宋宇倫，馮赫澤，周彥芝，李 遠(yuǎn)，魏國生 ，李井春

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

我國是人口大國，也是肉制品消耗大國，據(jù)了解，近10年我國人均肉制品年消耗量從30多千克增至60多千克，為了解決畜牧業(yè)畜禽數(shù)量、產(chǎn)量等的實際問題，利用性別控制技術(shù)促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展尤為必要。性別控制技術(shù)是一項現(xiàn)代生物技術(shù)，通過人為參與選擇分離X、Y精子，最終得到所需性別的后代，具有非常重要的理論與現(xiàn)實意義。首先，性別控制技術(shù)能夠充分發(fā)揮公畜生長速度、肉質(zhì)性能，母畜的繁殖、泌乳性能，從而獲得巨大的經(jīng)濟(jì)效益；其次，能夠增強(qiáng)優(yōu)良性狀強(qiáng)度，加快育種進(jìn)程，降低育種成本，以獲得最大的遺傳進(jìn)展；此外，還可以通過控制后代的性別克服孿生不育等現(xiàn)象，并排除伴性有害基因的危害等問題。性控精液能夠通過分離冷凍的精液選擇性別進(jìn)行輸精，最終達(dá)到生產(chǎn)所需的目的，因此，高效準(zhǔn)確的分離性控精液成為性別控制技術(shù)的重點研究方向之一，在畜牧生產(chǎn)中，性控技術(shù)的研究具有非常重要的實際生產(chǎn)價值。

目前，國內(nèi)外的科研人員針對于性控精液分離的方法及胚胎性別鑒定進(jìn)行了大量的研究，其中主要集中在以下幾種方法。

1 Percoll密度梯度離心法

Percoll密度梯度離心法是指在離心過程中，由于X、Y精子在分離介質(zhì)中的沉降速度不同，導(dǎo)致所處密度梯度不同，經(jīng)過一段時間后最終分離精子的方法。S Kaneko等使用Percoll 密度梯度離心分離人X、Y精子時，正常精子和少精癥精子中含有Y精子的比例分別為46.7%和46.6%，且分離后精子仍具有活力。曹世禎等研究表明，利用Percoll不連續(xù)密度梯度分離奶牛定性精液，所獲精液的后代性別比例差異顯著，其中富含X精子的定性精液后代雌性占比均在60%以上。Percoll密度梯度離心技術(shù)操作簡單，成本低，但在離心過程中，精子細(xì)胞容易產(chǎn)生高濃度的活性氧（ROS），損害精子活力，降低精子完整性。

2 流式細(xì)胞儀分離法

流式細(xì)胞儀分離精子是根據(jù)X、Y精子之間的DNA含量差異進(jìn)行分離。在分離X、Y精子時，常用的熒光染色劑為Hoechst33342，經(jīng)過染色的精子會發(fā)光的為活精子，由于X精子的DNA含量高，結(jié)合的染色劑多，因此發(fā)光強(qiáng)度高于Y精子，導(dǎo)致激光系統(tǒng)被激活，使熒光信號轉(zhuǎn)化成電信號，從而對兩種不同的精子附上不同的正負(fù)電荷，最終落入不同的收集管中完成分離。宋林等利用流式細(xì)胞儀分離奶牛精子受胎后，對性別比例的影響較大，但分離解凍后的精子活力較原精活力低。熊顯榮等在使用流式細(xì)胞儀的基礎(chǔ)上添加誘惑紅，使質(zhì)膜不完整的精子著色淘汰，能顯著增強(qiáng)分選后牦牛精子的活力，在一定程度上能夠提高性控凍精的受胎率。但增有權(quán)等在使用流式細(xì)胞儀分離豬精子進(jìn)行受胎后，輸Y精子產(chǎn)仔率100%，輸X精子產(chǎn)仔雌性率為91.67%，但窩產(chǎn)仔數(shù)呈下降趨勢。流式細(xì)胞儀分離X、Y精子是目前在實際生產(chǎn)中被大規(guī)模應(yīng)用的分離技術(shù)，但在分離豬精液方研究用較少，未來還需對分離豬精液開展進(jìn)一步研究。

3 免疫法分離X、Y精子

Toll樣受體（Toll-like receptors,TLR）是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，能夠識別特定的病原體，在哺乳動物精子中表達(dá)，并通過干擾精子獲能和過度激活精子活力來損害精子受精。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TLRs家族成員有11個，其中TLR7/8只在X染色體上表達(dá)。Umehara等研究表明，X染色體編碼的TLR7/8在X精子中部和尾部表達(dá)，而在Y精子中不表達(dá)。Umehara等進(jìn)一步將TLR7/8用于分離小鼠精子，在添加R848配體的條件下，小鼠的X、Y精子活力差異顯著，溶液中顯示分層狀態(tài)，X精子的活力受到抑制，處于下層，當(dāng)清除R848后，X精子活力被恢復(fù)，且仍然具備受精能力。Fa Ren等在奶山羊分離X、Y精子中使用TLR7/8受體時得到同樣的結(jié)果，并且證明TLR7/8能夠直接調(diào)節(jié)奶山羊的ATP水平來影響X精子活力。劉偉東研究表明，在肉牛精子中TLR7/8激動劑R848能夠顯著降低X精子的運動性能，但對精子頂體完整性和質(zhì)膜完整性沒有明顯影響，且利用R848對肉牛鮮精進(jìn)行分選，分選后Y精子純度可以達(dá)到88.6%，X精子純度可以達(dá)到72.5%。TRL7/8分選精子雖然準(zhǔn)確率不高，但操作簡單方便，試驗過程中不損傷精子，不需要昂貴的設(shè)備，節(jié)省生產(chǎn)成本。目前在分離牛、羊、小鼠中已經(jīng)展開相關(guān)研究，但在分離豬精子的研究中還處于空白狀態(tài)，在今后的研究中具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

4 PCR法鑒定胚胎性別

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外擴(kuò)增技術(shù)。在進(jìn)行胚胎性別鑒定時，通常選擇Y染色體上的性別特異基因（如SRY基因）進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)是否可以擴(kuò)增特異基因來判斷胚胎性別。目前胚胎鑒定的PCR法主要有常規(guī)PCR、巢式PCR、雙重和多重PCR。孫俊麗等利用巢式PCR技術(shù)，對豬X和Y染色體上牙釉質(zhì)基因（Amelogenin gene，AMEL）進(jìn)行胚胎性別鑒定，試驗結(jié)果顯示，經(jīng)PCR產(chǎn)物片段掃描后雌性胚胎只有一個峰值，雄性胚胎有兩個峰值。尹智等利用SRY和zfy/x基因的特性，采取雙重PCR技術(shù)對6只30 d左右的豬胚胎的性別進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示SRY序列擴(kuò)增后，一個樣品出現(xiàn)兩個擴(kuò)增帶為雄性，剩余無特異擴(kuò)增帶為雌性。李小平等根據(jù)豬的SRY基因和GAPDH基因序列合成兩對引物，通過雙溫多重PCR技術(shù)對豬進(jìn)行早期胚胎性別鑒定，結(jié)果顯示只能擴(kuò)增GAPDH基因片段的為母豬，對SRY基因片段和GAPDH基因片段都能夠擴(kuò)增的為公豬，且試驗中減少一步程序，可進(jìn)一步縮短試驗時間，減少精子損傷。

5 展望

性別控制技術(shù)對畜牧業(yè)的發(fā)展有著重要意義。當(dāng)前性別控制技術(shù)正在逐步完善，許多存在的問題都已被解決，但仍有部分技術(shù)難題一直存在，如損傷精子、分離時間長等，阻礙畜牧業(yè)的發(fā)展。流式細(xì)胞儀在性別控制技術(shù)中被廣泛應(yīng)用，但對于豬性控精液的發(fā)展和應(yīng)用還不成熟。利用TLR7/8在X、Y精子中的蛋白表達(dá)差異進(jìn)行精子分離的試驗中取得了較好的成績，可望在日后的研究及生產(chǎn)中得到更多的運用。目前對于豬性控精液的研究與應(yīng)用，相較于牛羊等產(chǎn)業(yè)還處于落后狀態(tài)，但隨著科技的進(jìn)步和新技術(shù)的發(fā)掘，相信一定能夠填補(bǔ)空缺，促進(jìn)畜牧業(yè)更好的發(fā)展。