徐瑞波，劉 旭，李偉程，沈 馨，張和平*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室 呼和浩特 010018 2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室 呼和浩特 010018 3 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 內(nèi)蒙古乳業(yè)生物技術與工程重點實驗室 呼和浩特 010018）

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）是厚壁菌門乳桿菌科的一種革蘭氏陽性桿狀細菌。鼠李糖乳桿菌廣泛存在于嬰兒糞便樣本以及人類母乳中[1]，這些細菌通常對消化道中的條件具有耐受性（即低pH 值、膽鹽、厭氧條件）[2]。國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群[3]，調(diào)節(jié)腸道免疫[4-7]，抗氧化[8]、抑制生物毒素[9]，抑制致病菌[10-11]和調(diào)控脂肪細胞分化[12]等功能。據(jù)報道，在新生兒中使用某些鼠李糖乳桿菌菌株，特別是鼠李糖乳桿菌GG，可促進早產(chǎn)和低出生體重新生兒的生長[13-14]。

前期研究[15]從40 份人初乳樣品中分離出有活性的益生菌菌株——鼠李糖乳桿菌Probio-M9，該菌株在人工胃腸液中消化11 h 后的存活率為78.33%，在中國具有自主知識產(chǎn)權，推測更適合中國人和其他亞洲人，因此本文對該菌株做后續(xù)安全性評估、動物實驗和全基因組測序等研究具有參考價值。

比較基因組學是從基因水平比較不同物種的基因組序列，從而了解其基因的功能、表達機制及物種進化的學科[16]。Sun 等[17]通過比較基因組學對213 株乳桿菌屬進行分析，系統(tǒng)解析了乳桿菌屬不同譜系的遺傳進化歷程，發(fā)現(xiàn)所有的乳桿菌都是由一個共同的祖先進化而來的。Yu 等[18]通過核心基因比對分析乳酸乳球菌、植物乳球菌等若干乳球菌屬的核心基因，解析乳球菌屬內(nèi)的遺傳進化關系，發(fā)現(xiàn)乳球菌屬在基因組大小，基因含量和碳水化合物代謝方面具有高度多樣性。孫靚[19]通過比較基因組學分析兩株鼠李糖乳桿菌，結果發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌基因組層面的斷裂基因和轉(zhuǎn)錄組層面的丙酮酸代謝途徑上表達的差異，可能是鼠李糖乳桿菌高產(chǎn)L-乳酸的原因。比較基因組學能有效分析、挖掘和利用微生物基因組各個層面信息，能夠準確且快速地研究菌種的同源基因以及特有功能。

目前對來源于母乳的菌株研究較少。特別是在中國，關于從人乳中分離得到的鼠李糖乳桿菌的研究報道更少，而關于母乳分離株鼠李糖乳桿菌的比較基因組研究更是少之又少。本研究將以母乳分離株鼠李糖乳桿菌Probio-M9 結合NCBI Refseq 數(shù)據(jù)庫下載的214 株鼠李糖乳桿菌基因組序列為研究對象，通過比較基因組學解析不同菌株基因特征及種內(nèi)基因差異，了解其遺傳進化機制，為鼠李糖乳桿菌Probio-M9 開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

鼠李糖乳桿菌Probio-M9 由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳酸菌菌種資源庫（Lactic acid bacteria collection center，LABCC）提供。

1.2 鼠李糖乳桿菌基因組序列

截止2021年4月17日，已將NCBI（National Coalition Building Institute，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）Refseq 數(shù)據(jù)庫中214 株鼠李糖乳桿菌基因序列以及一株暫未公開的鼠李糖乳桿菌Probio-M9 全部下載完成。

1.3 菌株培養(yǎng)與基因組DNA 的提取、測序

菌株鼠李糖乳桿菌Probio-M9 的培養(yǎng)具體操作步驟如下：將該菌接種到37 ℃的MRS 液體培養(yǎng)基中，無氧條件培養(yǎng)24 h 后進行傳代，最后使用PBS 緩沖液將3 代菌泥中廢棄培養(yǎng)基去除，然后進行全基因組DNA 的提取。全基因組DNA 提取方法參考鐘智等[20]的方法。將提取的DNA 通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行完整度和純度檢測，將符合要求的高質(zhì)量DNA 按照PacBio SMRT 全基因組DNA 建庫流程建立10 kb 文庫，建庫后根據(jù)PacBio SMRT RS II 測序平臺上機流程進行全基因組測序。

1.4 基因組測序和組裝

將測序所得原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估[21]，去掉低質(zhì)量測序序列和接頭，使用RS_HGAP_Assembly.3 軟件對鼠李糖乳桿菌Probio-M9 序列進行質(zhì)控和基因組組裝，并使用Circlator（V1.5.5）[22]軟件對3 代數(shù)據(jù)進行環(huán)化，最后獲得Probio-M9 的全基因序列。

1.5 比較基因組分析

1.5.1 泛-核心基因集構建 利用Prokka[23]軟件對菌株基因組進行基因預測后，采用Roary[24]軟件對核心基因集、泛基因集進行識別。

1.5.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構建 使用經(jīng)Roary 軟件分析得到的核心基因序列，通過TreeBest 軟件（http：//www.mybiosoftware.com/treebest）構建鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹（Neighbor-Joining，NJ）。使用iTol 在線軟件對系統(tǒng)發(fā)育樹進行可視化（http：// https：//itol.embl.de/）[25]。

1.5.3 平均核苷酸一致性（Average nucleotide identity，ANI）計算 本研究參考Jain 等[26]報道的fastANI（https：//github.com/ParBLiSS/FastANI）計算215 株鼠李糖乳桿菌的菌株間ANI 值。利用TBtools[7]軟件繪制ANI 聚類熱圖。

1.5.4 全基因組圈圖和功能基因組分析 將215株鼠李糖乳桿菌核酸序列文件分別上傳至RAST（Repaid Annotion using Subsystem Technology，http：//rast.nmpdr.org/rast.cgi）進行注釋，并下載對應的基因功能注釋文件。將鼠李糖乳桿菌Probio-M9 的功能基因注釋文件上傳至CGView Server（http：//stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/）進行圈圖繪制。

1.5.5 碳水化合物活性酶 將組裝完成的鼠李糖乳桿菌Probio-M9 全基因組序列上傳至在線注釋dbCAN 平臺中（http：//bcb.unl.edu/dbCAN2/）進行注釋，下載其注釋文件。統(tǒng)計鼠李糖乳桿菌Probio-M9 基因組信息。

2 結果和分析

2.1 鼠李糖乳桿菌基因組基本信息

對樣品鼠李糖乳桿菌Probio-M9 測序數(shù)據(jù)進行評估組裝后，拼接成完整的基因組圈圖（圖1），并統(tǒng)計鼠李糖乳桿菌所有菌株的基因組信息。鼠李糖乳桿菌Probio-M9 組裝后，基因組大小為2 987 632 bp，GC 含量為46.76%，包含2 934 個蛋白質(zhì)編碼區(qū)（Coding sequence，CDS）、60 個tRNA、75 個RNA。215 株鼠李糖乳桿菌基因組大小（2.97±0.11）Mbp，GC 含量為（46.68±0.016）%，CDS為（2 671±130）個。

圖1 鼠李糖乳桿菌Probio-M9 全基因組圈圖Fig.1 The whole genome circle-map of L.rhamnosus Probio-M9

2.2 泛-核心基因集構建

一個物種泛基因組主要由核心基因組、非必須基因組以及特有基因組3 部分組成[28]。215 株鼠李糖乳桿菌共識別到16 915 個泛基因，247 個核心基因，并且215 株鼠李糖乳桿菌核心基因占平均CDS 為9.2%，揭示鼠李糖乳桿菌存在一個較大的泛基因組，但是擁有一個較小的核心基因組。鼠李糖乳桿菌的泛-核心基因統(tǒng)計結果如圖2所示，核心基因隨著基因組的增加整體呈現(xiàn)一個先下降后趨于穩(wěn)定的狀態(tài)而泛基因組大小整體呈現(xiàn)上升趨勢，表明鼠李糖乳桿菌的泛基因組尚且處于一個相對開放的狀態(tài)，與Kant 等[29]的研究結果基本一致。

圖2 泛-核心基因集變化（a）和新基因集變化（b）趨勢圖Fig.2 The trend chart of the size of pan-core genes（a）and new genes（b）

2.3 核心基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹

系統(tǒng)發(fā)育樹可直觀反映菌株間群體結構和遺傳進化關系。為了研究鼠李糖乳桿菌種內(nèi)遺傳進化關系，本研究基于215 株鼠李糖乳桿菌（包含模式菌株鼠李糖乳桿菌DSM20021T=鼠李糖乳桿菌NBRC3425T=鼠李糖乳桿菌JCM1136T、鼠李糖乳桿菌NRRL B-442T），采用鄰接法，基于247 個核心基因通過1 000 次的引導迭代，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

由圖3 可知，215 株乳酸菌主要分為7 大分支，分別命名為分支Ⅰ、分支Ⅱ、分支Ⅲ、分支Ⅳ、分支Ⅴ、分支Ⅵ和分支Ⅶ。由圖可知，分支Ⅱ是該樹最大的分支且鼠李糖乳桿菌Probio-M9 和模式菌株均在該分支中，并且該分支各菌株之間的遺傳關系近、差異很小、區(qū)分難度大。同時根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹外圈注釋發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌的遺傳關系與分離源和分離地相關性不明顯。

圖3 基于核心基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on core genes

2.4 ANI 分析

ANI 是通過比對基因組的同源序列以鑒定菌株親緣關系[30]。在比較基因組學分析過程中，ANI可用于評估基因組間多態(tài)性的程度，也可基于基因組序列進行物種鑒別，一般認為ANI 值大于95%即為同一物種[31]。2018年Ciufo 等[32]將95%的閾值改為96%，并以此作為物種邊界。

為解析鼠李糖乳桿菌遺傳多樣性，本研究對215 株鼠李糖乳桿菌進行兩兩之間ANI 計算，并構建聚類熱圖，結果如圖4所示，全部菌株之間ANI 值均大于96.38%，鼠李糖乳桿菌菌株之間具有較高的總體序列同一性（>96%），這與Nissila等[33]和Arnold 等[34]的研究結果一致，提示鼠李糖乳桿菌種內(nèi)的相似度較高。

圖4 平均核酸一致性Fig.4 Average nucleotide identity

2.5 基因組預測與注釋

由于分支Ⅱ是系統(tǒng)發(fā)育樹最大分支且鼠李糖乳桿菌Probio-M9 和模式菌株均在該分支中，因此利用RAST 在線工具對分支Ⅱ中98 株鼠李糖乳桿菌菌株進行RAST 注釋，結果如圖5所示。在鼠李糖乳桿菌基因組中注釋到碳水化合物代謝（Carbohydrates）、蛋 白 質(zhì) 代 謝（Protein metabolism）、氨基酸及其衍生物（Amino acids and derivatives）、細胞壁和被膜（Cell wall and capsule）、DNA 代謝（DNA metabolism）、RNA 代謝（RNA metabolism）和應激反應（Stress response）等，共計26 個功能類別。其中占比最大的是“碳水化合物代謝”，其次是“蛋白質(zhì)代謝”和“氨基酸及其衍生物”。根據(jù)RAST 注釋發(fā)現(xiàn)菌株Lrh44、CRL1505、Lactobacillus rhamnosus、KF7、BIOML -A4、Lrh26、Lrh25、AMC010、1019 在硫代謝方面要顯著高于鼠李糖乳桿菌Probio-M9，而其它菌株與鼠李糖乳桿菌Probio-M9 呈現(xiàn)一種高度相似，從RAST 注釋無法找到差異。

圖5 RAST 注釋Fig.5 RAST annotation

2.6 基因組圈圖和功能基因組分析

本文以RAST 注釋中與鼠李糖乳桿菌Probio-M9 差異明顯的3 株菌和一株模式菌株鼠李糖乳桿菌DSM20021T為研究對象，通過BRIG 軟件進行分析，結果如圖6所示，參考菌株鼠李糖乳桿菌Probio-M9 與模式菌株鼠李糖乳桿菌DSM20021T 匹配度最高為100%，最低為63.31%。約有344 bp 和293 bp 基因組片段匹配度大于等于90%，占總片段長度的22.21%；分析發(fā)現(xiàn)477 bp 和613 bp 基因片段匹配度小于70%，約占總片段的3.08%。鼠李糖乳桿菌Probio-M9 注釋到12個特有基因（見表1），主要負責自身代謝、轉(zhuǎn)錄、運輸?shù)确矫娴恼{(diào)控。圖中白色部分是核苷酸同一性小于50%的區(qū)域，主要包括編碼應激蛋白、生物合成相關蛋白、假定蛋白和噬菌體相關蛋白等多種蛋白質(zhì)的基因，而這些蛋白質(zhì)小范圍的插入與缺失可以使菌株基因組結構多樣化[35-37]。

圖6 以鼠李糖乳桿菌Probio-M9 為參考基因組的Brig 分析Fig.6 Brig analysis based on L.rhamnosus Probio-M9 as reference genome

表1 鼠李糖乳桿菌Probio-M9 特有基因Table 1 L.rhamnosus Probio-M9 specific gene

同時又選取了2 株益生菌明星菌株鼠李糖乳桿菌GG、鼠李糖乳桿菌HN001 和一株模式菌株鼠李糖乳桿菌 DSM20021 與鼠李糖乳桿菌Probio-M9 進行BRIG 分析（如圖7），結果如表2所示，鼠李糖乳桿菌Probio-M9 相較于市面上的益生菌明星菌株編碼更多的關于水解、還原相關酶類，同時還發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌Probio-M9 編碼一個特別的基因（xly），與黃原膠裂解酶相關[38]，黃原膠裂解酶是一種黃原膠修飾酶，對黃原膠的改性及新型黃原膠寡糖的制備具有十分重要的意義。

表2 以鼠李糖乳桿菌Probio-M9 為參考基因組的功能基因組分析Table 2 Functional genome analysis using L.rhamnosus Probio-M9 as a reference genome

圖7 以鼠李糖乳桿菌Probio-M9 為參考基因組的全基因組圈圖Fig.7 Genome-wide cycle map with the reference genome of L.rhamnosus Probio-M9

2.7 益生特性相關基因分析

本研究基于Roary 軟件注釋到鼠李糖乳桿菌Probio-M9 含有與益生特性相關的基因，具體信息見表3。鼠李糖乳桿菌Probio-M9 含有谷胱甘肽合成（gshAB）、分泌胞外多糖（rmlA～rmlD、epsH）及核黃素合成（ribF）相關基因，同時含有耐酸基因（clpP）。研究表明[39]，谷胱甘肽是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)代謝的重要物質(zhì)，并且常參與腸黏膜的抗氧化機制，保護腸道免受組織損傷，提高有益菌株在胃腸道中的存活率。鼠李糖乳桿菌EPS 具有益生元、調(diào)節(jié)機體免疫功能、抗氧化效應、抑制動物脂肪生成和吸收重金屬等生理功能[40-43]。本研究還發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌Probio-M9 存在提高宿主代謝能力（tagE）和產(chǎn)乳酸（ldh）相關的基因，可提高菌株益生特性。本研究利用比較基因組學從基因水平揭示了鼠李糖乳桿菌Probio-M9 具有多個益生特性相關基因，認為其是一株具有潛在益生功能的菌株。

表3 鼠李糖乳桿菌Probio-M9 具有的益生特性相關基因Table 3 Genes related to probiotic properties of L.rhamnosus Probio-M9

3 結論

本研究以鼠李糖乳桿菌Probio-M9 為例，結合NCBI 數(shù)據(jù)庫214 株鼠李糖乳桿菌基因組序列進行比較基因組學研究。215 株鼠李糖乳桿菌通過247 個核心基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)分離源和分離地不存在明顯聚類趨勢。鼠李糖乳桿菌Probio-M9 處在分支最大的分支Ⅱ中，該分支各菌株之間的遺傳關系近、差異很小、區(qū)分難度大。然后對分支Ⅱ中98 株鼠李糖乳桿菌進行RAST 注釋分析發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌雖在功能方面整體存在高度的相似性，但其中部分菌株與鼠李糖乳桿菌Probio-M9 依然存在著一定差異，鼠李糖乳桿菌Probio-M9 相較于其它鼠李糖乳桿菌有著關于自身代謝、轉(zhuǎn)錄、運輸?shù)确矫娓鼜姷恼{(diào)控能力并且含有與益生功能相關的基因，如谷胱甘肽（gshAB）、胞外多糖（rmlA～rmlD、epsH）及提高宿主代謝能力（tagE）相關基因。本文通過比較基因組學分析發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌的序列與功能有著高度的相似性，并且鼠李糖乳桿菌Probio-M9 存在益生功能相關的基因，為后續(xù)鼠李糖乳桿菌Probio-M9 基因組研究及其益生功能開發(fā)奠定遺傳學基礎。