任順成，張丹丹，劉澤龍

（1 河南工業(yè)大學(xué) 河南省天然色素制備重點實驗室 鄭州 450001 2 北京工商大學(xué)食品營養(yǎng)與健康學(xué)院 北京 100048）

淀粉作為人們?nèi)粘ｏ嬍持械闹饕煞?，是人體新陳代謝的主要能量來源。然而，快消化淀粉會對某些人群（譬如糖尿病、肥胖等患者）的健康產(chǎn)生負(fù)面影響，長期大量攝入會導(dǎo)致人體血糖快速上升，易引發(fā)肥胖，加重糖尿病癥狀[1-3]。慢消化淀粉和抗性淀粉能使人體的餐后血糖緩慢上升，有利于控制和緩解這類疾病的發(fā)生。近年來，隨著Ⅱ型糖尿病、肥胖人數(shù)在全球范圍內(nèi)的快速增長，通過各種方式來減緩人類膳食中的淀粉消化已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點。有研究指出淀粉消化與淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)、直鏈淀粉含量，淀粉顆粒大小等有關(guān)[4-7]，食品體系中其它組分如蛋白質(zhì)的存在也會影響淀粉的消化率[8]。另外，某些蛋白質(zhì)可能具有類胰島素功能，有研究表明與僅攝入碳水化合物相比，攝入碳水化合物和小麥蛋白混合的水解液能在很大程度上刺激胰島素的產(chǎn)生和增活[9]。

蛋白質(zhì)對淀粉消化的影響已有較多報道。Khatun 等[10]發(fā)現(xiàn)將稻米中大米蛋白除去，導(dǎo)致大米淀粉消化率增加，且大米淀粉體外消化率與大米蛋白的殘留量呈負(fù)相關(guān)。此外，向大米淀粉中添加提取的大米蛋白，以濃度依賴的方式降低了大米淀粉的體外消化率。Ding 等[11]將薏米中的內(nèi)源蛋白去除后，發(fā)現(xiàn)薏米淀粉的最終水解濃度（C∞）顯著提高，脫蛋白后葡萄糖釋放速度加快，導(dǎo)致快消化淀粉（RDS）含量顯著增加，抗性淀粉（RS）含量降低。Xu 等[12]將面筋蛋白與小麥淀粉混合，探究了面筋蛋白及其水解物對小麥淀粉消化率的影響，其發(fā)現(xiàn)面筋蛋白的加入降低了小麥淀粉體外消化的一級動力學(xué)常數(shù)（k）和120 min 時的淀粉水解率。面筋蛋白與α-淀粉酶結(jié)合可降低酶的活性，從而抑制小麥淀粉的消化。Liu 等[13]研究了在高粱面條中加入外源蛋白后淀粉的消化率，結(jié)果表明：小麥蛋白、乳清分離蛋白和蛋清蛋白均能降低其淀粉消化率，增加抗性淀粉含量。

綜上所述，蛋白質(zhì)對淀粉的消化和減緩餐后血糖的上升有重要影響。目前，關(guān)于蛋白質(zhì)與淀粉消化性的研究大都是集中在小麥、玉米、大米等內(nèi)源性蛋白及乳清蛋白和蛋清蛋白等外源動物蛋白方面[14-15]，而關(guān)于外源植物蛋白，譬如一些雜糧等蛋白質(zhì)對淀粉消化的影響研究較少。

有研究指出，外源蛋白對淀粉消化的影響機制多為分子間的相互作用，蛋白質(zhì)的堿性氨基酸殘基能與帶負(fù)電的淀粉結(jié)合而影響淀粉的水解，同時一些雜糧蛋白還能與米面中的氨基酸互補，有助于提高米面的營養(yǎng)價值[16]。本研究基于蛋白質(zhì)對淀粉消化影響以及營養(yǎng)互補兩方面考慮，在前期研究基礎(chǔ)上，選擇從燕麥、藜麥、黑豆、扁豆等4 種雜糧中提取的蛋白質(zhì)，探究這4 種外源植物蛋白對小麥淀粉消化特性的影響，并進(jìn)一步探究其對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶兩種淀粉消化酶的抑制作用，為雜糧蛋白在淀粉類食品中的應(yīng)用，以及開發(fā)糖尿病、肥胖病患者功能性食品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥淀粉，上海源葉生物科技有限公司；燕麥（原料產(chǎn)地：內(nèi)蒙古赤峰）、藜麥（原料產(chǎn)地：青海省海西蒙古族藏族自治州）、黑豆（原料產(chǎn)地：遼寧朝陽）、扁豆（原料產(chǎn)地：內(nèi)蒙古赤峰）均購自贛州康瑞農(nóng)產(chǎn)品有限公司；燕麥、藜麥、黑豆、扁豆等4 種蛋白質(zhì)，實驗室自制。

α-淀粉酶（12 U/mg）、α-葡萄糖苷酶（700 000 U/mL）上海源葉生物科技有限公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷（pNPG）、3，5-二硝基水楊酸，上海麥克林生化科技股份有限公司；其余試劑均購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL-5A 臺式低速離心機，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；UV-1600B 紫外-可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；101FX-1 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海樹立儀器儀表有限公司；PHS-3C 雷磁酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HZT-B5000 電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；MVS-1 旋渦混合器，北京金北德工貿(mào)有限公司；SHZ-82 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，金壇華峰儀器有限公司；DZKW-S-6 電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；FA1004 電子分析天平，上海上平儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取0.50 g無水葡萄糖于50 mL 的容量瓶中定容，配制成1%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

準(zhǔn)確稱取3.15 g 3，5-二硝基水楊酸于燒杯中，加入600 mL 蒸餾水，在水浴鍋中45 ℃加熱，然后邊攪拌邊加入20.00 g 氫氧化鈉，攪拌至溶液澄清透明。再加入91.00 g 酒石酸鉀鈉、2.50 g 苯酚和2.50 g 亞硫酸鈉。繼續(xù)45 ℃加熱，同時再補加300 mL 蒸餾水，不斷攪拌至物質(zhì)全部溶解。冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移到容量瓶中定容至1 000 mL，配制成3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶液，將溶液儲存在棕色瓶中，室溫下避光保存，存放7 d 后可使用。

取11 支洗凈烘干的試管，按照表1 向試管中加入1%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、DNS 試劑和蒸餾水混勻后于沸水中水浴5 min，用蒸餾水定容至25 mL，于波長520 nm 處測定吸光度。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Table 1 Drawing of glucose standard curve

1.3.2 4 種外源植物蛋白對小麥淀粉體外模擬消化的影響 參考Englyst 等[17]的方法并稍作修改：準(zhǔn)確稱取0.2 g 小麥淀粉和燕麥、藜麥、黑豆、扁豆4 種蛋白于25 mL 具塞試管中，使蛋白的質(zhì)量占小麥淀粉干基的10%，20%，40%。向試管中加入0.2 mol/L pH 5.2 的醋酸鈉緩沖溶液7.5 mL，渦旋振蕩混勻后85 ℃糊化30 min，在37 ℃條件下冷卻平衡15 min，加入5 mL 已預(yù)熱15 min 的α-淀粉酶（300 U/mL）和α-葡萄糖苷酶（60 U/mL）的混酶溶液，并向每個試管中放入5 顆玻璃珠，混勻后開始振蕩反應(yīng)并準(zhǔn)確計時。分別在0，20，40，60，120，180 min 時在每個試管中吸取1 mL 的水解液，加5 mL 無水乙醇滅酶，3 500 r/min 離心10 min 后準(zhǔn)確移出1 mL 上清液，采用DNS 法測定生成的葡萄糖含量。計算公式如下：

式中，G0——水解前淀粉中的葡萄糖含量，mg；G20——淀粉水解20 min 時淀粉水解液中的葡萄糖含量，mg；G120——淀粉水解120 min 時淀粉水解液中生成的葡萄糖含量，mg；Gt表示t時刻產(chǎn)生的葡萄糖含量，mg；TS——樣品中的總淀粉含量，mg。

1.3.3 4 種外源植物蛋白對淀粉消化動力學(xué)和血糖指數(shù)的影響 根據(jù)Go?i 等[18]的方法，測定了淀粉的體外消化性，淀粉的水解曲線遵循一級動力學(xué)方程如下：

式中，Ct——淀粉消化t時刻時的葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；t——消化時間，min；C∞——淀粉水解液在終點時刻的葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；k——一級反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)，s-1。

使用Origin 擬合曲線得到C∞和k，然后計算水解曲線下的面積，公式如下：

式中，tf——反應(yīng)終止時間，min；t0——反應(yīng)起始時間，min。

根據(jù)式（6）計算樣品的水解指數(shù)（HI）和血糖指數(shù)（GI）。

式中，AUCG——樣品組淀粉反應(yīng)，AUCW——空白組反應(yīng)面積。

1.3.4 4 種外源植物蛋白對淀粉消化酶的活性抑制測定

1.3.4.1 4 種外源植物蛋白對α-淀粉酶的活性抑制測定 以小麥淀粉作為底物進(jìn)行測定，將淀粉和蛋白溶解在0.2 mol/L pH 6.8 的磷酸鹽緩沖溶液中，分別得到質(zhì)量濃度為1 g/100 mL 的淀粉溶液和1，5，10，15，20 mg/mL 的蛋白溶液，將溶解后的淀粉于85 ℃條件下糊化30 min 備用。向試管中加入250 μL 的蛋白溶液和250 μL α-淀粉酶溶液（300 U/mL），混合均勻后于37 ℃，150 r/min 的水浴恒溫振蕩器中反應(yīng)10 min，然后在每個試管中加500 μL 淀粉溶液繼續(xù)反應(yīng)10 min，加1 mL DNS 顯色劑終止反應(yīng)。之后沸水浴5 min，待冷卻至室溫后用去離子水定容至25 mL。使用紫外-可見分光光度計在波長540 nm 處測定吸光度。計算不同蛋白在不同質(zhì)量濃度下對α-淀粉酶活性的抑制作用，公式如下：

式中，A樣品——蛋白質(zhì)、底物、α-淀粉酶和DNS 顯色劑的混合物的吸光度；A樣品對照——蛋白質(zhì)底物和DNS 顯色劑的混合物的吸光度，用磷酸鹽緩沖液代替α-淀粉酶；A空白——底物、α-淀粉酶和DNS 顯色劑的混合物的吸光度，用緩沖液代替蛋白質(zhì)抑制劑；A空白對照——底物和DNS 顯色劑的混合物的吸光度。

1.3.4.2 4 種外源植物蛋白對α-葡萄糖苷酶的活性抑制測定 將α-葡萄糖苷酶（60 U/mL）和底物pNPG（15 mmol/L）溶解在0.2 mol/L pH 6.8 的磷酸鹽緩沖溶液中。同時在磷酸鹽緩沖溶液中制備質(zhì)量濃度分別為1，5，10，15，20 mg/mL 的蛋白溶液。向試管中加800 μL 蛋白溶液和400 μL 的α-葡萄糖苷酶溶液，混合均勻后于37 ℃，150 r/min的水浴恒溫振蕩器反應(yīng)10 min，再向每個試管中加200 μL pNPG 溶液繼續(xù)反應(yīng)，30 min 后加5 mL 0.2 mol/L 的Na2CO3終止反應(yīng)，并在波長405 nm 處測定吸光度。計算蛋白質(zhì)對α-葡萄糖苷酶的活性抑制效果，公式如下：

式中，A樣品——蛋白質(zhì)、底物、α-葡萄糖苷酶和DNS 顯色劑的混合物的吸光度；A樣品對照——蛋白質(zhì)、底物和DNS 顯色劑的混合物的吸光度，用磷酸鹽緩沖液代替α-葡萄糖苷酶；A空白——底物、α-葡萄糖苷酶和DNS 顯色劑的混合物的吸光度，用緩沖液代替蛋白質(zhì)抑制劑；A空白對照——底物和DNS 顯色劑的混合物的吸光度。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)處理使用SPSS 25 和Microsoft Excel 2016 軟件完成，繪圖使用Origin 2017 軟件完成，其中水解動力學(xué)模型擬合使用Origin 2017 軟件非線性擬合BoxLucas1 函數(shù)進(jìn)行擬合，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n= 3），P<0.05 表示為顯著差異，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 為所得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=0.5897X-0.0178，R2=0.9983。式中X表示葡萄糖含量，Y表示吸光度，曲線擬合良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.2 4 種外源植物蛋白對小麥淀粉體外模擬消化的影響分析

圖2 是添加4 種外源植物蛋白后小麥淀粉的水解率。從淀粉的水解曲線可以看出淀粉在前20 min 內(nèi)的水解速率迅速上升，20 min 以后水解速率緩慢上升，在120 min 以后趨于平衡。4 種外源植物蛋白的加入均可以降低小麥淀粉各階段的消化率，且隨著蛋白添加量的增加，淀粉的水解速率逐漸減小。其中燕麥蛋白和藜麥蛋白對小麥淀粉水解率的影響較為顯著。蛋白能降低淀粉消化率可能是因為蛋白能在淀粉周圍形成物理屏障阻礙淀粉與淀粉酶的接觸，也可能是由于外源蛋白能進(jìn)一步與淀粉顆粒相互作用限制了淀粉的糊化，進(jìn)而影響了淀粉在后續(xù)消化過程中的水解率。此外，蛋白質(zhì)在加熱過程中變性會導(dǎo)致內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露，淀粉的中存在大量羥基能與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸、組氨酸）殘基發(fā)生離子相互作用影響淀粉的消化[19]。燕麥蛋白中含有大量的精氨酸，這也可能是燕麥蛋白比其它幾種蛋白作用效果更強的主要原因。

圖2 淀粉水解率Fig.2 Starch hydrolysis rate

圖3 顯示了燕麥蛋白、藜麥蛋白、黑豆蛋白和扁豆蛋白4 種外源植物蛋白與小麥淀粉混合物體外消化后3 種類型淀粉含量的變化。4 種外源植物蛋白均能對RDS、SDS 和RS 的含量產(chǎn)生顯著性影響，但影響效果有所不同。4 種外源植物蛋白都降低了RDS 的含量，隨著蛋白添加量的增加RDS含量顯著下降，其中燕麥蛋白和藜麥蛋白對RDS的影響較大，當(dāng)添加量達(dá)到40%時，分別將RDS的含量從（52.50±0.22）%降至（27.32±1.94）%和（30.22±0.11）%。隨著4 種外源植物蛋白的添加，SDS 含量增加，其中燕麥蛋白對其影響最為顯著。當(dāng)燕麥蛋白添加量為40%時，可將SDS 含量從（11.83±0.54）%增加到（35.33±1.62）%。此外，4 種外源植物蛋白能增加RS 的含量，但與添加量不成正比，其中黑豆蛋白對RS 含量的影響最大，當(dāng)黑豆蛋白添加量為40%時，RS 的含量從（35.67±0.32）%增加到（43.61±1.19）%。

圖3 4 種外源植物蛋白與小麥淀粉混合物體外消化Fig.3 In vitro digestion of mixture of four exogenous plant proteins and wheat starch

淀粉的消化與許多因素有關(guān)，Lu 等[20]的研究表明：蛋白質(zhì)與淀粉混合后，能夠在淀粉周圍形成一種連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，阻礙淀粉的快速消化，也會抑制淀粉顆粒在糊化過程中的吸水膨脹，導(dǎo)致顆粒中殘存的有序結(jié)構(gòu)影響淀粉酶的酶解，從而使RDS 含量減少，RS 含量增加。本研究中4 種外源植物蛋白的加入使得RDS 降低，RS 含量的增加的試驗結(jié)果與此文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致，可能是因為蛋白在淀粉外形成了致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)包裹淀粉。另外，在淀粉糊化過程中，淀粉的顆粒被破壞會導(dǎo)致直鏈淀粉的析出。蛋白可能與析出的直鏈淀粉發(fā)生了相互作用，形成了蛋白質(zhì)-直鏈淀粉復(fù)合物，其中還有一些穩(wěn)定性較弱的直鏈淀粉-直鏈淀粉復(fù)合物，這些復(fù)合物會導(dǎo)致SDS 含量的增加。

2.3 4 種外源植物蛋白對淀粉消化動力學(xué)和血糖指數(shù)的影響分析

表2 是4 種外源植物蛋白在不同水平下對小麥淀粉模擬動力學(xué)參數(shù)的影響。一般情況下血糖指數(shù)（GI）是根據(jù)白面包（GI=100）在體外消化作為參考依據(jù)來定義和分類的。在本研究，為了準(zhǔn)確反映添加的4 種外源植物蛋白對小麥淀粉消化的影響，將純小麥淀粉的HI 值作為100 來計算血糖指數(shù)。由表2 可以看出，添加外源植物蛋白后k值呈下降趨勢。k值被用來表示淀粉的水解敏感程度，k值高說明淀粉容易消化。隨外4 種外源植物蛋白添加，k值和預(yù)測血糖值（pGI）均減小，且隨添加量的增加呈規(guī)律性下降。當(dāng)燕麥蛋白和黑豆蛋白添加量為40%時，分別將預(yù)測血糖值降低至84.98 和84.62，說明外源植物蛋白能夠與小麥淀粉發(fā)生相互作用降低小麥淀粉的水解敏感性。

表2 不同蛋白水解模型參數(shù)及血糖指數(shù)Table 2 Different proteins hydrolysis model parameters and glycemic index

2.4 4 種外源植物蛋白對淀粉消化酶的活性抑制測定

2.4.1 4 種外源植物蛋白對α-淀粉酶活性的抑制測定 4 種外源植物蛋白對α-淀粉酶抑制作用曲線如圖4所示。4 種外源植物蛋白中燕麥蛋白、藜麥蛋白和黑豆蛋白均能抑制α-淀粉酶的活性，而扁豆蛋白對α-淀粉酶的活性沒有影響（圖4 未顯示）。隨著燕麥蛋白、藜麥蛋白和黑豆蛋白3 種蛋白添加量的增加，抑制作用逐漸增強。其中，黑豆蛋白的抑制效果優(yōu)于燕麥蛋白和藜麥蛋白。當(dāng)添加量增加到一定量時，燕麥蛋白和藜麥蛋白對其抑制作用不再隨質(zhì)量濃度的增加而明顯增強，而黑豆蛋白對α-淀粉酶的抑制作用卻在隨質(zhì)量濃度的增大一直增強。陳旭[9]指出蛋白能夠通過與α-淀粉酶結(jié)合或與淀粉和α-淀粉酶形成的中間產(chǎn)物結(jié)合來抑制α-淀粉酶活性，且結(jié)合強度與蛋白質(zhì)的來源和溶解性密切相關(guān)。這可能也是這4種外源植物蛋白對α-淀粉酶的抑制效果有所差異的原因。扁豆蛋白的溶解度比較好，加熱后能在溶液中均勻分散無法與酶結(jié)合，而黑豆蛋白的溶解性較差，能隨著加熱變性在溶液中形成密集的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此對α-淀粉酶的抑制效果最強。

圖4 4 種外源植物蛋白對α-淀粉酶的活性抑制作用曲線Fig.4 Four exogenous plant protein inhibition curve of α-amylase activity

2.4.2 4 種外源植物蛋白對α-葡萄糖苷酶活性的抑制測定 4 種外源植物蛋白對α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用見圖5。4 種外源植物蛋白中扁豆蛋白和黑豆蛋白對α-葡萄糖苷酶的活性有顯著抑制作用，燕麥蛋白和藜麥蛋白對α-葡萄糖苷酶活性沒有影響（未在圖5 中顯示）。從圖中可以看出黑豆蛋白和扁豆蛋白在不同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均對α-葡萄糖苷酶有抑制作用，且隨質(zhì)量濃度增加抑制作用增強。此外，在質(zhì)量濃度達(dá)到15 mg/mL 后抑制效果不再明顯增強。Yu 等[21]研究表明大麥醇溶蛋白和谷蛋白在消化過程中可以與酶結(jié)合。因此，黑豆蛋白和扁豆蛋白很可能在某種程度上與酶發(fā)生非催化結(jié)合，或者覆蓋了α-葡萄糖苷酶對淀粉的作用位點導(dǎo)致了酶的催化活性降低。

圖5 4 種外源植物蛋白對α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用曲線Fig.5 Four exogenous plant protein inhibition curve of α-glucosidase activity

蛋白質(zhì)與小麥淀粉的體外消化試驗結(jié)果表明，蛋白質(zhì)能降低小麥淀粉的消化是蛋白質(zhì)與淀粉相互作用和蛋白質(zhì)與淀粉消化酶共同作用的結(jié)果。蛋白質(zhì)不僅能與淀粉發(fā)生相互作用阻礙淀粉被消化，而且能與淀粉消化酶結(jié)合減低酶的活性來降低淀粉的消化，這對糖尿病患者穩(wěn)定血糖很有幫助。

3 結(jié)論

通過燕麥蛋白、藜麥蛋白、黑豆蛋白和扁豆蛋白4 種外源植物蛋白對小麥淀粉的體外消化及對兩種淀粉消化酶的活性抑制作用兩方面的研究，得到結(jié)論如下：4 種外源植物蛋白的加入均能減緩小麥淀粉的水解速率，導(dǎo)致RDS 含量減少，SDS和RS 含量增加，降低了小麥淀粉的預(yù)測血糖值，其中添加40%燕麥蛋白能將RDS 含量從（52.50±0.22）%降至（27.32±1.94）%，SDS 含量從（11.83±0.54）%增加到（35.33±1.62）%。4 種外源植物蛋白中燕麥蛋白、藜麥蛋白和黑豆蛋白對α-淀粉酶的活性具有較強的抑制作用，而扁豆蛋白對α-淀粉酶的活性沒有影響，其中，黑豆蛋白對α-淀粉酶的抑制效果最好，當(dāng)黑豆蛋白質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時抑制率達(dá)到了（23.24±0.21）%。4 種外源植物蛋白中黑豆蛋白和扁豆蛋白對α-葡萄糖苷酶的活性具有較好的抑制效果，而燕麥蛋白和藜麥蛋白對其活性沒有影響，其中扁豆蛋白對α-葡萄糖苷酶的抑制作用強于黑豆蛋白，蛋白質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時抑制率分別為（21.32±0.80）%和（8.49±0.40）%。