經(jīng)組織中的交互(neuroactive ligand-receptor interaction)、谷氨酸能突突觸通路(Glutamatergic synapse)、氮代謝(nitrogen metabolism)、胰島素抵抗(insulin resistance)、鈣離子通道(calcium signaling pathway)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)、淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)等。

圖4 預(yù)測靶點的KEGG通路分析結(jié)果

4 討論

KGM由5種糖類成分構(gòu)成，其中包括甘露糖和低聚甘露糖。已有文獻報道，甘露糖通過與透明質(zhì)酸的結(jié)合而在損傷部位聚集從而抑制活化的白細(xì)胞。此外，甘露糖能夠通過抑制中性粒細(xì)胞氧化爆發(fā)和誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞向Teg細(xì)胞分化進而抑制炎癥反應(yīng)[8]。低聚糖是將2～10個單糖分子通過糖苷鍵連接而成的化合物總稱。研究報道低聚甘露糖通過下調(diào)促炎介質(zhì)進而有效緩解葡聚糖硫酸鈉所致急性結(jié)腸炎小鼠的臨床癥狀[9]。本文通過透明質(zhì)酸酶活性檢測及小鼠耳郭腫脹動物試驗證明KGM具有良好的抗炎抗過敏作用。

KGM成分較為復(fù)雜，應(yīng)用傳統(tǒng)“1個藥物、1個基因、1種疾病”的模式很難系統(tǒng)地闡明KGM的潛在作用機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過大數(shù)據(jù)挖掘、高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)分析等多種技術(shù)來揭示“藥物(復(fù)方)-靶標(biāo)(基因)-通路”相互作用的復(fù)雜體系，構(gòu)建藥物的核心靶點和藥效生物網(wǎng)絡(luò)，揭示潛在作用機制，現(xiàn)已成為藥物研究的一種新模式[10]。在本研究中，我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測了KGM的抗炎抗過敏作用靶點。預(yù)測顯示KGM有219個靶點，其中與炎癥、過敏和免疫相關(guān)的有209個。結(jié)合GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示GBA、AKR1B1、CASP3、VDR、CA2、CA1、CA12、CA9、ACE、FUCA1、MGAM、SI等是KGM主要作用靶點。同時，KGM主要影響3條炎癥信號相關(guān)通路，分別為G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、鈣離子通道、cAMP信號通路，為KGM的抗炎抗過敏機制研究提供了指導(dǎo)。

綜上，本文評價了KGM的抗炎抗過敏活性，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法初步探索了KGM發(fā)揮抗炎抗過敏作用的潛在機制，可為KGM深度開發(fā)提供初步數(shù)據(jù)。