馬小梅，宋亞倩，羅瑞明

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院 銀川 750021）

中國(guó)的綿羊飼養(yǎng)歷史悠久，綿羊存欄數(shù)、品種遺傳資源較多。據(jù)《國(guó)家畜禽遺傳資源品種名錄（2021年版）》統(tǒng)計(jì)，我國(guó)綿羊品種或遺傳資源共有89 個(gè)，其中包括44 個(gè)地方綿羊品種，32 個(gè)培育綿羊品種，13 個(gè)引進(jìn)綿羊品種。整體上來(lái)說(shuō)，中國(guó)的綿羊主要有藏系綿羊、蒙古系綿羊以及哈薩克系綿羊[1]。藏綿羊作為我國(guó)西北地區(qū)特有的羊種，主要分布在西藏、青海、四川、甘肅等地區(qū)，由于常年生活在平均海拔3 000 m 以上的高寒、低氧地區(qū)，造就了藏綿羊耐寒、耐粗飼、抗病等優(yōu)點(diǎn)[2]。灘羊是寧夏特色優(yōu)勢(shì)畜種，是一種極其珍貴的動(dòng)物資源，特定的自然生態(tài)環(huán)境賦予了灘羊肉鮮香、細(xì)嫩，不膻、不腥等優(yōu)良品質(zhì)[3-4]。新疆細(xì)毛羊?qū)倜?、肉兼用?xì)毛羊，產(chǎn)于新疆鞏乃斯種羊場(chǎng)，是新中國(guó)成立以來(lái)育成的第一個(gè)毛、肉兼用細(xì)毛羊品種[5]。

灘羊（Tan sheep）系蒙古羊的一個(gè)分支，屬于短脂尾綿羊，是中國(guó)珍貴的綿羊品種。其肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特且含脂率低，不膻不腥，是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)羊肉之一。與其它羊肉相比，灘羊肉具有獨(dú)特風(fēng)味與口感；且營(yíng)養(yǎng)成分結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于其它品種羊肉。

近年來(lái)，以其它品種羊肉冒充灘羊肉的現(xiàn)象屢屢發(fā)生。這不僅侵犯了消費(fèi)者權(quán)益，更阻礙了灘羊肉產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定健康發(fā)展。研發(fā)快速、準(zhǔn)確鑒別灘羊及其它品種綿羊肉的分子標(biāo)記技術(shù)，是灘羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟需解決的技術(shù)問(wèn)題。

表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tags，EST）是分子標(biāo)記的重要工具，基于EST 序列開(kāi)發(fā)的SSR 稱為表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（EST-SSR）。ESTSSR 作為表達(dá)基因的一部分，不僅可以對(duì)功能基因進(jìn)行定位[6-7]，而且可以將不同種群或同一種群基因的遺傳多態(tài)性檢測(cè)出來(lái)，甚至能夠在近源物種中實(shí)現(xiàn)跨種擴(kuò)增[8]。迄今為止，雖然已有很多從植物的EST 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選微衛(wèi)星標(biāo)記的報(bào)道，如葡萄[9]、茄子[10]、蘆筍[11]、胡蘿卜[12]、小麥[13]和松樹(shù)[14]等，但是基于EST-SSR 標(biāo)記方法對(duì)于動(dòng)物物種的研究較少，目前僅發(fā)現(xiàn)在鯉魚(yú)、草魚(yú)、黃鱔、鲇魚(yú)、牛、蝦等和昆蟲(chóng)的報(bào)道。

本文旨在利用現(xiàn)有綿羊EST 數(shù)據(jù)庫(kù)資源開(kāi)發(fā)EST-SSR 標(biāo)記，并對(duì)開(kāi)發(fā)的EST-SSR 的分布情況、堿基組成、堿基類型等方面進(jìn)行生物信息分析。采用PCR 技術(shù)和毛細(xì)管電泳技術(shù)，篩選出對(duì)寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊有效區(qū)分的特異性引物。科學(xué)、準(zhǔn)確地判斷不同綿羊肉的品種，對(duì)于不同綿羊的種質(zhì)資源保護(hù)以及科學(xué)開(kāi)發(fā)利用均具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用純種寧夏灘羊的肝臟來(lái)自大夏牧場(chǎng)（寧夏鹽池縣），純種藏綿羊和純種新疆細(xì)毛羊的肝臟來(lái)自天祝藏族自治縣鑫榮盛生態(tài)養(yǎng)殖有限公司（甘肅省武威市）。

Taq Plus DNA 聚合酶、10X PCR 緩沖液（含Mg2+）、dNTP（10 mmol/L）、引物、DNA 快速抽提試劑盒，生工生物；6×DNA 負(fù)載染料、DNA 階梯混合、POP-7TM聚合物、二甲酰胺，Thermo Fisher 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR 儀、測(cè)序儀，美國(guó)ABI 公司；凝膠成像儀，上海復(fù)日科技有限公司；BP 系列精密單道可調(diào)移液器，加拿大BBI 公司；UV-Vis Spectrophotometer，Merinton 公司；TLTERTEK BERTHOLD 微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀，美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 采用典型集群的簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣方法進(jìn)行采樣，采樣過(guò)程中注意避免采集雜交群體及外源性污染。其中寧夏灘羊、藏綿羊和新疆細(xì)毛羊各20 只，分別多點(diǎn)取樣，每只綿羊肝臟樣本為25 g，采樣完成后將樣本分裝標(biāo)記，共計(jì)60 個(gè)樣本。

1.3.2 DNA 提取 采用動(dòng)物基因組DNA 快速抽提試劑盒[15]提取DNA，通過(guò)核酸蛋白濃度測(cè)定儀和1%瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估DNA 質(zhì)量。加入50～100 μL 的TE 緩沖液溶解DNA 沉淀，-20 ℃保存DNA 樣品。

1.3.3 綿羊EST-SSR 的查找與篩選 根據(jù)NCBI系統(tǒng)中的綿羊EST 數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用SSR Finder 軟件在線查EST-SSR 位點(diǎn)，查找中使用的標(biāo)準(zhǔn)是[16]：?jiǎn)?、二、三、四及五核苷酸的重?fù)次數(shù)分別為7，7，6，5，4；同時(shí)包括復(fù)合型微衛(wèi)星序列。此外，引物序列含量一般表現(xiàn)為上、下游引物的含量不能相差太大[17]。

1.3.4 EST-SSR 引物設(shè)計(jì)合成 使用Primer 3.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[18]，原則如下：引物長(zhǎng)度控制在18～24 bp 之間；GC 含量在40%～60%；熔解溫度（Tm）控制在50～65 ℃；產(chǎn)物的長(zhǎng)度控制在100～350 bp之間[19]；兩條引物的長(zhǎng)度差別不應(yīng)該太大[20]。引物之間盡量避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體；引物之間應(yīng)是低互補(bǔ)性或無(wú)互補(bǔ)性[21]。隨機(jī)篩選出100 條ESTSSR 引物，以3 個(gè)綿羊的肝臟DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1.3.5 EST-SSR 擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳 PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別見(jiàn)表1 和表2。

表1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系Table 1 PCR reaction system

表2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件Table 2 The programs of PCR

對(duì)獲得的EST-SSR 引物進(jìn)行熒光標(biāo)記和PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)和STR 分型。使用基因組分析儀分析數(shù)據(jù)，導(dǎo)出每對(duì)引物的峰圖文件，篩選出有一定多態(tài)性且有明顯特征峰的微衛(wèi)星標(biāo)記引物[22]。

1.3.6 特異性引物的有效性與適用性檢驗(yàn) 對(duì)篩選出的特異性引物進(jìn)行有效性與適用性驗(yàn)證。選用3 個(gè)純種綿羊品種各5 只，分別對(duì)其肝臟與肌肉進(jìn)行多點(diǎn)采樣，每個(gè)樣本25 g，采后將不同品種分裝標(biāo)記，共計(jì)30 個(gè)樣本。寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊的肝臟及肌肉分別標(biāo)記為L(zhǎng)1-5、L6-10、L11-15 和M1-5、M6-10 以及M11-15。提取3 個(gè)綿羊品種的不同部位DNA，用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 質(zhì)量評(píng)估

A260/A280 用于評(píng)估核酸樣品的純度[23]：純凈的樣品比值應(yīng)大于1.80[24]。試驗(yàn)中樣本所提取的全基因組DNA 的質(zhì)量濃度為（128.4±0.01）ng/μL，總量為50 μL，樣本A260/A280 比值為1.84±0.01，且凝膠電泳條帶清晰無(wú)拖尾（圖1），表明DNA 質(zhì)量良好。

圖1 DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The electrophoresis results of DNA

2.2 EST-SSR 位點(diǎn)分布結(jié)果

使用MISA 檢測(cè)序列中的EST-SSR 位點(diǎn)，結(jié)果得出：共計(jì)3 193 個(gè)有效EST-SSR 位點(diǎn)序列，長(zhǎng)度為150～3 628 bp 不等。通過(guò)表3 得出單、二、三、四、五核苷酸和復(fù)合SSR 重復(fù)序列個(gè)數(shù)和占比分別為834（26.12%），14（0.44%），7（0.22%），1（0.03%），3（0.09%）個(gè)和2 334（73.10%）個(gè)，結(jié)果說(shuō)明綿羊EST-SSR 的優(yōu)勢(shì)基序重復(fù)類型是復(fù)合堿基；然而相比其它重復(fù)類型，單核苷酸占比相對(duì)較高。

表3 綿羊基因組EST-SSR 重復(fù)單元分布特征Table 3 Distribution characteristics of EST-SSR repeat units in sheep genome

由圖2 可得，c 和c* 類型即復(fù)合SSR 的占比最高。觀察分析2 334 個(gè)復(fù)合SSR 重復(fù)序列發(fā)現(xiàn)，復(fù)合SSR 重復(fù)序列具有更大的SSR 長(zhǎng)度[25]，而且種類豐富，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非復(fù)合SSR。主要組合形式包括（CC）6（C）12*、（A）12（AA）6*、（C）12（CC）6*、（AA）6（A）12*和（A）13（AA）6*等。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了在EST-SSR 位點(diǎn)重復(fù)類型規(guī)律上，多數(shù)物種中還是以復(fù)合SSR 類型為主[22]，且不同的搜索標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)據(jù)庫(kù)的完整性都會(huì)對(duì)EST-SSR 的出現(xiàn)頻率產(chǎn)生影響[26-27]。

圖2 綿羊基因組EST-SSR 重復(fù)單元分布圖Fig.2 Distribution map of the EST-SSR repeat units in the sheep genome

2.3 3 種綿羊EST-SSR 引物的篩選

經(jīng)PCR 擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50對(duì)引物中，只有4 對(duì)EST-SSR 引物成功擴(kuò)增出穩(wěn)定條帶，4 對(duì)引物詳細(xì)信息見(jiàn)表4。

表4 EST-SSR 引物信息Table 4 Primer information for EST-SSR

2.4 3 種綿羊EST-SSR 引物的特異性分析

通過(guò)對(duì)3 個(gè)品種綿羊的50 個(gè)EST-SSR 引物的峰圖進(jìn)行分析，有3 對(duì)引物能夠產(chǎn)生高度特異性擴(kuò)增片段，可以用于區(qū)分3 個(gè)綿羊肉品種。圖3、圖4、圖5 分別是使用引物p2105.1：248-559、p2025.1：896-1059 和p2104.1：704-1015 的寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊的毛細(xì)管電泳結(jié)果。

2.4.1 寧夏灘羊引物特異性分析 由圖3 可知，使用引物p2105.1：248-559 的寧夏灘羊毛細(xì)管電泳結(jié)果有兩個(gè)明顯的特征峰，特征值大小為106.27 bp 和124.32 bp；而新疆細(xì)毛羊和藏綿羊均只有一個(gè)特征峰，特征數(shù)據(jù)大小分別為123.28 bp和123.32 bp。由此可見(jiàn)：p2105.1：248-559 對(duì)寧夏灘羊源性肉特異性良好，可將灘羊與另外兩綿羊品種進(jìn)行區(qū)分。

圖3 綿羊基因組p2105.1：248-559 位點(diǎn)SSR 電泳圖Fig.3 The electrophoresis results of SSR of p2105.1：248-559 site of sheep genomic

2.4.2 新疆細(xì)毛羊引物特異性分析 由圖4 可知，使用引物p2025.1：896-1059 的新疆細(xì)毛羊的特征值大小為158.77 bp；寧夏灘羊的特征數(shù)據(jù)大小為120.27 bp；藏綿羊的特征數(shù)據(jù)大小為129.42 bp 和124.13 bp。由此可見(jiàn)：p2025.1：896-1059 可將新疆細(xì)毛羊與寧夏灘羊和藏綿羊進(jìn)行區(qū)分。

圖4 綿羊基因組p2025.1：896-1059 位點(diǎn)SSR 電泳圖Fig.4 The electrophoresis results of SSR of p2025.1：896-1059 site of sheep genomic

2.4.3 藏綿羊引物特異性分析 由圖5 可知，使用引物p2104.1：704-1015 的藏綿羊只有一個(gè)特征峰，特征值大小為153.06 bp；對(duì)新疆細(xì)毛羊和寧夏灘羊均有兩個(gè)特征峰，特征值大小分別為116.64，134.31 bp 和116.63，132.92 bp。由此可見(jiàn)：p2104.1：704-1015 對(duì)藏綿羊源性肉特異性良好，可以對(duì)藏綿羊與另外兩綿羊進(jìn)行區(qū)分。

圖5 綿羊基因組p2104.1：704-1051 位點(diǎn)SSR 電泳圖Fig.5 The electrophoresis results of SSR of p2104.1：704-1051 site of sheep genomic

2.5 特異性引物的有效性與適用性檢驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 DNA 質(zhì)量評(píng)估 對(duì)3 種綿羊的肝臟和肌肉DNA 進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，結(jié)果顯示：肌肉DNA 的A260/A280 比值為1.80 ± 0.04，肝臟DNA 的A260/A280 比值為1.82±0.03，表明DNA 質(zhì)量良好。所提取肌肉DNA 的質(zhì)量濃度為（125.6±0.02）ng/μL，總量50 μL；肝臟DNA 的質(zhì)量濃度為（128.9±0.01）ng/μL，總量50 μL。由此可知，在相同體積下，肝臟DNA 的質(zhì)量濃度更高。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[28-29]。

2.5.2 EST-SSR 3 條引物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果

2.5.2.1 寧夏灘羊 將提取的寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊肝臟DNA 用引物p2105.1：248-559分別擴(kuò)增后，進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，引物p2105.1：248-559 對(duì)寧夏灘羊有兩個(gè)特征峰，特征值均在106 bp 和114 bp 上下波動(dòng)；對(duì)于藏綿羊和新疆細(xì)毛羊都只有一個(gè)特征峰，特征值在120 bp 上下波動(dòng)，充分說(shuō)明引物p2105.1：248-559能夠檢測(cè)到其中L1～5，共5 只綿羊?yàn)閷幭臑┭颍ū?）。將提取的寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊肌肉DNA 用引物p2105.1：248-559 分別擴(kuò)增并進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)引物p2105.1：248-559同樣對(duì)寧夏灘羊有兩個(gè)特征峰，對(duì)于藏綿羊和新疆細(xì)毛羊都只有一個(gè)特征峰，且對(duì)于3 種綿羊肉的肌肉鑒別結(jié)果的特征值合理，能夠成功檢測(cè)到其中M1～5，共5 只綿羊?yàn)閷幭臑┭颍ū?）；驗(yàn)證結(jié)果與試驗(yàn)前的形態(tài)學(xué)標(biāo)記一致。

2.5.2.2 新疆細(xì)毛羊 將提取的新疆細(xì)毛羊、寧夏灘羊和藏綿羊肝臟DNA 用引物p2025.1：896-1059 分別擴(kuò)增后，進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，引物p2025.1：896-1059 對(duì)新疆細(xì)毛羊的特征值在158 bp 的范圍內(nèi)，對(duì)于寧夏灘羊的特征值在120.27 bp；藏綿羊的特征值在129 bp 和124 bp 范圍內(nèi)，特征值有明顯差異，因此p2025.1：896-1059引物能夠檢測(cè)到其中L6～10，共5 只綿羊?yàn)樾陆?xì)毛羊（表5）。將提取的寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊肌肉DNA 用引物p2025.1：896-1059 分別擴(kuò)增并進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物p2025.1：896-1059 對(duì)于新疆細(xì)毛羊、寧夏灘羊和藏綿羊的肌肉DNA 的特征值波動(dòng)合理，說(shuō)明p2025.1：896-1059 熒光引物有良好的鑒別范圍，能夠檢測(cè)到其中M6～10，共5 只綿羊?yàn)樾陆?xì)毛羊（表5）；試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)前的形態(tài)學(xué)標(biāo)記結(jié)果一致。

2.5.2.3 藏綿羊 將提取的藏綿羊、寧夏灘羊和新疆細(xì)毛羊肝臟DNA 用引物p2104.1：704-1015分別擴(kuò)增后，進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。毛細(xì)管電泳的峰圖顯示，引物p2104.1：704-1015 對(duì)于藏綿羊只有一個(gè)特征峰，特征值均在153 bp 的范圍內(nèi)上下波動(dòng)；對(duì)于寧夏灘羊和新疆細(xì)毛羊都有兩個(gè)特征峰，兩個(gè)特征峰的特征值都在116 bp 和132 bp 范圍內(nèi)浮動(dòng)，提示引物p2104.1：704-1015 能夠檢測(cè)到其中L11～15，共5 只綿羊?yàn)椴鼐d羊（表5）。將提取的寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊肌肉DNA 用引物p2104.1：704-1015 分別擴(kuò)增后，進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)引物p2104.1：704-1015 對(duì)于肌肉樣本的峰的數(shù)量和特征值均與肝臟樣本一致，可以得出熒光引物p2104.1：704-1015 能夠檢測(cè)到M11～15 共5 只綿羊?yàn)椴鼐d羊（表5）；此驗(yàn)證結(jié)果與試驗(yàn)前的形態(tài)學(xué)標(biāo)記結(jié)果一致。

表5 EST-SSR 引物驗(yàn)證結(jié)果Table 5 EST-SSR primer verification results

此驗(yàn)證結(jié)果表明通過(guò)EST-SSR 方法獲得的熒光引物p2105.1：248-559、p2025.1：896-105 和p2104.1：704-1015 分別對(duì)寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊特異性良好，可對(duì)3 種綿羊肉品種進(jìn)行區(qū)分。

3 結(jié)論

本文采用Rapid Animal Genomic DNA Isolation Kit 試劑盒提取寧夏灘羊、新疆細(xì)毛羊和藏綿羊的肝臟DNA，并以EST 數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，通過(guò)SSR Finder 軟件及MISA 技術(shù)檢測(cè)序列中的EST-SSR 位點(diǎn)。Fast QC 可視化SSR 位點(diǎn)結(jié)果顯示，共計(jì)3 193 個(gè)有效EST-SSR 位點(diǎn)序列，其中復(fù)合SSR 重復(fù)序列（73.10%）>單核苷酸（26.12%）>二核苷酸（0.44%）>三核苷酸（0.22%）>五核苷酸（0.09%）>四核苷酸（0.03%），說(shuō)明綿羊EST-SSR的優(yōu)勢(shì)序列重復(fù)類型為復(fù)合SSR 重復(fù)序列。使用毛細(xì)管電泳檢測(cè)SSR 分型，發(fā)現(xiàn)引物p2105.1：248-559、p2104.1：704-1015 和p2104.1：704-1015 分別對(duì)3 種綿羊肉特異性良好，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)此3 種綿羊肉的有效區(qū)分。將EST-SSR 標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于寧夏灘羊肉、新疆細(xì)毛羊肉和藏綿羊肉的鑒別中，成功驗(yàn)證了3 條引物的有效性與適用性，這對(duì)于地方綿羊品種遺傳資源的開(kāi)發(fā)利用、品種鑒別及豐富分子標(biāo)記類型具有重要的意義。