崔佰吉，王 爽，張風(fēng)旗，陸德煥

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

烏拉草(CarexMeyerianaKunth，CMK)是莎草科多年生草本植物，在我國(guó)東北長(zhǎng)白山地區(qū)分布最為豐富。研究發(fā)現(xiàn)烏拉草中含有豐富的纖維素[1]，是生產(chǎn)纖維素納米晶體的原料[2]。烏拉草中揮發(fā)油具有良好的抑菌活性[3]；烏拉草多糖具有體外抗氧化能力[4]和免疫調(diào)節(jié)活性[5]；烏拉草還富含多種黃酮類和多酚類成分，具有抗氧化、抑制腫瘤血管生成及抗衰老的作用，但目前對(duì)這一方面的研究?jī)?nèi)容比較少。

Box-Behnken design(BBD)效應(yīng)面法是種多因素非線性實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法，采用多元二次回歸方程擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，尋求最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件的一種方法，在中藥成分提取和藥劑領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[6-9]。本研究采用單因素結(jié)合BBD方法進(jìn)行烏拉草中總黃酮和總多酚的提取工藝研究，優(yōu)選提取過(guò)程中的乙醇濃度、料液比和提取時(shí)間，為烏拉草的深度開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

UV1800紫外分光光度儀(日本 島津)；KQ5200DE超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(德國(guó) 賽多利斯)。

烏拉草收集自吉林省磐石市，蘆丁(批號(hào)：20200718)和沒(méi)食子酸(批號(hào)：20200625)購(gòu)自于成都普菲德科技有限公司，其他試劑均為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測(cè)定方法

總黃酮含量測(cè)定方法按照文獻(xiàn)的方法，以蘆丁當(dāng)量表示總黃酮的含量，按照文獻(xiàn)的方法稍加改進(jìn)。

精密稱取蘆丁對(duì)照品9.89 mg，置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解、定容，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋至適宜濃度的對(duì)照品溶液(0.0989、0.1978、0.2967、0.3956、0.4945、0.5934 g/L)。

分別精密量取對(duì)照品溶液1 mL置10 mL量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.6 mL，混勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.6 mL，混勻，放置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，混勻，放置15 min；用70%的乙醇溶液定容至刻度，混勻；紫外分光光度法在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=13.455X-0.006 9，R2=0.996 6。表明在0.098 9～0.593 4 g/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以用于烏拉草中總黃酮的含量測(cè)定。

精密量取供試品溶液1 mL置10 mL量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法依法操作，紫外分光光度法在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總黃酮的含量。

2.2 總多酚的含量測(cè)定

總多酚含量測(cè)定方法按照文獻(xiàn)的方法，以沒(méi)食子酸當(dāng)量表示總多酚的含量，按照文獻(xiàn)的方法稍加改進(jìn)。

精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品5.17 mg置10 mL量瓶中，加適量水溶解，加30%乙醇水溶液定容至刻度，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加水稀釋至適宜的濃度，得對(duì)照品溶液(0.0517、0.1035、0.2069、0.3104、0.4138、0.5170 g/L)。

精密量取各對(duì)照品溶液1 mL至25 mL量瓶中，加入福林酚試劑2 mL混勻，加入10%碳酸鈉溶液6 mL混勻，加水定容至刻度，置暗放150 min，紫外分光光度法在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=46.555X-0.043 9，R2=0.989 6。表明在0.051 7～0.517 0 g/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以用于烏拉草中總多酚的含量測(cè)定。

精密量取供試品溶液1 mL置25 mL量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法操作，紫外分光光度法在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總多酚的含量。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1溶劑濃度的選擇

稱取2 g烏拉草粉末置三角瓶中，按照料液比1∶20分別加入乙醇溶液，乙醇濃度分別為：40%、50%、60%、70%、80%、90%，加熱回流提取，提取時(shí)間為45 min，過(guò)濾，濾液置100 mL量瓶中，加入乙醇定容至刻度，混勻，得供試品溶液(平行實(shí)驗(yàn)3次)。按照“2.1、2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮及總多酚的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的乙醇對(duì)于總黃酮和總多酚的含量影響不大，變化趨勢(shì)不明顯，綜合評(píng)價(jià)，選取80%乙醇溶液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2料液比的選擇

稱取2 g烏拉草粉末置三角瓶中，按照料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40分別加入乙醇溶液，乙醇濃度分別為80%，加熱回流提取，提取時(shí)間為45 min，過(guò)濾，濾液置100 mL量瓶中，加入乙醇定容至刻度，混勻，得供試品溶液(平行實(shí)驗(yàn)3次)。按照“2.1、2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮及總多酚的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，料液比的變化對(duì)于總黃酮和總多酚的含量影響比較明顯，隨著料液比例的增加，含量逐漸增加，料液比為1∶30時(shí)趨于平衡，所以選取料液比為1∶30進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.3提取時(shí)間的選擇

稱取2 g烏拉草粉末置三角瓶中，按照料液比1∶30分別加入乙醇溶液，乙醇濃度分別為80%，加熱回流提取，提取時(shí)間分別為45、60、90、120 min，過(guò)濾，濾液置100 mL量瓶中，加入乙醇定容至刻度，混勻，得供試品溶液(設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)3次)。按照“2.1、2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮及總多酚的含量。結(jié)果表明，提取時(shí)間對(duì)于結(jié)果的影響不大，45 min時(shí)結(jié)果稍低，但是與其他提取時(shí)間的含量結(jié)果沒(méi)有顯著性差異，綜合評(píng)估后選擇75 min為最佳提取時(shí)間，在響應(yīng)面設(shè)計(jì)時(shí)再擴(kuò)大響應(yīng)范圍。

2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合評(píng)估后進(jìn)行相應(yīng)的參數(shù)優(yōu)化設(shè)計(jì)，選取乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間3因素，以總黃酮和總多酚的含量結(jié)果為考察指標(biāo)，采用“2.1、2.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行總黃酮及總多酚的含量測(cè)定，Design-Expert12進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1，方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 方差分析結(jié)果表

實(shí)驗(yàn)結(jié)果二項(xiàng)式擬合后可知，回歸方程為：Y=-0.350 8A2+0.186 7B2-0.408 3C2+0.332 5A+0.101 2B+0.358 8C-0.227 5AB+0.507 5AC-0.175 0BC+4.32；F值為2.92；P值為0.1254；模型相關(guān)系數(shù)為0.8401；測(cè)量信噪比為5.25(>4)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，模型擬合度良好，各因素跨度合理，但選取的三個(gè)因素對(duì)最終結(jié)果的影響的顯著程度不明顯，但可以看出因素A(乙醇濃度)、因素C(提取時(shí)間)和因素A&C三項(xiàng)的P值分別為0.074、0.059和0.059，說(shuō)明因素A和C以及兩者之間的交互作用對(duì)烏拉草有效成分提取率具有一定的影響作用。

各因素交互影響結(jié)果3D圖見(jiàn)圖1。因素對(duì)提取率的影響越明顯，曲面就會(huì)越凸出，曲面越平，提取率對(duì)于因素的改變?cè)讲幻黠@。圖1可以看出A&C的交互作用對(duì)總黃酮和總多酚的提取率影響最大，這一結(jié)果與方差分析中的結(jié)果得到相互的驗(yàn)證。最后，根據(jù)軟件的計(jì)算，預(yù)測(cè)最佳的提取方案為：乙醇濃度77.4%，料液比為1∶30，提取時(shí)間為90 min。

1 A&B 2 A&C 3 B&C

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)的最佳實(shí)驗(yàn)方案，結(jié)合實(shí)際調(diào)整為80%，故驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)驗(yàn)條件：乙醇回流法提取，乙醇濃度80%；料液比1∶30；提取時(shí)間90 min。進(jìn)行平行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果總黃酮SD為0.09，總多酚SD為0.15，顯示本方法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定。

3 討 論

由于黃酮分子結(jié)構(gòu)中多含有酚羥基結(jié)構(gòu)，所以總黃酮和總多酚類的測(cè)定中具有一定的重疊效果。但在單因素和BBD過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同因素變化對(duì)有效成分的含量影響并不顯著，各種因素變化范圍的增大并未引起含量的梯度變化。同時(shí)BBD結(jié)果也可看出，模型設(shè)計(jì)和各因素響應(yīng)結(jié)果值顯著性不明顯，原因可能與烏拉草中的總黃酮和總多酚實(shí)際含量有關(guān)。基礎(chǔ)含量不高，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的各因素最低水平下能夠有效提取總黃酮和總多酚，所以水平梯度上漲后，對(duì)于最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有顯著性影響。同時(shí)，由于烏拉草為草本植物，為了便于有效成分的提取需要對(duì)其進(jìn)行粉碎處理，粉碎后的烏拉草粗粉較蓬松，加入過(guò)少的提取溶劑不能完全浸沒(méi)烏拉草粉末，這可能也是各因素對(duì)含量結(jié)果響應(yīng)不明顯的一個(gè)因素。雖然整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各因素對(duì)烏拉草中總黃酮和總多酚的提取效率沒(méi)有顯著影響，但實(shí)驗(yàn)明確了各個(gè)因素及交互作用的相互影響，可以為烏拉草資源的有效利用提供理論參考。

本研究采用BBD法優(yōu)化了烏拉草中總黃酮和總多酚的提取工藝，最終確定了最佳的提取方法，并明確了各個(gè)因素以及各個(gè)因素之間的交互作用對(duì)其提取率的影響程度，最終確定的提取工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好，可以用于烏拉草中總黃酮和總多酚的提取。