楊馥瑞,吳夢希,劉軍山
(大連理工大學遼寧省微納米技術(shù)及系統(tǒng)重點實驗室,遼寧大連 116024)
病原體嚴重威脅人類生命健康和社會經(jīng)濟發(fā)展[1]。病原體的檢測方法包括核酸檢測、抗原抗體檢測、分離培養(yǎng)等。其中,核酸檢測具有高靈敏度和高特異性等優(yōu)點,已成為病原體檢測的金標準。基于常規(guī)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的核酸檢測需要在3 個不同溫度之間進行幾十次的擴增循環(huán),操作復雜、耗時長。因此,研究人員開發(fā)了多種基于等溫擴增的核酸檢測技術(shù),例如環(huán)介導等溫擴增(LAMP)[2-3],在恒定溫度下較短時間內(nèi)便可以完成核酸檢測過程。
現(xiàn)場即時檢測(Point-of-care Testing, POCT)與傳統(tǒng)的病原學檢測方法相比,具有操作簡單、快速等特點[4],在疫情防控等領(lǐng)域極具應(yīng)用潛力。微流控芯片具有微型化、集成化和便攜化等特點,特別適合用于核酸的即時檢測。然而,目前大多數(shù)基于微流控芯片的核酸檢測系統(tǒng)需要復雜昂貴的檢測設(shè)備和液體驅(qū)動設(shè)備等[5-7]。例如,2010 年,德國弗賴堡大學的Lutz 等[8]研制的微流控檢測系統(tǒng)需要離心設(shè)備進行芯片上的液體驅(qū)動。2021 年,北京航空航天大學研制了一種全集成微流控芯片,利用指壓便可以實現(xiàn)芯片上的液體驅(qū)動,借助紫外燈可以用肉眼讀出檢測結(jié)果,實現(xiàn)了結(jié)核桿菌的現(xiàn)場即時檢測[9]。但是,為了實現(xiàn)多靶標檢測,該芯片需要利用復雜的閥結(jié)構(gòu)實現(xiàn)擴增反應(yīng)池間的物理隔離。2009年,美國芝加哥大學的Du等[10]提出了一種滑動式結(jié)構(gòu)的微流控芯片,在芯片的基片上制作出微溝道,在芯片的滑動片上制作出液體腔室,利用兩片之間的相對滑動,便可以實現(xiàn)不同液體腔室間的連通或者隔離。之后,又有多位學者對滑動式結(jié)構(gòu)的微流控芯片進行了相關(guān)研究。例如,2011 年,美國芝加哥大學的Shen 等[11]研制了一種只有硬幣大小的旋轉(zhuǎn)式滑動芯片,可以連續(xù)生成納升級液滴,用于定量檢測HIV和HCV病毒。
為此,本文針對核酸現(xiàn)場即時檢測的需求設(shè)計了一種基于LAMP 技術(shù)的全集成微流控芯片,能夠完成核酸的提取和擴增功能,利用一次性注射器進行芯片上的液體驅(qū)動,借助紫外線驗鈔筆便可用肉眼直接讀出核酸檢測結(jié)果。而且,在芯片的擴增區(qū)域采用了滑動式芯片結(jié)構(gòu),實現(xiàn)了16個擴增反應(yīng)池之間的物理隔離,因此該芯片可用于多靶標檢測。
圖1(a)為本文設(shè)計的全集成微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖,在芯片的基片上制作了微通道和試劑池等結(jié)構(gòu)。根據(jù)功能,將芯片分為3 個區(qū)域:核酸提取區(qū)、混合區(qū)和擴增區(qū),如圖1(b)所示。
圖1 全集成微流控芯片
(1)核酸提取區(qū)。為了實現(xiàn)便攜化操作,選擇了磁珠法進行核酸的提取,為此該區(qū)域設(shè)計了4 個試劑池:磁珠池、裂解池、清洗池1和清洗池2。磁珠法的基本原理為:磁性納米顆??梢耘c核酸分子特異性結(jié)合,利用磁場操控磁性顆粒運動,便可以在不同區(qū)域分別實現(xiàn)裂解、清洗等核酸提取步驟。
(2)混合區(qū)。該區(qū)域設(shè)計了1個洗脫池、1個擴增試劑池和1 個方波混合器,主要用于實現(xiàn)核酸的洗脫以及與擴增試劑的充分混合。為了便于操作和縮短檢測時間,選擇了LAMP 擴增法,因此在擴增試劑池里存放LAMP Mix試劑。
(3)擴增區(qū)。為了實現(xiàn)多靶標核酸檢測,在該區(qū)域采用了滑動式芯片結(jié)構(gòu)。在基片上設(shè)計了用于液體流動的微溝道,在滑動蓋片上設(shè)計了16 個擴增反應(yīng)池,利用低熔點石蠟(48~50 ℃)將擴增引物預先包埋在各個反應(yīng)池內(nèi)。當需要將待測溶液引入擴增反應(yīng)池時,移動蓋片使反應(yīng)池與微溝道連通,此時由于引物被石蠟包埋在反應(yīng)池底部,因此不會發(fā)生反應(yīng)池間引物相互混合的現(xiàn)象。當需要進行擴增反應(yīng)時,移動蓋片使反應(yīng)池與微溝道斷開,從而實現(xiàn)各反應(yīng)池之間的徹底物理隔離。
圖1(c)所示為采用精密銑削制作出的聚碳酸酯(PC)微流控芯片,圖1(d)所示為則為注入各種試劑后的芯片照片。
芯片的操作步驟包括實驗前的芯片預備步驟和核酸檢測步驟。其中,預備步驟主要包括:(1)利用移液槍將不同類型的擴增引物加入擴增反應(yīng)池中,然后將低熔點石蠟融化后依次加入各反應(yīng)池,待石蠟由液態(tài)轉(zhuǎn)為固態(tài)時,引物便被包埋在反應(yīng)池底部;(2)將磁珠、裂解液、清洗液1、清洗液2、洗脫液和LAMP Mix 試劑加入各儲液池中,然后利用膠帶將注液孔密封;(3)在滑動蓋片與基片之間涂覆少許無菌液體石蠟,保證兩片緊密貼合。
核酸檢測步驟主要包括:(1)將20 μL 樣品注入裂解池,在室溫下保持5 min,完成裂解過程;(2)利用一根釹鐵硼永磁棒移動磁珠,使其依次通過清洗池1、清洗池2 和洗脫池,磁珠在兩個清洗池處各停留1 min,洗去殘留的蛋白質(zhì)等雜質(zhì),在洗脫池中停留3 min,使核酸脫落磁珠表面,然后將磁珠移回清洗池2 中;(3)利用一次性注射器,手動向芯片內(nèi)緩慢加壓,使核酸洗脫液與LAMPMix 試劑同時進入方波混合器,得到混合均勻的待測溶液;(4)再次加壓,將待測溶液注入16個擴增反應(yīng)池中,將滑動蓋片向上推移,反應(yīng)池間實現(xiàn)物理隔離;(5)將芯片升溫至65 ℃,保持40 min,完成核酸擴增;(6)利用波長為365 nm 的紫外線驗鈔筆依次照射各反應(yīng)池,發(fā)生了擴增反應(yīng)的樣品池在照射下會發(fā)出明亮的綠色熒光,而未發(fā)生擴增反應(yīng)的樣品池則暗淡無光。
方波混合器是微流控領(lǐng)域中常用的一種二維混合器,主要利用尖角處的湍流和層流間的液體擴散來完成溶液混合[12]。根據(jù)Chen 等[13]的研究,在相同直徑、流速以及縱向長度的情況下,方波形的混合器比其他類型的混合器效率更高。為此,結(jié)合全集成微流控芯片的外觀尺寸,對方波混合器的長度和直徑進行了設(shè)計。
利用COMSOL 軟件對方波混合器的進樣和混合效果進行了模擬仿真。在模擬氣壓推動液體進樣時,利用了物理場中的兩相流-水平集-層流。如圖2(a)所示,仿真結(jié)果表明,在氣體壓強和受壓面積相當?shù)臈l件下,洗脫池與擴增試劑池中的液體(紅色)可在空氣(藍色)的擠壓下同時完成進樣。圖2(b)為對應(yīng)的實驗結(jié)果,可見仿真與實驗結(jié)果基本一致。
圖2 方波混合器進樣效果圖
在模擬混合效果時,采用了物理場中的單相流-層流,建立的仿真模型如圖3(a)所示,進樣速度設(shè)置為50 mm/s。利用參數(shù)掃描,研究了擴散系數(shù)對于出口濃度的影響(圖3(b)),以及入口濃度對于混合效率的影響(圖3(c))。水溶液常溫條件下擴散系數(shù)為10-10~10-9m2/s 之 間,這 里 將 擴 散 系 數(shù) 設(shè) 置 為:1×10-11~1×10-9m2/s,而入口濃度設(shè)置為:1~50 mol/m3??梢钥闯鰯U散系數(shù)和入口濃度均不會影響液體的方波混合器的混合結(jié)果。同樣,利用藍紅兩種液體,對方波混合器的混合效果進行了實驗驗證。如圖3(d)所示,兩種顏色的液體經(jīng)過方波混合器后得到了充分混合,形成了均勻的紫色。
圖3 方波混合器混合效果圖
利用熒光素鈉溶液對滑動式擴增反應(yīng)池的物理隔離效果進行了實驗驗證。首先,在相互間隔的8 個反應(yīng)池中加入相同濃度的熒光素鈉溶液,待其風干后用石蠟對其進行包裹。其次,移動蓋片使反應(yīng)池與微溝道連通,向反應(yīng)池中注入去離子水。接著,將滑動蓋片向上推移,使16 個反應(yīng)池實現(xiàn)物理隔離。然后,將芯片放置到加熱板上進行加熱,在65 ℃保持40 min。最后,利用紫外線驗鈔筆對芯片進行照射。如圖4(a)所示,8 個加入了熒光素鈉的反應(yīng)池發(fā)出了綠色熒光,而其他8 個反應(yīng)池則沒有熒光產(chǎn)生,表明本文設(shè)計的滑動式結(jié)構(gòu)可以在沒有任何閥結(jié)構(gòu)的情況下實現(xiàn)反應(yīng)池間的物理隔離。
圖4 擴增反應(yīng)池的隔離效果驗證
此外,還利用熒光顯微鏡對芯片進行了拍攝(熒光波長為350~500 nm),采用ImageJ圖像軟件對8個加入熒光素鈉反應(yīng)池的熒光面積和熒光強度進行了計算。如圖4(b)所示,8 個反應(yīng)池的熒光面積基本一致,表明初始加入的石蠟量不會影響陽性結(jié)果的判定。8 個反應(yīng)池的均一化熒光強度基本相等,證明注入的去離子水能夠與各擴增池中的熒光素鈉完全混合,進一步證明了該滑動式擴增反應(yīng)池可以滿足多靶標核酸檢測的要求。
本文設(shè)計了一種基于LAMP 技術(shù)的微流控芯片,只需要一個一次性注射器和一支紫外線驗鈔筆,便能夠?qū)崿F(xiàn)核酸的提取、擴增和檢測功能,未來有望用于病原體的核酸即時檢測。將芯片分成了3 個功能區(qū):核酸提取區(qū)、混合區(qū)和核酸擴增區(qū),對各功能區(qū)內(nèi)的儲液池和微溝道等進行了設(shè)計,探討了核酸的提取和擴增方案,分析了芯片的工作流程。利用COMSOL 軟件對芯片上的方波混合器進行了模擬仿真,并進行了實驗測試,檢驗了混合器的液體混合能力。利用熒光素鈉溶液,對芯片上的滑動式擴增反應(yīng)池的物理隔離性能進行了測試,實驗結(jié)果表明該結(jié)構(gòu)能夠在核酸擴增反應(yīng)過程中實現(xiàn)反應(yīng)池間的物理隔離,滿足了芯片多靶標核酸檢測的要求。