吳聲振 鄔素珍 吳向維

（廣東省佛山市佛山復(fù)星禪誠醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

中藥膏方又名煎膏劑、膏滋，是中藥飲片經(jīng)水浸泡、煎煮、濃縮，加飴糖、蜂蜜等輔料收膏制成的半流體劑型[1-3]。膏方具有濃度高，作用相對穩(wěn)定、持久、緩和，適用性廣，易保存，體積小，服用方便等諸多優(yōu)點(diǎn)[4-6]，對于慢性、虛損性疾病，具有藥效持久的優(yōu)勢[7-9]。隨著大眾對治未病及養(yǎng)生保健意識的加強(qiáng)，膏方被日益推廣應(yīng)用。因此，膏方產(chǎn)品的質(zhì)量提升值得進(jìn)一步探索和研究。目前，傳統(tǒng)中藥的濃縮是在常溫常壓下進(jìn)行敞開式長時(shí)間進(jìn)行[10]。敞開式的濃縮模式易造成揮發(fā)性成分的流失，而且藥液長時(shí)間處于100 ℃，某些熱敏性有效成分將被破壞，并增加了無效成分的含量[11-13]?；谏鲜霰锥?，我院自主研發(fā)并獲國家專利的“并聯(lián)式中藥膏方濃縮制備系統(tǒng)”及“混合式真空冷卻裝置”，是通過低溫負(fù)壓技術(shù)降低冷凝器中二次蒸汽壓力，增大傳熱溫度差[14]，降低溶劑沸點(diǎn)，減少有效成分損失，提高藥液濃縮效率。為驗(yàn)證自主研發(fā)設(shè)備的實(shí)用性，本研究以護(hù)肝利濕膏、卵巢護(hù)養(yǎng)膏、內(nèi)異膏為代表方，從有效成分含量、成品穩(wěn)定性的角度對負(fù)壓與常壓濃縮條件進(jìn)行比較，探討制作中藥膏方最佳的濃縮條件。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；BT25S型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；微壓中藥煎煮機(jī)（北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限公司）；KQ2200E型超聲清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9023型，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；并聯(lián)式中藥膏方濃縮制備系統(tǒng)（自主研發(fā)，專利號：201620659405.0）；混合式真空冷卻裝置（自主研發(fā)，專利號：201620656314.1）。

1.2 試藥 芍藥苷對照品，批號：110736- 202044；淫羊藿苷對照品，批號：110737- 202017；丹酚酸B對照品，批號：111562-201917。上述對照品均來自中國食品藥品檢定研究院；水為重蒸水，其他試劑均為色譜純。

1.3 藥材 ①護(hù)肝利濕膏：白芍、黃柏、白術(shù)、佛手、山藥等，本方由我院治療非酒精性脂肪性肝病的常用湯劑化裁而來[15]，按組方配比稱取飲片3批，每批30劑。②卵巢護(hù)養(yǎng)膏：仙茅、巴戟天、黃柏、淫羊藿等，本方由《婦產(chǎn)科學(xué)》中二仙湯化裁而來[16]，按組方配比稱取飲片3批，每批30劑。③內(nèi)異膏：丹參、紅花、牛膝、續(xù)斷、莪術(shù)等，本方由我院治療子宮內(nèi)膜異位癥的湯劑處方化裁而來，按組方配比稱取飲片3批，每批30劑。上述中藥飲片從廣州致信藥業(yè)股份有限公司購進(jìn)，并經(jīng)佛山市中藥研究會李滿聯(lián)副主任中藥師鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 提取液制備 按批分取護(hù)肝利濕膏、卵巢護(hù)養(yǎng)膏、內(nèi)異膏膏方飲片，分別按照以下方法提取：①護(hù)肝利濕膏[15]：浸泡4 h，加8倍量水，煎煮2次，每次60 min。②卵巢護(hù)養(yǎng)膏[16]。③內(nèi)異膏：浸泡4 h，加8倍量的水，煎煮3次，每次60 min。分別濾過上述提取液，得到護(hù)肝利濕膏提取液3批，每批提取液體積為32 000 mL；卵巢護(hù)養(yǎng)膏提取液3批，每批提取液體積為33 000 mL；內(nèi)異膏提取液3批，每批提取液體積為35 000 mL。

2.1.2 濃縮液制備 分別取護(hù)肝利濕膏、卵巢護(hù)養(yǎng)膏、內(nèi)異膏提取液各3批，平分為兩組，常壓組于常壓條件濃縮，負(fù)壓組接入自主研發(fā)的“并聯(lián)式中藥膏方濃縮制備系統(tǒng)”進(jìn)行濃縮，兩組藥液濃縮至1 000 mL時(shí)停止加熱，分別濾過后得到3種膏方在不同條件下的濃縮液，具體批號命名見表1。

表1 護(hù)肝利濕膏、卵巢護(hù)養(yǎng)膏、內(nèi)異膏不同條件下的濃縮液批號

2.2 不同濃縮條件對膏方制作質(zhì)量的影響

2.2.1 不溶物測定 取2.1.2項(xiàng)所得的濃縮液濾過后的濾渣，分別加熱水200 mL，攪拌使之溶化，放置3 min后觀察結(jié)果，負(fù)壓組未發(fā)現(xiàn)不溶物，常壓組的卵巢護(hù)養(yǎng)膏濃縮液中發(fā)現(xiàn)焦屑等不溶物。

2.2.2 含量測定

2.2.2.1 護(hù)肝利濕膏中芍藥苷的含量測定

色譜條件：色譜柱：Amethyst C18-H（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長：230 nm；流速：1.0 mL/min；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g）（14∶86）；進(jìn)樣量：10 μL。

對照品溶液制備：精密稱定芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，加適量甲醇制成濃度為1.504 mg/mL的芍藥苷對照品溶液。

供試品溶液制備：取2.2.1項(xiàng)所得護(hù)肝利濕膏濃縮液（FYHG01、FYHG02、FYHG03；CYHG01、CYHG02、CYHG03），每組各取1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，取上清液，濾過，即得。

線性關(guān)系考察：取芍藥苷對照品溶液，分別加甲醇稀釋成0.0602、0.1504、0.3008、0.7520、1.504 mg/mL的溶液，注入HPLC分析，以對照品濃度與相應(yīng)峰面積進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷的回歸方程Y=3452X+1492.4（r=1.0），在0.0602～1.504 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取同一對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算各峰面積。結(jié)果芍藥苷的峰面積RSD為1.45%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，按色譜條件，分別于0、2、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄芍藥苷的峰面積，結(jié)果芍藥苷的平均峰面積RSD為0.96%，表明護(hù)肝利濕膏供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批護(hù)肝利濕膏濃縮液（FYHG01）6份，按供試品溶液制備方法制備供試品，再按色譜條件進(jìn)樣，測定芍藥苷峰面積，并計(jì)算其含量。結(jié)果芍藥苷的平均含量為14.83 mg/g，RSD為1.46%，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收實(shí)驗(yàn)：取已知含量的護(hù)肝利濕膏濃縮液（FYHG01）6份，分別加入已知含量的對照品，按供試品溶液制備方法制備供試品，按色譜條件測定，記錄峰面積，并計(jì)算各峰面積的RSD。芍藥苷的平均加樣回收率（n=6）為100.35%，RSD為2.26%。表明樣品回收率良好，該方法準(zhǔn)確率較高。

2.2.2.2 卵巢護(hù)養(yǎng)膏中淫羊藿苷的含量測定

色譜條件：色譜柱：Sepax Bio-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL/min；流動相：乙腈-水（30∶70）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

對照品溶液制備：精密稱取淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為0.1520 mg/mL的淫羊藿苷對照品溶液，搖勻，即得。

供試品溶液制備：取2.2.1項(xiàng)所得卵巢護(hù)養(yǎng)膏濃縮液（FYLC01、CYLC01），每組各取10 mL，乙酸乙酯振搖提取3次，每次30 mL，分取乙酸乙酯層，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

線性關(guān)系考察：取淫羊藿苷對照品溶液，分別加甲醇稀釋成0.0060、0.0152、0.0304、0.0760、0.1520 mg/mL的溶液，注入HPLC分析，以對照品濃度與相應(yīng)峰面積進(jìn)行線性回歸，得淫羊藿苷回歸方程Y=21.024X+82.594，在0.0060～0.1520 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取同一對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算各峰面積。結(jié)果淫羊藿苷的峰面積RSD為1.65%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，按色譜條件，分別于0、2、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄淫羊藿苷的峰面積，結(jié)果淫羊藿苷的平均峰面積RSD為1.33%，表明卵巢護(hù)養(yǎng)膏供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批卵巢護(hù)養(yǎng)膏濃縮液（FYLC01）6份，按供試品溶液制備方法制備供試品，再按色譜條件進(jìn)樣，測定淫羊藿苷峰面積，并計(jì)算其含量。結(jié)果淫羊藿苷的平均含量為1.32 mg/g，RSD為1.65%，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收實(shí)驗(yàn)：取已知含量的卵巢護(hù)養(yǎng)膏濃縮液（FYLC01）6份，分別加入已知含量的對照品，按供試品溶液制備方法制備供試品，按色譜條件測定，記錄峰面積，并計(jì)算各峰面積的RSD。淫羊藿苷的平均加樣回收率（n=6）為101.67%，RSD為3.31%。表明樣品回收率良好，該方法準(zhǔn)確率較高。

2.2.2.3 內(nèi)異膏中丹酚酸B的含量測定

色譜條件：色譜柱：Sepax Bio-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長：286 nm；流速：1.0 mL/min；流動相：以乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，按表2程序進(jìn)行梯度洗脫；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。見表2。

表2 梯度洗脫程序

供試品溶液的制備：取2.2.1項(xiàng)所得內(nèi)異膏濃縮液（FYNY01、CYNY01），每組各取10 mL，乙酸乙酯振搖提取3次，每次30 mL，分取乙酸乙酯層，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

對照品溶液的制備：精密稱取丹酚酸B對照品適量，加甲醇制成濃度為1.0 mg/mL的丹酚酸B對照品液。

線性關(guān)系考察：取丹酚酸B對照品溶液，分別加甲醇稀釋成0.04、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL的溶液，注入HPLC分析，以對照品濃度與相應(yīng)峰面積進(jìn)行線性回歸，得丹酚酸B的回歸方程Y=1682.1X -830.24（r=0.9999）。在0.04～1.0 mg/mL時(shí)，線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，并計(jì)算各峰面積的RSD，結(jié)果丹酚酸B峰面積RSD為1.06%，表示儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，按色譜條件，分別于0、2、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄丹酚酸B的峰面積，結(jié)果丹酚酸B的平均峰面積RSD為1.27%，表明內(nèi)異膏供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批內(nèi)異膏濃縮液（FYNY01）6份，按供試品溶液制備方法制備供試品，再按色譜條件進(jìn)樣測定丹酚酸B峰面積，并計(jì)算其含量。結(jié)果丹酚酸B的平均含量為1.79 mg/g，RSD為2.12%，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收實(shí)驗(yàn)：取已知含量的內(nèi)異膏濃縮液（FYNY01）6份，分別加入已知含量的對照品，按供試品溶液制備方法制備供試品，按色譜條件測定，記錄峰面積，并計(jì)算各峰面積的RSD。丹酚酸B的平均加樣回收率（n=6）為99.78%，RSD為1.57%。表明樣品回收率良好，該方法準(zhǔn)確率較高。

2.2.3 不同濃縮條件對膏方有效成分的影響 使用HPLC分別測定常壓和負(fù)壓濃縮后藥液中各膏方有效成分的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率（F%）（F%=水提液中有效成分的量/飲片中有效成分的量×100%），轉(zhuǎn)移率越高說明膏方有效成分的損失越少，質(zhì)量越高。見表3。

表3 不同濃縮方法對膏方有效成分的影響

2.3 不同濃縮條件所得膏方的穩(wěn)定性比較 分別取

2.2.1 項(xiàng)制得的護(hù)肝利濕膏（FYHG01、FYHG02、FYHG03；CYHG01、CYHG02、CYHG03）、卵巢護(hù)養(yǎng)膏（FYLC01、FYLC02、FYLC03；CYLC01、CYLC02、CYLC03）、內(nèi)異膏（FYNY01、FYNY02、FYNY03；CYNY01、CYNY02、CYNY03）濃縮液，經(jīng)收膏后制成膏方，在常溫下存放120 d，分別于0、7、14、30、60、90、120 d觀察成品外觀，并按照非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查方法[17]取樣檢查。結(jié)果表明，負(fù)壓和常壓濃縮所得膏方120 d內(nèi)外觀無明顯變化，微生物限度均符合要求。見表4。

表4 不同濃縮條件所得膏方霉菌及酵母菌檢測結(jié)果

2.4 不同濃縮方法的成本比較 分別記錄2.1.2項(xiàng)不同膏方在不同條件下濃縮所需時(shí)間，計(jì)算濃縮時(shí)間平均值。以3種膏方的平均濃縮時(shí)間為代表，得到每份膏方（30劑/份）在不同濃縮條件下的平均耗時(shí)，并計(jì)算相應(yīng)成本。結(jié)果表明，每份膏方的制作耗時(shí)負(fù)壓濃縮比常壓濃縮短238 min，以常壓和負(fù)壓濃縮設(shè)備功率均為1 000 W，電費(fèi)以1元/（kW·h）計(jì)算，每份膏方使用負(fù)壓濃縮制作能節(jié)省3.97元，以我院每年膏方制作量1萬份計(jì)算，每年可節(jié)約制作時(shí)間3.93萬小時(shí)，節(jié)省電費(fèi)3.97萬元，即負(fù)壓濃縮的成本約為常壓濃縮的50%。見表5。

表5 不同條件下每份膏方的制作成本

3 討論

常壓濃縮時(shí)，某些膏方因含有大量黏性成分，隨著藥液逐漸變濃，溶液傳熱變慢[18]，加熱面的熱量不能及時(shí)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致底部焦化，故濃縮過程需要經(jīng)常攪拌，極其耗費(fèi)人力。低溫負(fù)壓濃縮通過強(qiáng)化蒸發(fā)作用促進(jìn)溶液傳熱[19]，避免局部過熱，使勞動力得以解放，提高了生產(chǎn)效率和操作安全性。

質(zhì)量穩(wěn)定是評價(jià)膏方臨床用藥的安全性和有效性的重要指標(biāo)之一，膏方中的有效成分是其發(fā)揮臨床功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是評價(jià)膏方質(zhì)量的重要依據(jù)，而長時(shí)間高溫加熱會影響有效成分的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，負(fù)壓環(huán)境下，3種膏方中的有效成分芍藥苷、淫羊藿苷、丹酚酸B的轉(zhuǎn)移率均高于常壓濃縮，且負(fù)壓濃縮時(shí)間為常壓濃縮的1/2，在膏方制作中更具有優(yōu)勢。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[20-21]，煮沸滅菌法一般滅菌時(shí)間為30～60 min，低溫負(fù)壓濃縮技術(shù)溶液沸點(diǎn)較低，濃縮時(shí)間較短，為驗(yàn)證膏方濃縮過程已有效滅菌，故對膏方成品進(jìn)行微生物限度檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該技術(shù)符合滅菌要求。

成本比較表明，常壓濃縮能耗大，效率低，難以滿足日益增長的膏方制作需求。負(fù)壓濃縮能耗小、效率高，配合本院自發(fā)研制的“并聯(lián)式中藥膏方濃縮制備系統(tǒng)”，可兼顧大批量生產(chǎn)與個性膏方小批量制作，使制作成本縮減為常壓濃縮的50%，更適合應(yīng)用于膏方制作。目前該膏方濃縮制備系統(tǒng)僅在本院安裝使用，存在一定局限性，更多優(yōu)化方案需要在后續(xù)推廣使用中獲得。