孫廣玲，劉俊麗，吳 迪，劉雨新，姜 嬌，2，3，宋育陽，2，3*

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院 陜西楊凌 712100 2 西北農(nóng)林科技大學(xué)合陽葡萄試驗(yàn)示范站 陜西合陽 715300 3 西北農(nóng)林科技大學(xué)寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗(yàn)示范站 寧夏永寧 750104）

羧酸是糖酵解和三羧酸循環(huán)等中央代謝途徑的中間體，在所有細(xì)胞的代謝中起著關(guān)鍵作用。酵母羧酸代謝的研究在食品以及制藥和生物醫(yī)學(xué)等行業(yè)均非常重要[1-2]，其中關(guān)于羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的探究更是酵母羧酸代謝研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

酵母羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白雖有很長的研究歷史，但主要集中于一元酸和二元酸的轉(zhuǎn)運(yùn)方面，關(guān)于三羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體方面的研究目前仍相對欠缺。首個(gè)乳酸攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）[3]和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[4]中被發(fā)現(xiàn)，相關(guān)基因被命名為JEN1[5]，經(jīng)綠色熒光蛋白定位，發(fā)現(xiàn)其在酵母細(xì)胞膜上發(fā)揮功能且受葡萄糖抑制[6]，且轉(zhuǎn)錄因子Sok2p 也參與其調(diào)控[7]。其次從乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）中鑒定出兩個(gè)JEN1同源物，一個(gè)編碼單羧酸乳酸和丙酮酸的單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（KlJEN1），另一個(gè)編碼二元羧酸蘋果酸和琥珀酸的二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（KlJEN1）[8-9]，在白色念珠菌（Candida albicans）中也存在類似的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[10]。這些JEN1同源物的系統(tǒng)發(fā)育分析表明羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在兩個(gè)功能簇，分別包含功能特征的單羧酸和二羧酸兩種功能的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[1-2]。近幾年，發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）編碼的6 個(gè)JEN家族基因序列與單羧酸、二羧酸和三羧酸（乳酸、丙酮酸、富馬酸、蘋果酸、琥珀酸和檸檬酸）的轉(zhuǎn)運(yùn)均有關(guān)系[11]。畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）存在兩種PkJEN 蛋白均具有轉(zhuǎn)運(yùn)二元羧酸的功能，可有效將琥珀酸、富馬酸和L-蘋果酸等羧酸導(dǎo)入細(xì)胞[12]。另外，在1986年Osothsilp 等[13]于粟酒裂殖酵母中第一次發(fā)現(xiàn)酵母中存在蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。酵母中羧酸滲透酶基因命名為MAE1[14]。解脂耶氏酵母（Y.lipolytica）的Gpr1（TC 2.A.96.1.2）是第一個(gè)在酵母中鑒定的AceTr家族成員[15]，研究顯示與乙酸敏感性、細(xì)胞和菌落形態(tài)、細(xì)胞壽命有關(guān)[16]，轉(zhuǎn)錄受葡萄糖抑制，通過熒光顯微鏡定位在質(zhì)膜上[17]。然而，酵母中關(guān)于檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究較少，Cássio 等[18-19]在1991年首次在產(chǎn)朊假絲酵母中發(fā)現(xiàn)檸檬酸的高親和力和低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。雖并未對其進(jìn)行基因定位，但研究證明轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)受到葡萄糖抑制。解脂耶氏酵母中同樣發(fā)現(xiàn)了可將檸檬酸轉(zhuǎn)進(jìn)胞內(nèi)的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[11]。近期，在畢赤酵母中發(fā)現(xiàn)PJEN2-2 蛋白的392WCVQGGLGVVPS 403 片段具有明顯的檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性[12]。以上的研究結(jié)果均表明非釀酒酵母中羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依舊存在巨大的探索空間。

東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）是一種非釀酒酵母，可以在高酸條件下生長，并被用于生產(chǎn)各種有機(jī)酸[20-22]，并且以東方伊薩酵母為基礎(chǔ)模型研究遺傳工具箱等研究也有了一定的進(jìn)展。前期篩選獲得的東方伊薩酵母具有良好降酸能力[23]，可應(yīng)用于獼猴桃、柑橘、山楂等高酸果酒的釀造?；卺劸莆⑸锏纳锝邓岱椒?，因其具有對酒質(zhì)負(fù)面影響小、成本低、操作簡單等特點(diǎn)，受到果酒釀造行業(yè)的高度關(guān)注，是現(xiàn)代果酒綠色釀造的重要發(fā)展方向。如今，生物信息學(xué)已經(jīng)成為動植物[25]、真菌[26]以及人類[27-28]乃至于細(xì)菌和病毒[29]等分子機(jī)制研究的熱點(diǎn)分析工具。本文利用生物信息學(xué)技術(shù)手段對東方伊薩酵母羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行探索，并運(yùn)用基因工程手段于去除內(nèi)源性羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的釀酒酵母中進(jìn)行驗(yàn)證與鑒定。本試驗(yàn)結(jié)果對羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，對解析非釀酒酵母及其降酸機(jī)理具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及引物 本研究所用到引物序列如表1所示，已經(jīng)構(gòu)建成功的重組酵母及攜帶的質(zhì)粒信息如表2所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the study

（續(xù)表1）

表2 本研究構(gòu)建的質(zhì)粒及重組酵母菌株Table 2 Plasmids and recombinant yeast strains constructed in this study

（續(xù)表2）

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 葡萄糖，廣東光華科技股份有限公司；胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸粉，奧博星生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、乳酸，四川西隴科學(xué)有限公司；無氨基酵母氮源（YNB）、瓊脂、蘋果酸，Solarbio 公司；檸檬酸，Aladdin 公司；潮霉素抗生素、G418 抗生素、氨芐青霉素溶液，上海源葉生物科技有限公司；尿嘧啶（URA），TAKARA 公司。

YPD 培養(yǎng)基配制方法如下：20 g/L 葡萄糖、20 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母浸粉；YPL 培養(yǎng)基配制方法如下：10 g/L 乳酸、20 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母浸粉；YPM 培養(yǎng)基配制方法如下：10 g/L 蘋果酸、20 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母浸粉；YPC 培養(yǎng)基配制方法如下：10 g/L 檸檬酸、20 g/L 蛋白胨、10 g/L 酵母浸粉；LB 培養(yǎng)基配制方法如下：10 g/L 氯化鈉、10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母浸粉，加入去離子水配置液體LB 培養(yǎng)基，20 g/L 瓊脂配置固體LB 培養(yǎng)基；LB-AMP 培養(yǎng)基配制方法如下：在LB 培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加體積分?jǐn)?shù)為1‰氨芐青霉素溶液；SD-URA培養(yǎng)基配制方法如下：20 g/L 的葡萄糖、1.7 g/L 的YNB、0.77 g/L 的URA，pH 值調(diào)至6.8，加入20 g/L瓊脂配置固體SD-URA 培養(yǎng)基。YPD-G418 培養(yǎng)基：以YPD 為基礎(chǔ)，每毫升添加1 μL 質(zhì)量濃度為200 mg/mL 的G418 抗生素；YPD-Hyg 培養(yǎng)基：以YPD 為基礎(chǔ)，每毫升添加3 μL 質(zhì)量濃度為100 mg/mL 的潮霉素抗生素。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-10C 型電泳儀，北京市六一儀器廠；C1000 型PCR 儀，BioRAD 公司；LC-10ATVP 型液相色譜儀，日本島津公司；Lecia TCS SP 8 型生物激光共聚焦顯微鏡，德國萊卡公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學(xué)挖掘與分析

1.3.1.1 NCBI 比對 通過NCBI 網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），檢索解脂耶氏酵母編碼具有轉(zhuǎn)運(yùn)不同羧酸功能的質(zhì)膜羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因片段。對東方伊薩酵母膜基因組BLAST 比對，篩選東方伊薩酵母候選編碼細(xì)胞膜羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因[30]。

1.3.1.2 跨膜螺旋預(yù)測 通過TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測候選羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因跨膜螺旋結(jié)構(gòu)[31]。

1.3.1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 系統(tǒng)發(fā)育樹是生物信息學(xué)中尋找物種間進(jìn)化關(guān)系的重要方法。通過MEGA 7.0 軟件制作[32-33]候選羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 候選片段質(zhì)粒重構(gòu) 將質(zhì)粒pY26 進(jìn)行雙酶切，以pYES2-eGFP為模板，通過同源臂引物PY-eGFP-F、PY-eGFP-R；EcoRⅠ-eGFP-F、eGFP-R 擴(kuò)增不同同源臂eGFP基因；以東方伊薩酵母GS1-1基因組為模板，使用帶有同源臂的引物PM1-f 和PM1-r、PM2-f 和PM2-r、PM3-f 和PM3-r、PM4-f 和PM4-r、PM5-f 和PM5-r 分別擴(kuò)增候選羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼片段M1、M2、M3、M4、M5 的DNA 序列，并以東方伊薩酵母GS1-1基因組為模板，使用同源臂引物L(fēng)-eM1-F 和e-M1-R、GS linker-M2-F 和e-M2-R、GS linker-M3-F 和e-M3-R、GS linker-M4-F 和e-M4-R、GS linker-M5-F 和e-M5-R 分別擴(kuò)增GS linker-M1、GS linker-M2、GS linker-M3、GS linker-M4、GS linker-M5 的DNA 序列。將帶有同源臂的eGFP 分別與GS linker-M1、GS linker-M2、GS linker-M3、GS linker-M4、GS linker-M5 DNA 序列通過Overlap 體系進(jìn)行連接，形成帶有同源臂的eGFPGS linker -M1、eGFP-GS linker -M2、eGFP-GS linker-M3、eGFP-GS linker-M4、eGFP-GS linker-M5 DNA 序列。將帶有同源臂的eGFP序列、候選羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（M1、M2、M3、M4、M5）、綠色熒光蛋白片段與候選檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白連接片段（eGFPGS linker -M1、eGFP-GS linker -M2、eGFP-GS linker-M3、eGFP-GS linker-M4、eGFP-GS linker-M5）的DNA 序列及線性化質(zhì)粒骨架同源重組連接，構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α 后，通過LB-Amp 培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，菌落PCR 驗(yàn)證后，活化陽性菌株提取的質(zhì)粒后進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.3 雙缺失菌株的構(gòu)建 為去除單倍體釀酒酵母BY4741 中JEN1和ADY2負(fù)責(zé)羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)的基因，使用Cre-LoxP 系統(tǒng)敲除。通過引物JLKL-F、JLKL-R 和引物ALHL-F、ALHL-R 分別從質(zhì)粒pUG6 和pUG6SH 擴(kuò)增構(gòu)建帶有JEN1基因兩側(cè)同源臂的loxP-KanMX-loxP 和帶有ADY2基因兩側(cè)同源臂的loxP-HphMX-loxP。ScJEN1的兩端同源臂由釀酒酵母基因組DNA 擴(kuò)增，隨后在loxPKanMX-loxP 模塊的兩側(cè)連接以生成JEN1基因敲除框。從釀酒酵母基因組DNA 擴(kuò)增的ScADY2片段與loxP-HphMX-loxP 模塊連接以生成ADY2基因敲除框，雙缺失菌株構(gòu)建流程如圖1所示。

圖1 雙缺失菌株構(gòu)建流程圖Fig.1 Flow chart for the construction of double deletion strains

通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[34]，根據(jù)圖2 分別進(jìn)行ADY2、JEN1基因的敲除并驗(yàn)證。破壞ADY2基因，使用帶有潮霉素（Hyg）標(biāo)記基因的BY4741，隨機(jī)挑取在YPD-Hyg 平板上生長的單菌落，提取基因組DNA，以基因組DNA 為模板，用引物對QADY2 -F 和 QADY2 -R、ADY2HpHMX -F 和ADY2HpHMX-R、ADY2QY-F 和ADY2QY-R 對單敲除菌株進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。通過YPD-Hyg 培養(yǎng)基篩選成功敲除的陽性菌株，下文稱為B△A。通過上述方法破壞B△A 中的JEN1基因，使帶有G418 標(biāo)記基因，隨機(jī)挑取在YPD-G418 平板上生長的單菌落，提取基因組DNA，以基因組DNA 為模板，用引物對QJEN1-F 和QJEN1-R、JEN1Kan-MX-F 和JEN1KanMX-R、JEN1QY-F 和JEN1QYR 對雙敲除候選菌株進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。通過YPDHyg-G418 培養(yǎng)基篩選成功敲除的陽性菌株稱為B△A△J。

圖2 缺陷型菌株敲除原理及驗(yàn)證流程圖Fig.2 Defective strain knockout principle and verification flow chart

1.3.4 重構(gòu)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 經(jīng)過PCR 驗(yàn)證成功的大腸桿菌單菌落，使用LB-AMP 液體培養(yǎng)基增殖擴(kuò)培并進(jìn)行質(zhì)粒提取。采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[34]，將已連接成功的重組質(zhì)粒pY26-ZL1、pY26-ZL2、pY26 -ZL3、pY26 -ZL4、pY26 -ZL5、pY26 -eGFP、pY26-eGFP-ZL1、pY26-eGFP-ZL2、pY26-eGFPZL3、pY26-eGFP-ZL4、pY26-eGFP-ZL5 分別轉(zhuǎn)入BY4741 及雙敲除菌株B△A△J 后涂布至SD-URA、SD-URA-G418-Hyg 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿在30 ℃下孵育2～3 d，挑取單菌落活化，提取酵母內(nèi)質(zhì)粒進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。

1.3.5 綠色熒光蛋白定位 使用激光共聚焦顯微鏡觀察酵母內(nèi)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒展示效果。用50 mL 的SD-URA-G418-Hyg 液體培養(yǎng)基于30 ℃培養(yǎng)重組酵母48 h 后，取5 μL 菌液制片[35]。

1.3.6 表型驗(yàn)證 相應(yīng)培養(yǎng)基活化酵母單菌落，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以1×107CFU/mL 接種量分別接種至YPD、YPL、YPM、YPC 液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)120 h。

1.3.7 有機(jī)酸含量的測定 采用高效液相色譜法測定發(fā)酵過程中及發(fā)酵結(jié)束后有機(jī)酸含量[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的確定及生物信息學(xué)分析

已有研究表明[11]，解脂耶氏酵母中存在6 個(gè)編碼質(zhì)膜羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因片段，將東方伊薩酵母質(zhì)膜基因組與該6 個(gè)基因片段進(jìn)行比對，獲得5 個(gè)高分匹配片段，具體見表3。

表3 東方伊薩酵母候選質(zhì)膜檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Table 3 I.orientalis suspected plasma membrane citrate transporter

由表4 可知候選羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的長度，5 條候選羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均含有10 條跨膜螺旋數(shù)，根據(jù)跨膜螺旋預(yù)期的氨基酸數(shù)，預(yù)測為跨膜蛋白，通過蛋白質(zhì)的前60 個(gè)氨基酸中跨膜螺旋的預(yù)期氨基酸數(shù)目，判斷候選羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膜上的概率均大于96%，綜上所述，篩選得到的5 條候選羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在位于質(zhì)膜的跨膜螺旋。

表4 跨膜螺旋預(yù)測結(jié)果數(shù)據(jù)表Table 4 Data table of prediction results of transmembrane spiral

對所篩選5 組基因繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹如圖3所示。圖中起始節(jié)點(diǎn)代表共同祖先，分支的節(jié)點(diǎn)代表假定祖先，分支長度反應(yīng)互相之間的同源關(guān)系，數(shù)值代表該節(jié)點(diǎn)下樹結(jié)構(gòu)的置信程度。由于多篇文獻(xiàn)[2，11-12]對非釀酒酵母質(zhì)膜羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究均始于膜蛋白組與釀酒酵母SCJEN1序列的比對，故構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹是非常必要的。進(jìn)化樹除了反映5 個(gè)片段與釀酒酵母SCJEN1具有高度同源性以外，還可以看到2、4 片段相近，其次與5 號片段次接近，而與1、3 片段較近；這代表它們很可能執(zhí)行不同功能，比如一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)二羧酸一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)三羧酸。5 組片段都與乳酸克魯維酵母的KLJEN2有極高的的同源性，提示本試驗(yàn)所篩選片段很可能執(zhí)行二、三羧酸質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能，說明質(zhì)膜羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多樣化很可能是非釀酒酵母代謝功能多樣化的一個(gè)基礎(chǔ)。

圖3 基于部分已驗(yàn)證為羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白片段的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on partially verified fragments of carboxylic acid transporters

2.2 PCR 擴(kuò)增及質(zhì)粒重構(gòu)結(jié)果

目標(biāo)片段PCR 反應(yīng)體系反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳驗(yàn)證，擴(kuò)增片段特異性初步鑒定良好。菌落PCR 凝膠電泳電泳結(jié)果良好。在生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行的測序結(jié)果正確。

2.3 羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白重組菌的獲得

為驗(yàn)證單敲除、雙敲除菌株構(gòu)建結(jié)果，根據(jù)圖1、2 敲除原理及驗(yàn)證方式，進(jìn)行敲除框擴(kuò)增驗(yàn)證，電泳條帶JEN1LKL PCR 和ADY2LHL PCR 分別為1 839 bp，1 921 bp，電泳條帶長度正確，說明正確構(gòu)建BΔA 工程菌；由于電泳驗(yàn)證條帶長度正確，表明BΔAΔJ 雙敲除菌株構(gòu)建成功。根據(jù)驗(yàn)證成功獲得雙敲除缺陷型菌株。

通過驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化菌株，電泳條帶長度正確，為正確陽性轉(zhuǎn)化菌株，為后續(xù)表型驗(yàn)證提供基礎(chǔ)材料。

2.4 利用激光共聚焦顯微鏡羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的定位

為了進(jìn)一步探究成功轉(zhuǎn)化的羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的定位，在激光共聚焦顯微鏡下觀察重組酵母中綠色熒光蛋白所在的位置。如圖4所示，對照組中的B-PY26、BΔAΔJ-PY26 沒有觀察到綠色熒光；BPY26-eGFP、BΔAΔJ-PY26-eGFP表達(dá)的綠色熒光蛋白滯留在細(xì)胞質(zhì)中；試驗(yàn)組重組酵母BeGFP-ZL1、B-eGFP-ZL4、B-eGFP-ZL5、BΔAΔJeGFP-ZL1、BΔAΔJ-eGFP-ZL4、BΔAΔJ-eGFP-ZL5綠色熒光蛋白定位于細(xì)胞膜。本研究結(jié)果與以往羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用熒光顯微鏡定位結(jié)果相一致[6-7，17]。

圖4 GFP 在重組酵母中的定位Fig.4 Localization of GFP in recombinant yeasts

2.5 表型及特異性驗(yàn)證

為了確定候選羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能及轉(zhuǎn)運(yùn)特異性，不同碳源條件下培養(yǎng)重組菌株，在吸光值為600 nm 下測定的菌體細(xì)胞密度，菌株生長量如圖5所示。在以葡萄糖為唯一碳源的條件下酵母菌株生長狀態(tài)良好，東方伊薩酵母GS1-1 在葡萄糖為唯一碳源條件下菌體細(xì)胞密度約是以羧酸為唯一碳源時(shí)菌株量的3 倍，說明在不同羧酸條件下，菌體細(xì)胞密度均受到羧酸不同程度的抑制。陰性對照BY4741、陰性對照BAJ 在羧酸為唯一碳源條件時(shí)幾乎無法正常生長，表明該菌株內(nèi)不存在相應(yīng)羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，或存在相應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白但缺少代謝途徑中重要的調(diào)控因子。

圖5 不同碳源條件下菌株生長量Fig.5 Growth of strains under different carbon sources

相同碳源條件下，不同菌株生長量如下表5可知，葡萄糖為碳源，菌株生長量無顯著性差異，說明插入候選片段對各菌株在基本培養(yǎng)基條件下生長無影響且生長狀態(tài)良好；乳酸條件下，陽性對照菌株GS1-1 與其它菌株存在顯著性差異，陰性對照與工程菌無顯著性差異，說明候選片段與乳酸的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝無關(guān)；蘋果酸條件下，BZL4 與陽性對照菌株GS1-1 無顯著性差異且與BY4741 存在顯著性差異，BAJZL5 與陽性對照菌株GS1-1 無顯著性差異且與BAJ 存在顯著性差異，表明候選片段4、5 與蘋果酸的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝相關(guān)；檸檬酸條件下，陽性對照菌株GS1-1 與其它菌株存在顯著性差異，BZL3 菌株與陰性對照BY4741 菌株呈現(xiàn)顯著性差異，且與陽性對照GS1-1 也存在顯著性差異。BAJZL1 菌株與陰性對照BAJ 菌株呈現(xiàn)顯著性差異，且與陽性對照GS1-1 也存在顯著性差異，表明候選片段1、3 與檸檬酸的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝相關(guān)。

表5 相同碳源條件下菌株生長量及其單因素分析Table 5 Strain growth and its single factor analysis under the same carbon source condition

不同羧酸條件下菌株羧酸含量及降酸率分析結(jié)果見表6。不同菌株在羧酸培養(yǎng)基中，降酸羧酸含量呈現(xiàn)差異顯著。蘋果酸條件下，BAJZL3、BAJZL4 和BAJZL5 與陰性對照BAJ 存在顯著性差異，且上述3 株工程菌株降酸率均為40%以上；檸檬酸條件下，BAJZL1 與陰性對照BAJ 檸檬酸含量存在顯著性差異，且上述工程菌株檸檬酸含量與陽性對照GS1-1 存在顯著性差異。綜上，根據(jù)相同碳源不同菌株菌株生長量（OD600nm）的顯著性分析以及結(jié)合相同碳源羧酸含量顯著性數(shù)據(jù)分析可知，目的片段4 為蘋果酸羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；目的片段1 是檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

表6 不同菌株在不同碳源條件下降酸效果Table 6 The acid reduction effect of different strains under different carbon source conditions

為探究菌株生長量（OD600nm）及菌株降酸率是否存在關(guān)聯(lián)性，根據(jù)雙變量Pearson 檢驗(yàn)相關(guān)性數(shù)據(jù)分析可知，二者呈現(xiàn)大致相同的變化趨勢，二者呈極顯著（r=0.528**，P<0.01）即菌株生長狀況越好，其降酸能力越強(qiáng)。因此，在發(fā)酵結(jié)果驗(yàn)證中，可通過觀察菌株生長狀況來大致確定菌株的降酸能力。

3 結(jié)論

生物信息學(xué)技術(shù)手段可有效挖掘東方伊薩酵母潛在的羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，且分析數(shù)據(jù)可靠，對于挖掘鑒定潛在片段具有一定參考意義。本試驗(yàn)在雙敲除羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的釀酒酵母中進(jìn)行東方伊薩酵母候選羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的驗(yàn)證，根據(jù)綠色熒光蛋白定位，發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮功能區(qū)域?yàn)榧?xì)胞膜上，符合先前對于羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在酵母體內(nèi)的定位分析。確定候選片段4 為蘋果酸羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；候選片段1是檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本文成功利用生物信息學(xué)手段，挖掘并鑒定到東方伊薩酵母潛在的二、三羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白片段，拓展了酵母羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，進(jìn)一步解析了東方伊薩酵母的降酸機(jī)制，為探索非釀酒酵母的降酸機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。