丁美林，張香玉，江建國

（1.東臺(tái)市中醫(yī)院，江蘇 東臺(tái) 224200；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 200120；3.如東縣中醫(yī)院，江蘇 如東 226400）

清熱祛濕外洗方是江蘇省如東縣中醫(yī)院協(xié)定方，由連翹、黃柏、苦參、板藍(lán)根等中藥組成，具有清熱解毒、化濕透邪的功效，臨床用于治療兒童發(fā)熱、手足口皰疹，伴有潰瘍疼痛、納差等癥狀，也就是兒童常見的手足口病。經(jīng)多年臨床應(yīng)用并驗(yàn)證，清熱祛濕外洗方對(duì)兒童患者使用方便、療效良好?，F(xiàn)代藥理研究表明，金銀花中有機(jī)酸有抗炎、抗病毒、抗菌等藥理活性[1]；苦參中苦參酮、異黃腐醇、槐屬二氫黃酮G 和苦參醇I 具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用[2]；板藍(lán)根木脂素類成分對(duì)流感病毒誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)具有免疫調(diào)節(jié)作用[3]；黃柏主要含有生物堿類、酚酸類、三萜類和黃酮類等成分，具有抗炎、抗菌、降血壓和免疫抑制等藥理活性[4]。選用君藥黃柏中鹽酸小檗堿的含量、清熱祛濕外洗方干膏率綜合評(píng)分作為指標(biāo)，正交試驗(yàn)確定清熱祛濕外洗方的制備工藝，本研究根據(jù)《中國藥典》（2020 年版）四部項(xiàng)下，薄層色譜鑒別法對(duì)連翹、苦參、黃柏、板藍(lán)根進(jìn)行薄層色譜鑒別，以期為醫(yī)院制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 島津高效液相色譜儀（日本島津公司）；PHS-25B PH 計(jì)（上海大普儀器有限公司）；HPB-425i BEL 十萬分之一電子天平（意大利貝爾Engineering srL）；HN101-1A 恒溫電熱干燥箱（上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠）；WFH-203B 三用紫外分析儀（上海馳唐實(shí)業(yè)有限公司）；QCD3120 超聲波清洗器（天津旗美科技有限公司）；HH-S2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）；DW-2 型調(diào)溫電熱器（南通市長江光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

苦參堿對(duì)照品（批號(hào)：110805-201709）；鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-202015，中國食品藥品檢定研究院）；槐定堿對(duì)照品（批號(hào)：110784-201706，中國食品藥品檢定研究院）、連翹對(duì)照藥材（批號(hào)：120908-201817，中國食品藥品檢定研究院）；板藍(lán)根對(duì)照藥材（批號(hào)：121177-201608，中國食品藥品檢定研究院）；硅膠G 板（批號(hào)：20220507；青島海洋化工有限公司）、硅膠G 板（批號(hào)：20220508；青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司）、硅膠G 板（批號(hào)：20140701；煙臺(tái)芝罘黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗(yàn)廠）；清熱祛濕外洗方（批號(hào)：20220218）；所用中藥飲片均購自南通市三越飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 清熱祛濕外洗方的制備工藝

2.1.1 浸泡時(shí)間與吸水率的考察

稱取處方量藥材，置于燒杯中，加入一定量的水，在室溫下靜置1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，每個(gè)時(shí)間段倒出被藥材吸收剩下的藥液體積，量取體積，稱取重量，計(jì)算吸水率[5]，由浸泡清熱祛濕方的時(shí)間與吸水率考察結(jié)果得出，清熱祛濕外洗方浸泡3 h 左右即可，吸水率為197%。

2.1.2 正交試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)對(duì)水提取工藝進(jìn)行考察，影響水提的主要因素為A 加水量（倍）、B 煎煮時(shí)間（h）、C 煎煮次數(shù)（次），將清熱祛濕外洗方中鹽酸小檗堿的含量、干膏率的綜合評(píng)分作為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳提取工藝參數(shù)[6]。因素與水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。分析表明，在清熱祛濕外洗方水提過程中，加水量與煎煮次數(shù)為顯著性影響因素（P＜0.05），可根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際情況調(diào)整。正交試驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝為A3B3C2，即加入12 倍量的水，煎煮3 次，每次1 小時(shí)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.2 清熱祛濕外洗方的薄層色譜鑒別

2.2.1 連翹鑒別

取本品溶液20 ml，離心，去除上清液，取沉淀物，加乙醚5 ml 萃取3 次，合并濾液，水浴揮干，殘?jiān)蛹状? ml 使其溶解，作清熱祛濕外洗方供試品溶液，同法制備（缺連翹）陰性對(duì)照溶液。取連翹對(duì)照藥材6 g，加水回流提取，取連翹對(duì)照藥材溶液20 ml，加乙醚萃取3 次，每次5 ml，過濾，合并濾液，揮干，殘?jiān)蛹状? ml 使溶解，作為連翹對(duì)照藥材溶液。吸取10 μl 清熱祛濕外洗方供試品溶液、連翹對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照溶液，按照2020 年版《中國藥典》通則0502 試驗(yàn)，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸（15∶10∶0.25）為展開劑，展開后噴以10%硫酸乙醇溶液，置紫外燈光（365 nm）下檢視斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 連翹薄層色譜鑒別圖（預(yù)實(shí)驗(yàn)）

圖2 連翹薄層色譜鑒別圖

2.2.2 苦參鑒別

取清熱祛濕外洗方10 ml，用氨試液調(diào)置pH 9～10，加三氯甲烷5 ml 萃取3 次，合并濾液，水浴揮干，殘?jiān)? ml 無水乙醇溶解，作清熱祛濕外洗方供試品溶液，同法制備（缺苦參）陰性對(duì)照溶液。取苦參堿、槐定堿、苦參堿和槐定堿對(duì)照品，分別加一定量乙醇制備成對(duì)照品溶液。吸取2 μl 清熱祛濕外洗方供試品溶液、苦參堿對(duì)照品溶液、槐定堿對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液，按照2020 年版《中國藥典》通則0502 試驗(yàn)，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-丙酮-甲醇（8 ∶3 ∶1.5）為展開劑，展開，噴以碘化鉍鉀溶液，出現(xiàn)顯著斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 苦參薄層色譜鑒別圖（預(yù)實(shí)驗(yàn)）

圖4 苦參薄層色譜鑒別圖

2.2.3 黃柏鑒別

取清熱祛濕外洗方10 ml，水浴蒸干，加甲醇10 ml，超聲處理15 min，過濾，取濾液作供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml 含0.1 mg 的溶液，作對(duì)照品溶液，同法制備（缺黃柏）陰性對(duì)照溶液。取黃柏對(duì)照藥材0.2 g，加甲醇10 ml，超聲20 min，作黃柏對(duì)照藥材溶液。吸取1～3 μl 清熱祛濕外洗方供試品溶液、鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液，按照2020年版《中國藥典》通則0502 試驗(yàn)，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開劑，展開，置紫外燈光（365 nm）下檢視，出現(xiàn)顯著斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 黃柏薄層色譜鑒別圖（預(yù)實(shí)驗(yàn)）

圖6 黃柏薄層色譜鑒別圖

2.2.4 板藍(lán)根的薄層鑒別

取清熱祛濕外洗方20 ml，超聲30 min 后離心，保留上清液，水浴蒸干，加甲醇1 ml 使其溶解，作供試品溶液，同法制備（缺板藍(lán)根）陰性對(duì)照溶液。取板藍(lán)根對(duì)照藥材2 g，加80%甲醇20 ml，超聲30 min，靜置一夜，濾過，濾液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? ml 使其溶解，作板藍(lán)根對(duì)照藥材溶液。吸取10 μl 清熱祛濕外洗方供試品溶液、板藍(lán)根對(duì)照藥材溶液、陰性對(duì)照溶液，按照2020年版《中國藥典》通則0502 試驗(yàn)，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-石油醚（1∶1）為展開劑，展開，置紫外燈光（254 nm）下檢視，出現(xiàn)顯著斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，結(jié)果見圖7、圖8。

圖7 板藍(lán)根薄層色譜鑒別圖（預(yù)實(shí)驗(yàn)）

圖8 板藍(lán)根薄層色譜鑒別圖

3 討論

3.1 對(duì)清熱祛濕外洗方的制備工藝討論

清熱祛濕外洗方治療小兒手足口病，可加速皰疹消退，作為如東縣中醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定方已使用多年，兒科醫(yī)師通過臨床觀測考察，清熱祛濕外洗方臨床療效顯著，且安全可靠，表明清熱祛濕外洗方有其研究的價(jià)值。處方中連翹、苦參、黃柏、板藍(lán)根等，具有清熱解毒、化濕透邪的功效，可抑制炎癥及調(diào)節(jié)免疫功能，是治療小兒手足口病的重要機(jī)制[7]，且外洗方式便于兒童患者接受[8]，因此綜合分析確定清熱祛濕外洗方為水提工藝，外洗方式。根據(jù)中藥君臣佐使處方分析，將君藥黃柏中的鹽酸小檗堿、處方藥的干膏率做為考察指標(biāo)，用正交試驗(yàn)確定制備工藝，為開發(fā)清熱祛濕外洗方制備工藝打下良好的基礎(chǔ)。

3.2 對(duì)清熱祛濕外洗方的薄層色譜鑒別討論

連翹薄層色譜鑒別過程中參照文獻(xiàn)[9]，不能達(dá)到預(yù)期結(jié)果，而連翹在清熱祛濕外洗方中屬于君藥之一，考慮連翹在處方分析中重要性，所以重新制定符合清熱祛濕外洗方中連翹鑒別方案。總結(jié)分析在相同的條件下，對(duì)照藥材溶液能出現(xiàn)顯著的斑點(diǎn)而供試品溶液不能出現(xiàn)顯著結(jié)果，所以需重新考察清熱祛濕外洗方供試品溶液的制備。清熱祛濕外洗方溶液為酸性溶液，連翹中含有醇苷，在酸性條件下不穩(wěn)定，而選擇加熱水解能很好的分離出有效成分[10]，因此選擇加熱水解制備連翹對(duì)照藥材溶液，其他條件不變的情況下，能達(dá)到對(duì)連翹的薄層色譜鑒別。

苦參薄層色譜鑒別過程中，曾參照《中國藥典》[11]苦參項(xiàng)下鑒別，不能出現(xiàn)顯著性斑點(diǎn)。根據(jù)苦參的化學(xué)性質(zhì)[12]，總結(jié)分析實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整展開劑的比例，因此將展開劑比例調(diào)整為甲苯-丙酮-甲醇（8 ∶3 ∶1.5），其他條件未變，能出現(xiàn)顯著斑點(diǎn)但斑點(diǎn)有重疊現(xiàn)象。根據(jù)斑點(diǎn)重疊現(xiàn)象，分析提示可能是由于甲苯、丙酮等分析試劑為揮發(fā)性溶液，不利于斑點(diǎn)的分離，最終在其他條件不變的基礎(chǔ)上將鑒別環(huán)境選擇低溫干燥下進(jìn)行，斑點(diǎn)易分開，能夠達(dá)到預(yù)期結(jié)果。

黃柏薄層色譜鑒別研究的文獻(xiàn)較多，文獻(xiàn)報(bào)道黃柏在不同的展開劑均能很好地出現(xiàn)顯著性斑點(diǎn)，為了準(zhǔn)確地找出清熱祛濕外洗方中黃柏薄層色譜鑒別方案，因此將對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液及供試品溶液制備方式、鑒別環(huán)境等相同條件下，展開劑選取正丁醇-冰醋酸-水[13]、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水[14]、二氯甲烷-甲醇-濃氨[15]分別進(jìn)行考察，均能不同程度顯現(xiàn)斑點(diǎn)，根據(jù)實(shí)際操作情況，最終確定方便易得的正丁醇-冰醋酸-水，定為清熱祛濕外洗方黃柏薄層鑒別的展開劑。

板藍(lán)根在中藥君臣佐使分析中屬于佐使藥，顧全處方全局選取板藍(lán)根進(jìn)行薄層色譜鑒別，在初期方案中選取（R，S）-告依春、氨基酸、靛玉紅等為對(duì)照品溶液，相同的環(huán)境下進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)考察，結(jié)果對(duì)照品溶液均不太理想[16]。因此，選用板藍(lán)根對(duì)照藥材作為對(duì)照溶液進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)照藥材與供試品溶液預(yù)實(shí)驗(yàn)初期結(jié)果較為理想，薄層色譜鑒別過程中為了能夠有效地達(dá)到預(yù)期結(jié)果，采用預(yù)實(shí)驗(yàn)與正式試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)的可重復(fù)性，因此根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)方案選定為板藍(lán)根的最終實(shí)驗(yàn)方案。

3.3 總結(jié)

綜上所述，將清熱祛濕外洗方處方藥浸泡3 h，加入12 倍量的水，煎煮3 次，每次1 h，結(jié)果表明清熱祛濕外洗方提取工藝穩(wěn)定可行。該制劑中連翹、苦參、黃柏、板藍(lán)根的定性鑒別方法簡便、重現(xiàn)性好，為清熱祛濕外洗方的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。