卞 華，寧嘯駿，杜茹蕓

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院 上海 200233）

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）作為第一個(gè)人工合成的廣譜抗生素，因?qū)Χ喾N病原菌有顯著的抑制作用，曾被廣泛用于世界各國(guó)的畜牧養(yǎng)殖業(yè)中。然而，隨著動(dòng)物源性食品在食品安全領(lǐng)域受到廣泛地關(guān)注，各國(guó)專家發(fā)現(xiàn)氯霉素會(huì)對(duì)人體造血機(jī)能產(chǎn)生不可逆的嚴(yán)重副作用，并且抑制骨髓細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，造成機(jī)體正常菌群失調(diào)等[1-3]。國(guó)際食品法典委員會(huì)（Codex Alimentarius Commission，CAC）、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）對(duì)動(dòng)物源性肉制品中氯霉素殘留做了十分嚴(yán)格的要求。歐盟（Comité Européen de Normalisation，CEN）[4]、美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）、日本臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（Japan Committee for Clinical Laboratory Standards，JCCLS）[5]、加拿大標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（Standards Council of Canada，SCC）等相關(guān)監(jiān)管部門先、后規(guī)定其為非法添加物質(zhì)。為加強(qiáng)我國(guó)獸藥殘留監(jiān)控工作，保證動(dòng)物性食品衛(wèi)生安全，根據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》規(guī)定，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部235 號(hào)公告也明確將氯霉素列為禁用物質(zhì)[6]。

世界各國(guó)對(duì)氯霉素檢測(cè)方法的研究在不斷更新迭代中，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化領(lǐng)域中，ISO 促進(jìn)各國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化及其相關(guān)活動(dòng)的發(fā)展，擔(dān)負(fù)著制修訂經(jīng)全球協(xié)商一致的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的任務(wù)，是各個(gè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的參照基礎(chǔ)。氯霉素在ISO 體系下的標(biāo)準(zhǔn)為1998 發(fā)布的液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）：肉與肉制品中氯霉素測(cè)定的——推薦性方法（Meat and meat products-Determination of Chloramphenicol content-Reference method）[7]。由于抗生素種類不斷增多，而HPLC 法僅依據(jù)保留時(shí)間定性，并且抗干擾能力差，故容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)，HPLC 法的靈敏度和檢測(cè)數(shù)量級(jí)已經(jīng)達(dá)不到氯霉素實(shí)際添加量的要求，無(wú)法滿足獸藥殘留檢測(cè)的要求。因此，在ISO體系中重新修訂氯霉素的分析方法來(lái)供世界各國(guó)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)參照是非常必要的。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）具有高通量性、高選擇性和高精確度的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[8-9]，相比于普通高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），UPLC-MS/MS柱效更大，分離效果更好，分離時(shí)間更短。

歐盟的WC-083（ACA-10）公告，美國(guó)的LIB No.4306 發(fā)文和我國(guó)的國(guó)家推薦性標(biāo)準(zhǔn)GB/T22338-2008《動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測(cè)定》[10]均采用LC-MS/MS 方法測(cè)定肉制品中氯霉素的殘留量。本文參考國(guó)際上不同氯霉素殘留的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)研究文獻(xiàn)，并根據(jù)世界各國(guó)檢測(cè)水平和條件的差異，優(yōu)化提取和凈化步驟，旨在開發(fā)一套定量準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)潔，適用于全球不同國(guó)家使用的檢測(cè)方法，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對(duì)方法的精確度、重復(fù)性、再現(xiàn)性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部驗(yàn)證和實(shí)驗(yàn)室國(guó)際間比對(duì)，以確保試驗(yàn)結(jié)果滿足ISO 5725-2：2019[11]標(biāo)準(zhǔn)的要求。最終通過(guò)主導(dǎo)重要國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的制（修）訂工作，掌握各國(guó)在食品領(lǐng)域的先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)，提升我國(guó)在食品衛(wèi)生安全問題上的國(guó)際影響力和決定權(quán)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

氯霉素液體標(biāo)樣（CAP，100.2 mg/L，99.5%）、氯霉素固體內(nèi)標(biāo)（CAP-D5，94.89%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司。氯霉素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度均配制為100.0 mg/L。

乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙腈均為色譜純級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher Chemical 公司；甲酸、氨水色譜純級(jí)，美國(guó)ACS 色譜試劑；ProElut PLS-A 6cc/200mg，德國(guó)Merck 公司。

Waters XEVO TQ-XS 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、電噴霧離子源（ESI）、AcquityUPLC H-CLASS液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Waters 公司；MSZO 204S 型電子天平，瑞士Mettler Toleo 公司；C9NKSK1200BTU 超聲波清洗機(jī)，中國(guó)KUDOS 公司；D-91126 多管渦旋振蕩器，德國(guó)Heidolph 公司；Centrifuge 5804 高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；EZ-2.3 Elite 快速溶劑蒸發(fā)儀，英國(guó)Genevac 公司；Milli-Q 超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 方法提要 動(dòng)物源性肉制品中的氯霉素（CAP）利用乙酸乙酯提取，正己烷脫脂，ProElut PLS-A 固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定和確認(rèn)，同位素（CAP-D5）內(nèi)標(biāo)法定量。

1.2.2 試樣制備 后腿或者里脊部位的原料肉（豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉）分別于絞肉機(jī)中絞碎，選取10 kg 絞碎肉。根據(jù)不同基質(zhì)以及不同加標(biāo)水平，加入相應(yīng)的氯霉素液體標(biāo)樣（0.1 mg/mL），充分均質(zhì)為肉糜狀后，通過(guò)冷凍干燥技術(shù)制備成凍干粉末，進(jìn)行30 目篩分，留下過(guò)篩的凍干粉，收集后送入三維混合機(jī)，充分混合24 h 后，裝入玻璃容器保存（注：生鮮肉不符合各國(guó)出入境相關(guān)法規(guī)，不適合國(guó)際間實(shí)驗(yàn)室比對(duì)）。每瓶樣品凈含量為12 g，每種基質(zhì)樣品2 瓶，共10 瓶（檢測(cè)1瓶，備用1 瓶）。如數(shù)據(jù)重復(fù)性良好，無(wú)需進(jìn)行復(fù)測(cè)，否則使用備用樣品再次檢測(cè)，備用樣品和檢測(cè)樣品在取樣和檢測(cè)方法上相同。（樣品保存于4 ℃的干燥器內(nèi)，2 個(gè)月內(nèi)完成試驗(yàn)）。

1.2.3 試樣處理 稱樣前，需保證樣品的均勻性。等待凍干粉末恢復(fù)至室溫，充分搖勻后，稱取干粉m0=1 g，精確至0.0001 g，移入50 mL 具塞離心管中。稱取4 倍干粉質(zhì)量的超純水（m1）將凍干粉末復(fù)溶，等干粉復(fù)水膨脹并平衡約10 min 后（m待測(cè)=m0+m1），按照前處理步驟處理樣品。

1.2.3.1 提取 向復(fù)溶后的試樣基質(zhì)中加入50.0 μL（500.0 ng/mL）CAP-D5內(nèi)標(biāo)，加入5 mL 水進(jìn)一步溶解分散基質(zhì)，均質(zhì)1 min，加入25 mL 乙酸乙酯，渦旋振蕩5 min，超聲5 min，9 000 r/min 離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至另外一個(gè)離心管中，再次加入15 mL 乙酸乙酯，重復(fù)上述操作，合并兩次上清液，混合均勻，待凈化。

1.2.3.2 凈化 將上清液轉(zhuǎn)移至快速溶劑蒸發(fā)儀中，在45 ℃、10 000 Pa 的條件下，濃縮至干，加入5 mL 乙腈和5 mL 正己烷，渦旋2 min，超聲2 min，以9 000 r/min 離心2 min，棄去上層雜質(zhì)溶液，再加入5 mL 正己烷，重復(fù)上述操作。

將乙腈溶液轉(zhuǎn)移至ProElut PLS-A 固相萃取柱中，減壓過(guò)濾并保持流速為1～2 滴/s，直接收集過(guò)濾液，過(guò)0.22 μm PETF 濾膜，供UPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 將100 mg/L 的氯霉素液標(biāo)和氯霉素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（CAP-D5），用定容液逐級(jí)稀釋至0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL（CAP-D5 的質(zhì)量濃度均為5.0 ng/mL）的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

1.2.5 儀器條件

1.2.5.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters Atlantis T3（100 mm×2.1 mm，3 μm）或相當(dāng)者。流動(dòng)相A：0.1%氨水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.4 mL/min。梯度洗脫：0～0.75 min，10% B；0.75～2 min，10%～90%B；2～3 min，90%B；3～4 min，10%B。柱溫：30℃。進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.5.2 質(zhì)譜儀器條件 離子源：電噴霧離子源（ESI-）；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管壓力：3 000 V；椎孔電壓：50 V；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流速：800 L/h；霧化氣壓力：0.7 MPa；碰撞氣流速：150 L/h；離子源溫度：150 ℃；母離子、子離子、去簇電壓（DPs）、碰撞能（CEs）見表1。

表1 氯霉素化合物的母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能Table 1 Parent ions，product ions，declustering potentials and collision energies of CAP

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證 試驗(yàn)方法需要依據(jù)GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部方法驗(yàn)證，主要包括檢出限、定量限、線性相關(guān)性、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等精密度的系統(tǒng)性研究。

在通過(guò)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部統(tǒng)計(jì)學(xué)方法驗(yàn)證后，為確定方法的有效性和可比性，需要依據(jù)ISO5725-2：2019《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度和精密度）》，進(jìn)行國(guó)際間實(shí)驗(yàn)室比對(duì)。采用Mandel-h/k統(tǒng)計(jì)分析法驗(yàn)證原始數(shù)據(jù)的一致性，結(jié)合Cochran和Grubbs 統(tǒng)計(jì)學(xué)模型對(duì)數(shù)據(jù)的有效性進(jìn)一步進(jìn)行了驗(yàn)證，旨在明確數(shù)據(jù)中的岐離值和離散值，并盡可能地保留超臨界數(shù)據(jù)[12]，使統(tǒng)計(jì)結(jié)果更為真實(shí)、可靠，確保試驗(yàn)方法在全球范圍內(nèi)使用時(shí)準(zhǔn)確和有效。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)氯霉素的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，以及肉制品復(fù)雜的基質(zhì)情況，在方法研制過(guò)程中，比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18、Thermo AccucoreTMC18、Waters Atlantis T3、Agilent ZORBAX SB-C184 類色譜柱對(duì)目標(biāo)物分離度和靈敏度的影響。結(jié)果表明，AccucoreTMC18較容易受到雜質(zhì)干擾，峰型不理想，不符合正態(tài)分布；ACQUITY UPLC BEH C18目標(biāo)物出峰時(shí)間較早，目標(biāo)物保留時(shí)間時(shí)常會(huì)發(fā)生向前飄移；ZORBAX SB-C18響應(yīng)低，伴有明顯的拖尾和分叉現(xiàn)象；Atlantis T3色譜柱峰形尖銳對(duì)稱，靈敏度更高，出峰時(shí)間也更適合（如圖1），其對(duì)填料的孔徑大小、端基封口以及C18的鍵合密度都進(jìn)行了針對(duì)性地優(yōu)化，不僅能保留和分離水溶性的極性小分子有機(jī)化合物，還提供了更寬泛的pH 值適應(yīng)條件[13]，從而使Atlantis 色譜柱對(duì)氯霉素保留能力更強(qiáng)，使其在水流動(dòng)相中性能更加穩(wěn)定。

試驗(yàn)選用乙腈、甲醇作為備選有機(jī)相，2 種極性有機(jī)溶劑都能較好洗脫目標(biāo)物，而氯霉素在乙腈溶液中被保留的時(shí)間更合適，也更加穩(wěn)定，液相系統(tǒng)壓力也更低。同時(shí)，微量的氨水可以提供基質(zhì)離子化所需的負(fù)離子，提高離子化效率，促使更強(qiáng)的靈敏度，獲得更好的峰型。因此以0.1%氨水溶液和乙腈作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。

配制質(zhì)量濃度為10.0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用注射泵直接進(jìn)樣的方式注入質(zhì)譜儀。采用ESI-掃描方式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，優(yōu)化DP，確定氯霉素母離子[M-H]m/z-321.0 和氯霉素內(nèi)標(biāo)D5 母離子[M-H]m/z-326.0。對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，優(yōu)化CE，選取相對(duì)豐度較高且穩(wěn)定的兩個(gè)特征碎片離子作為定性、定量離子[M-H]m/z-321.0/256.9、[M-H]m/z-321.0/152.0*和內(nèi)標(biāo)特征碎片離子[M-H]m/z-326.0/157.1（見圖1），以滿足歐盟657/2002/EEC 指令規(guī)定，即禁用藥物定性檢測(cè)必須達(dá)到1 個(gè)母離子和至少2 個(gè)子離子共4 個(gè)確證點(diǎn)的要求[14-15]。

圖1 氯霉素多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖和總離子流圖色譜圖（10.0 ng/mL）Fig.1 Chromatograms of the representative target ions with MRM and TIC mode（10.0 ng/mL）

2.2 提取條件的優(yōu)化

試驗(yàn)選取甲醇、乙腈和乙酸乙酯作為獸藥殘留的備選提取溶劑。其中，甲醇極性過(guò)強(qiáng)，可能會(huì)同時(shí)提取出（除了氯霉素外）其它雜質(zhì)，對(duì)凈化過(guò)程會(huì)造成一定的干擾；乙腈雖然具有極性范圍寬，分子質(zhì)量小，基質(zhì)穿透能力強(qiáng)，對(duì)糖、脂肪、蛋白質(zhì)類化合物的沉淀效果較好，但對(duì)于肉制品基質(zhì)來(lái)說(shuō)，同樣會(huì)在提取過(guò)程中帶入共萃取雜質(zhì)[16]。乙酸乙酯的極性相對(duì)較弱，毒性較低，揮發(fā)更快，可作為氯霉素合適的提取溶劑。同時(shí)，肉制品需要加少許水進(jìn)行基質(zhì)分散，水具有良好的組織滲透性，能分散樣品，渦旋勻漿后能增加溶劑與樣品的接觸面積，防止肉制品中的蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑的影響下直接變性，從而緊縮成一團(tuán)，包裹住目標(biāo)化合物[17]，乙酸乙酯與水相不溶，能更徹底從水相中萃取出氯霉素。

本試驗(yàn)采用正己烷，Aglient AccuBond C18，Waters Oasis HLB，Waters Oasis PRiME HLB，ProElut PLS-A 固相萃取柱對(duì)最為復(fù)雜的豬肉基質(zhì)提取液進(jìn)行凈化，其結(jié)果見表2。經(jīng)過(guò)ProElut PLS-A 凈化，基質(zhì)中氯霉素的回收率能達(dá)到85%以上。作為通透式固相萃取小柱，ProElut PLS-A與Oasis PRiME HLB 的作用相似，通過(guò)特殊的篩板制作工藝，使樣品經(jīng)提取后直接過(guò)柱，將雜質(zhì)保留在特殊填料中，較大程度地降低氯霉素在洗脫過(guò)程中的損失率。同時(shí)，整個(gè)進(jìn)化過(guò)程較為穩(wěn)定，樣品更加潔凈，相對(duì)于傳統(tǒng)的反相SPE，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）結(jié)果也較為理想。對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的肉制品來(lái)說(shuō)，ProElut PLS-A 對(duì)于非極性酯類雜質(zhì)的保留更強(qiáng)，使過(guò)濾液更加純凈，目標(biāo)物的回收率更高。試驗(yàn)進(jìn)一步考察了復(fù)合式凈化方式，先用正己烷除去普通油脂類雜質(zhì)，再用ProElut PLS-A除去較為復(fù)雜的磷脂類雜質(zhì)，其結(jié)果要比單一凈化方式進(jìn)一步提升2.7%左右。

表2 不同凈化方式對(duì)氯霉素回收率的影響（n=6）Table 2 Effect of different purification methods on the recoveries of CAP（n=6）

2.3 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部驗(yàn)證

2.3.1 檢出限、定量限和線性相關(guān) 肉制品基質(zhì)復(fù)雜，本試驗(yàn)選擇雞、鴨、牛、羊、豬空白樣品作為考察對(duì)象。在上述空白基質(zhì)中添加一定濃度的氯霉素對(duì)照品，按照本方法進(jìn)行試驗(yàn)。依據(jù)定量離子信號(hào)與噪聲比例，即S/N≥3 的濃度為檢出限（LOD），S/N≥10 的濃度為定量限（LOQ）的原則，確定了本方法的檢出限為0.03 μg/kg，定量限為0.1 μg/kg。圖2 為牛肉基質(zhì)的空白和加標(biāo)TIC 色譜圖。

圖2 空白牛肉基質(zhì)和加標(biāo)牛肉基質(zhì)的色譜圖Fig.2 Chromatograms of the blank bovine matrix and 5-LOQ spiked bovine matrix

精密取適量氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，用定溶液將其稀釋至質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作溶液，以各組分目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比對(duì)其質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)。氯霉素在0.5～10.0 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9988，其質(zhì)量濃度與峰面積的線性方程為：Y=0.093292X+0.0056696（見圖3）。

圖3 氯霉素工作液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The calibration curve of CAP standard solution

2.3.2 回收率和精密度 選取雞、鴨、牛、羊、豬的空白基質(zhì)，進(jìn)行為期1 個(gè)月的加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)（5 基質(zhì)×6 平行×4 批次），樣品分別添加低、中、高3 個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)定結(jié)果如表3～表7所示，雞肉基質(zhì)中氯霉素各濃度的批內(nèi)回收率為83.74%～90.60%，RSD 為0.66%～1.31%，批間回收率為79.78%～88.47%，RSD 為1.17%～1.89%；鴨肉基質(zhì)中氯霉素各濃度的批內(nèi)回收率為78.24%～83.35%，RSD 為1.67%～1.98%，批間回收率為77.47%～83.59%，RSD 為1.65%～2.43%；牛肉基質(zhì)中氯霉素各濃度的批內(nèi)回收率為85.24%～91.23%，RSD 為0.67%～1.03%，批間回收率為86.96%～90.39%，RSD 為0.75%～1.29%；羊肉基質(zhì)中氯霉素各濃度的批內(nèi)回收率為74.28%～80.24%，RSD 為1.80%～2.36%，批間回收率為73.34%～81.57%，RSD 為1.82%～2.91%；豬肉基質(zhì)中氯霉素各濃度的批內(nèi)回收率為78.12%～80.74%，RSD 為1.84%～2.85%，批間回收率為77.62%～78.99%，RSD 為2.02%～2.43%。結(jié)果均符合《獸藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》和《GB/T 27404-2008 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范》相應(yīng)要求。

表3 雞肉基質(zhì)中氯霉素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n 內(nèi)=6，n 間=4）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of CAP in chicken matrix（nintra=6， ninterval=4）

表7 豬肉基質(zhì)中氯霉素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n 內(nèi)=6，n 間=4）Table 7 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of CAP in porcine matrix（nintra=6， ninterval=4）

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部方法學(xué)驗(yàn)證可知，該方法的線性范圍為0.5～10.0 ng/mL，線性相關(guān)性良好。線性相關(guān)系數(shù)（R2≥0.9986）。5 種基質(zhì)的批內(nèi)加標(biāo)回收為74.28%～91.23%，RSD 為0.66%～2.85%，批間加標(biāo)回收為73.34%～90.39%，RSD 為0.75%～2.91%，其中，牛肉和雞肉的加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果較為理想，回收率較高，穩(wěn)定性較強(qiáng)。鴨肉、豬肉和羊肉因?yàn)閺?fù)合脂類含量較多，雖受到基質(zhì)效應(yīng)的影響，各自回收率略低約3%左右，穩(wěn)定性也略有浮動(dòng)，但均滿足我國(guó)的食品質(zhì)量規(guī)范技術(shù)要求和美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）關(guān)于方法學(xué)準(zhǔn)確度的要求[18]。

表4 鴨肉基質(zhì)中氯霉素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n 內(nèi)=6，n 間=4）Table 4 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of CAP in duck matrix（nintra=6， ninterval=4）

表5 牛肉基質(zhì)中氯霉素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n 內(nèi)=6，n 間=4）Table 5 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of CAP in bovine matrix（nintra=6， ninterval=4）

表6 羊肉基質(zhì)中氯霉素的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n 內(nèi)=6，n 間=4）Table 6 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of CAP in ovine matrix（nintra=6， ninterval=4）

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部驗(yàn)證結(jié)果說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確性和精密度均較為理想，能夠滿足肉制品中氯霉素的定量檢測(cè)要求。

2.4 國(guó)際實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)驗(yàn)證

本研究組織了國(guó)內(nèi)外10 家權(quán)威實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室間對(duì)比驗(yàn)證。10 家驗(yàn)證單位均按照《ISO Ring test study protocol》協(xié)議，在收到凍干樣品后，存放于4 ℃的干燥器中，并在2 周之內(nèi)完成比對(duì)試驗(yàn)。試驗(yàn)過(guò)程需要按照本方法操作步驟進(jìn)行。最終由牽頭實(shí)驗(yàn)室收集原始數(shù)據(jù)，并運(yùn)用4種統(tǒng)計(jì)學(xué)模型（Mandel 模型、Cochran 模型、Grubbs模型和Dixon 模型）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，考查此方法的精密度和普適性，并確定其有效性。其中，Mandel 模型[19-20]可以檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果的精密度，能簡(jiǎn)潔明了地統(tǒng)計(jì)出各個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)試結(jié)果的偏離程度；Cochran 模型[19-20]用于更進(jìn)一步判斷實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各自檢測(cè)結(jié)果的精密度；Grubbs 模型[19-20]與Dixon 模型[19-20]用于更進(jìn)一步明確實(shí)驗(yàn)室間測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確度。10 家實(shí)驗(yàn)室原始數(shù)據(jù)、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差見表8 和表9。

表8 實(shí)驗(yàn)室間氯霉素檢測(cè)結(jié)果的原始數(shù)據(jù)（p=10，n=2）Table 8 Raw data of the international ring comparison test for CAP（p=10， n=2）

表9 實(shí)驗(yàn)室間氯霉素結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 9 Mean recovery and relative standard deviations（RSDs）of the international ring comparison test for CAP

2.4.1 Mandel 檢驗(yàn) 原始數(shù)據(jù)的有效性首先需要經(jīng)過(guò)Mandel 檢驗(yàn)驗(yàn)證，剔除對(duì)結(jié)果可能產(chǎn)生干擾的離群值，再進(jìn)行平均值和精密度等參數(shù)的統(tǒng)計(jì)和計(jì)算。

Mandel（h）統(tǒng)計(jì)量是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，即單個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果均值與所有實(shí)驗(yàn)室結(jié)果均值的偏差。某個(gè)實(shí)驗(yàn)室h值越大，則表明檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度越低[21]。h值計(jì)算方式見式（1）。

式中，Xi——各實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)，為——各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的平均值，SXˉ為——各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

hcrit，α為衡量實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度的檢驗(yàn)臨界值。10 家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的h值與hcrit，α比較結(jié)果如圖4。其中，7 家實(shí)驗(yàn)室的所有結(jié)果均≤h5%臨界值，結(jié)果為可信值。實(shí)驗(yàn)室4 的牛肉基質(zhì)結(jié)果（h=1.826）、實(shí)驗(yàn)室7 的鴨肉基質(zhì)結(jié)果（h=2.118）和實(shí)驗(yàn)室8的雞肉基質(zhì)結(jié)果（h=2.168）在h5%～h1%的臨界區(qū)間，結(jié)果為歧離值，但沒有離群數(shù)據(jù)出現(xiàn)。根據(jù)ISO 5725-2：2019-2《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第2 部》的規(guī)定，試驗(yàn)結(jié)果最終為歧離值時(shí)，不應(yīng)該被剔除，只有當(dāng)h值＞h1%臨界值，結(jié)果為離群值，才需要被剔除。因此，10 家實(shí)驗(yàn)室所有基質(zhì)的數(shù)據(jù)均通過(guò)Mandel（h）統(tǒng)計(jì)模型的驗(yàn)證。

圖4 Mandel（h）統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)（雞肉、鴨肉、牛肉、羊肉、豬肉）Fig.4 Mandel（h）statistical test（chicken，duck，bovine，ovine，porcine）

Mandel（k）統(tǒng)計(jì)量是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果的精密度，用來(lái)進(jìn)行結(jié)果離散性的統(tǒng)計(jì)分析，即單個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各試驗(yàn)結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果均值在相比其它實(shí)驗(yàn)室下比較結(jié)果的偏差。某個(gè)實(shí)驗(yàn)室的k值越大，表明其實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果精密度越低[22]。k值計(jì)算方式見式（2）。

式中，p——參加驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室總數(shù)，Si為——各實(shí)驗(yàn)室內(nèi)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

kcrit，α為衡量某個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果精密度的檢驗(yàn)臨界值。10 家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的k值與kcrit，α比較結(jié)果如圖5。其中，8 家實(shí)驗(yàn)室的所有結(jié)果均≤k5%臨界值，結(jié)果為可信值。實(shí)驗(yàn)室3 的雞肉基質(zhì)結(jié)果（k=2.136）和實(shí)驗(yàn)室7 的羊肉基質(zhì)結(jié)果（k=1.996）在k5%～k1%的臨界區(qū)間。結(jié)果為歧離值，同樣沒有離群數(shù)據(jù)出現(xiàn)。根據(jù)ISO5725-2：2019-2《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第2 部》的規(guī)定，試驗(yàn)結(jié)果最終為歧離值時(shí)，不應(yīng)該被剔除，只有當(dāng)k值＞k1%臨界值，結(jié)果為離群值，才需要被剔除。因此，10 家實(shí)驗(yàn)室所有基質(zhì)的數(shù)據(jù)也均通過(guò)Mandel（k）統(tǒng)計(jì)模型的驗(yàn)證。

圖5 Mandel（k）統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)（雞肉、鴨肉、牛肉、羊肉、豬肉）Fig.5 Mandel（k）statistical test（chicken，duck，bovine，ovine，porcine）

通過(guò)Mandel（h/k）統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)可知，10 家實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的重復(fù)性結(jié)果沒有較大的浮動(dòng)，均通過(guò)了有效性驗(yàn)證，均滿足ISO 5725-2：2019-2《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第2 部》對(duì)于準(zhǔn)確度的要求。無(wú)需采用數(shù)值離群法對(duì)原始數(shù)據(jù)作進(jìn)一步分析。

2.4.2 Cochran 檢驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)數(shù)據(jù)有效性有一項(xiàng)重要假設(shè)，即各實(shí)驗(yàn)室所提交數(shù)據(jù)的各自方差沒有顯著差異[23]。依據(jù)檢測(cè)方法和結(jié)果準(zhǔn)確度分析關(guān)于ISO5725-2：2019-2《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第2 部》的要求，原始數(shù)據(jù)的有效性還需要經(jīng)過(guò)Cochran 檢驗(yàn)驗(yàn)證，剔除對(duì)方差結(jié)果可能產(chǎn)生干擾的離群值。

Cochran 模型是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差的最大值進(jìn)行評(píng)估，屬于單側(cè)檢驗(yàn)[24]，其計(jì)算方式見式（3）。

式中，Si為——各實(shí)驗(yàn)室內(nèi)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，Simax為——Si中的最大值。

Ccrit，α是進(jìn)一步衡量某個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果精密度的檢驗(yàn)臨界值，當(dāng)Cmax值≤C5%臨界值，結(jié)果為可信值；當(dāng)Cmax值在C5%～C1%的臨界區(qū)間內(nèi)，結(jié)果為歧離值；當(dāng)Cmax值＞C1%臨界值，結(jié)果為離群值，如果標(biāo)準(zhǔn)偏差的最大值是離群值，則將該值舍去后對(duì)剩余的標(biāo)準(zhǔn)差重新計(jì)算Cochran 統(tǒng)計(jì)量。從表10 可知，5 種基質(zhì)結(jié)果的Cmax均遠(yuǎn)＜C5%臨界值0.602，判定該方法檢驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果均無(wú)歧離值和離群值。

表10 Cochran 統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)Table 10 Cochranstatistical test results

通過(guò)Cochran 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)可知，10 家實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的精密度結(jié)果沒有較大的浮動(dòng)，均通過(guò)了一致性驗(yàn)證，滿足ISO 5725-2：2019-2《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第2 部》對(duì)于精密度的要求。

2.4.3 Grubbs 檢驗(yàn) Grubbs 統(tǒng)計(jì)量是針對(duì)實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)一致性的進(jìn)一步數(shù)理檢驗(yàn)，分為單個(gè)離群值循環(huán)檢驗(yàn)和雙個(gè)離群值循環(huán)檢驗(yàn)[25]。

2.4.3.1 單個(gè)離群值檢驗(yàn)（單側(cè)檢驗(yàn)）Grubbs 單個(gè)離群值檢驗(yàn)?zāi)Ｐ陀糜诿鞔_一組數(shù)據(jù)中最大值或最小值是否為離群值，屬于雙側(cè)檢驗(yàn)[26]。Grubbs 單個(gè)離群值檢驗(yàn)的最大和最小統(tǒng)計(jì)量計(jì)算方法見式（4）和（5）。

式中，Xp——各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的最大值，X1——各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的最小值，為——各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的平均值，S——各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

Gcrit，α是進(jìn)一步衡量某個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度的檢驗(yàn)臨界值，當(dāng)Gp或G1值≤G5%臨界值，結(jié)果為可信值；當(dāng)Gp或G1值＞G5%但≤G1%臨界值，結(jié)果為歧離值；當(dāng)Gp或G1值＞G1%臨界值，結(jié)果為離群值，從表11 可知，單個(gè)離群值循環(huán)檢驗(yàn)中的Gp或G1均遠(yuǎn)＜G5%臨界值2.290，說(shuō)明此方法檢驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果均無(wú)歧離值和離群值。

2.4.3.2 雙個(gè)離群值檢驗(yàn)（雙側(cè)檢驗(yàn)）Grubbs 雙個(gè)離群值檢驗(yàn)?zāi)Ｐ陀糜诿鞔_一組數(shù)據(jù)中最大兩個(gè)值或最小兩個(gè)值是否為離群值，屬于雙側(cè)檢驗(yàn)[27]。Grubbs 雙個(gè)離群值檢驗(yàn)的最大和最小統(tǒng)計(jì)量計(jì)算方式見式（6）和（7）。

雙個(gè)離群值檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪浅蓚€(gè)最值后進(jìn)行計(jì)算的統(tǒng)計(jì)量，因此其與單個(gè)離群值檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷呐卸ǚ▌t相反，當(dāng)G值≥G5%臨界值，結(jié)果為可信值；當(dāng)G值＜G5%但≥G1%臨界值，結(jié)果為歧離值；當(dāng)G值＜G1%臨界值，結(jié)果為離群值，從表11 可知，雙個(gè)離群值循環(huán)檢驗(yàn)中的G均遠(yuǎn)大于G5%臨界值0.1864，明確該方法檢驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)室內(nèi)測(cè)試結(jié)果均無(wú)歧離值和離群值。

表11 Cochran 檢驗(yàn)結(jié)果Table 11 Grubbsstatistical test results

通過(guò)Grubbs 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)可知，10 家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)均為通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的有效數(shù)據(jù)，滿足ISO5725-2：2019-2《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第2 部》對(duì)于準(zhǔn)確度的要求。

經(jīng)過(guò)Mandel、Cochran 和Grubbs 組合統(tǒng)計(jì)模型的檢驗(yàn)可知，10 家實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果同時(shí)滿足實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果的精密度，無(wú)異常值需要進(jìn)行Dixon 模型檢驗(yàn)。本研究采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)模型均適用于分析動(dòng)物源性肉制品中氯霉素結(jié)果的有效性和一致性。

2.4.4 平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的分析 通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)有效性和一致性的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，將10 個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的平均值（m）、重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差（Sr）和再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差（SR）進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果如表12所示。

由表12 的數(shù)據(jù)可知，標(biāo)準(zhǔn)差與平均值之間沒有顯著的線性關(guān)系或者對(duì)數(shù)線性關(guān)系。根據(jù)ISO 5725-2：2019-2《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第2 部》的規(guī)定，可以采用各基質(zhì)Sr和SR的平均值來(lái)表征該方法的精密度[28]，即對(duì)于動(dòng)物源性肉制品中氯霉素含量的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差Sr和再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差SR分別為3.88×10-2和6.73×10-2。

表12 實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果的平均值（m），重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差（Sr）和再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差（SR）Table 12 Mean，repeatable standard deviation（Sr），reproducibility standard deviation（SR）of the international ring comparison test for CAP

3 結(jié)論

本文結(jié)合了氯霉素的理化性質(zhì)和不同肉類基質(zhì)的特點(diǎn)，對(duì)前處理方法進(jìn)行了開發(fā)，對(duì)儀器方法進(jìn)行了優(yōu)化，建立了一套定量準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)潔，適用于國(guó)際上不同國(guó)家使用的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，5 種不同基質(zhì)的動(dòng)物源性肉制品的低、中、高加標(biāo)回收率在73.34%～91.23%之間，RSD 在0.66%～2.91%之間，回收率穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好。同時(shí)，組織了國(guó)內(nèi)外10 家權(quán)威實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了國(guó)際間實(shí)驗(yàn)室比對(duì)，采用Mandel、Cochran 和Grubbs 統(tǒng)計(jì)學(xué)模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和精確性進(jìn)行了驗(yàn)證，數(shù)理統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明該方法的適用性廣泛，精密度良好。故被參與國(guó)標(biāo)委會(huì)專家認(rèn)可，經(jīng)ISO/TC34/SC6 委員會(huì)同意，將此方法修訂為ISO 13493：2021：Meat and meat products-Determination of Chloramphenicol content-reference method（《肉與肉制品中氯霉素的測(cè)定-推薦性方法》）[29]，已于2021年8月27日在全球發(fā)布，為世界各國(guó)標(biāo)委會(huì)制定相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

致謝：

感謝上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)項(xiàng)目基金對(duì)本實(shí)驗(yàn)的支持；感謝ISO/TC34/SC6 委員會(huì)對(duì)本實(shí)驗(yàn)方法的支持；并感謝美國(guó)奧本大學(xué)生物系統(tǒng)工程系教授向本實(shí)驗(yàn)提出的寶貴建議和指導(dǎo)。

感謝上海市食品研究所，為方法學(xué)驗(yàn)證進(jìn)行試樣制備；并感謝AB SCIEX、Agilent、SGS、Thermo technology、Intertek、廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)等國(guó)內(nèi)外著名企業(yè)參與國(guó)際間實(shí)驗(yàn)室比對(duì)工作。