劉秀萍，申龍俊，孫巳茵，鄧 方

(1.吉林市中心醫(yī)院，吉林 吉林 132011；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春 130031)

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI) 可發(fā)生于多種腦血管疾病過程中， 而腦水腫是缺血性腦血管病中常見的并發(fā)癥之一。血-腦屏障的通透性與腦水腫密切相關(guān)[1]。星形膠質(zhì)細胞的終足、細胞外基質(zhì)和內(nèi)皮細胞是構(gòu)成血-腦屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。組成血-腦屏障的星形膠質(zhì)細胞膜上有豐富的水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)表達。AQP4是膜水通道蛋白家族的成員之一，在腦組織中廣泛表達，是控制水進出腦組織的通道，在腦水腫[2]、星形細胞遷移[3]、神經(jīng)炎癥及缺血性腦卒中等方面均起著重要作用[4]。銀杏內(nèi)酯(ginkgolide，GK)是銀杏葉提取物中的一類萜內(nèi)酯成分，主要包括單體銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J和白果內(nèi)酯(bilobalide，BB)[5]。目前銀杏內(nèi)酯已廣泛應(yīng)用于臨床，然而迄今銀杏內(nèi)酯及其單體白果內(nèi)酯在腦灌注損傷后的作用機制尚不明確，其對腦缺血后腦水腫方面鮮見文獻報道。為深入探究其對急性腦缺血再灌注損傷的作用機制，本研究從血腦屏障角度，觀察GK和BB對腦缺血的保護作用及對缺血側(cè)皮層AQP4表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性Wistar大鼠，體重260～280 g，吉林大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(吉)2013-0001。

1.2 藥物與試劑

銀杏內(nèi)酯(四川成都百裕公司提供，批號：20130801)，白果內(nèi)酯(四川成都百裕公司提供，批號：NZ130609，純度>90%)，AQP4抗體(AB3594，Minipore)。

1.3 實驗分組

將實驗動物隨機分為4組：假手術(shù)組(Sham組)、大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型組(MCAO組)、銀杏內(nèi)酯組(GK組)和白果內(nèi)酯組(BB組)。后兩組分別設(shè)不同干預(yù)劑量亞組，即GK2.5組(2.5 mg/kg GK腹腔內(nèi)注射)、GK5組(5 mg/kg GK腹腔內(nèi)注射)、GK10組(10 mg/kg GK腹腔內(nèi)注射)，BB2.5組(2.5 mg/kg BB腹腔內(nèi)注射)、BB5組(5 mg/kg BB腹腔內(nèi)注射)和BB10組(10 mg/kg BB腹腔內(nèi)注射)。模型組及GK、BB各劑量組行MCAO，假手術(shù)組不插線栓。各實驗組及劑量亞組每組實驗大鼠6只。劑量亞組動物于腦缺血再灌注前30 min腹腔給藥，假手術(shù)組和MCAO組給予等量生理鹽水。

1.4 大鼠腦缺血再灌注模型的制備

實驗采用Longa線栓法制備腦缺血再灌注模型，大鼠左側(cè)MCAO 2 h再灌注12 h。應(yīng)用10%水合氯醛(35 mL/kg)腹腔注射麻醉。大鼠仰臥位，四肢固定，去除口腔分泌物，碘伏消毒頸部皮膚，經(jīng)頸正中切口，分離頸部筋膜，沿左側(cè)胸鎖乳突肌內(nèi)緣鈍性分離肌肉，暴露頸動脈三角。手術(shù)分離左側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)，注意伴行的迷走神經(jīng)，防止術(shù)中牽拉導(dǎo)致呼吸心跳驟停。用電凝筆電凝來源于ECA的枕動脈和甲狀腺上動脈，分離ECA主干，其遠心端用細線將血管結(jié)扎，使其無血流通過，在近心端靠近CCA和ECA分叉處用細線在ECA上打一松結(jié)。用稍粗縫合線暫時系緊CCA，用小動脈夾暫時夾閉ICA，在頸外動脈兩條結(jié)扎線間近心端側(cè)上方近剪一倒“V”形切口，將直徑為0.26 mm賴氨酸包被的鈍性魚線線栓斜行插入，通過頸內(nèi)動脈推進到大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)，插入約18～20 mm遇有阻力時為止，系緊ECA根部絲線去除CCA殘留的粗縫合線。大腦中動脈閉塞2 h后行再灌注，小心拔除線栓,手術(shù)線系緊血管殘端，保證MCA血流再通。Sham組僅暴露CCA、ECA及ICA，不做插線處理，余操作相同?？p合肌肉和皮膚。術(shù)前實驗動物禁食一夜，術(shù)前可飲水，避免急性腸梗阻的發(fā)生，術(shù)后單籠飼養(yǎng)，密切關(guān)注大鼠生命體征變化。

1.5 神經(jīng)功能評分、腦梗死體積測定

大鼠缺血2 h再灌注12 h后，按Zea Longa 5分制評分法對大鼠進行評分。評分標準為0分：無神經(jīng)功能損傷癥狀；1分：對側(cè)前爪不能完全伸展；2分：向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。入組標準為：評分為1～3分，且無蛛網(wǎng)膜下腔出血。

大鼠腦缺血2 h再灌注12 h后，經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉后迅速取腦，去除小腦和腦干，于-20 ℃冰箱中速凍18 min，然后將腦組織放入腦槽中，沿腦組織冠狀切面切成5片，隨后將腦片放入2% TTC溶液中，37 ℃避光置水浴箱30 min。染色結(jié)果顯示正常腦組織呈紅色，梗死灶呈白色。再將腦片置于4%多聚甲醛溶液固定4～6 h后，數(shù)碼相機拍照，應(yīng)用圖像分析軟件計算腦片梗死面積并計算腦梗死體積占大腦體積的百分比。

1.6 腦組織病理組織學(xué)檢查

大鼠腦缺血再灌注后，用10%水合氯醛麻醉，迅速開胸，用生理鹽水沖洗心臟，然后用4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛灌注液，4 ℃固定1周，依次行脫水、透明、浸蠟及包埋，常規(guī)HE染色封片，光鏡下觀察。

1.7 Western blot檢測AQP4的表達

取缺血側(cè)大腦皮層進行蛋白提取，BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性后行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜封閉，加入一抗(AQP4，1∶500；β-actin，1∶2000)，4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗(1∶2000)室溫孵育，ECL液顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影。采用Image J圖像分析測定Western blot條帶灰度值，結(jié)果以AQP4與β-actin灰度值得比值顯示。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以Mean±SEM表示，采用Graphpad軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)采用One-way ANOVA統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間比較應(yīng)用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 GK和BB對腦缺血再灌注大鼠腦梗死范圍及神經(jīng)功能缺損的影響

腦缺血2 h再灌注12 h，Sham組無神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀，評分為0分；MCAO組均出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺陷癥狀，主要表現(xiàn)為其左側(cè)明顯的Horner’s癥狀，右側(cè)前肢不能完全伸展，大鼠行走時主要右側(cè)轉(zhuǎn)圈或是右側(cè)傾倒；GK5組、GK10組和BB5組、BB10組可明顯改善大鼠神經(jīng)癥狀(P<0.05)。提示GK和BB對大鼠神經(jīng)功能損傷有改善作用。見表1。

表1 缺血2 h再灌注12 h后各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分及梗死體積百分比結(jié)果

2.2 HE染色組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

Sham組未見明顯病理改變，各種神經(jīng)細胞層次清晰，細胞數(shù)量、形態(tài)多樣化，胞核界限清晰，胞質(zhì)均勻，可清晰見到細胞核。MCAO組見大鼠腦缺血中心區(qū)大量神經(jīng)元變性壞死，細胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，可見部分神經(jīng)元胞質(zhì)濃縮，胞核固縮、碎裂或溶解。GK10和BB10組與MCAO組相比，梗死區(qū)縮小，神經(jīng)元損傷程度減輕，細胞排列尚規(guī)則，殘存的細胞形態(tài)相對正常，GK10組殘留的神經(jīng)元細胞數(shù)較BB10組稍多，但GK2.5，GK5，和BB2.5，BB5與MCAO組比較形態(tài)學(xué)有所好轉(zhuǎn)，但不明顯。見圖1。

圖1 缺血再灌注后各組大鼠HE染色結(jié)果(×400)

2.3 GK和BB對大鼠腦梗死范圍的影響

大鼠腦缺血2 h再灌注12 h后，腦組織經(jīng)過2% TTC染色后，正常腦組織染成紅色，梗死腦組織不著色，即為白色。Sham組腦組織呈均一紅色，未見梗死灶；MACO組皮層和皮層下梗死面積大，與MCAO組相比，GK5組，GK10組和BB5組，BB10組腦梗死范圍明顯減小(P<0.05)，且與劑量呈負相關(guān)，提示GK和BB對缺血再灌注腦損傷有保護作用(圖2、表1)。

圖2 缺血2h再灌注12h后各組大鼠TTC染色結(jié)果

2.4 腦缺血再灌注大鼠皮層AQP-4的表達

Western blot結(jié)果：大鼠缺血2 h再灌注12 h后，與Sham組比較，MCAO組的AQP-4表達量明顯升高；與MCAO組比較，GK各亞組和BB亞組中AQP-4蛋白表達量都有所下降，其中GK10組和BB10組下降最為顯著，有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.001。見圖3。

與Sham組比較，###P<0.001；與MCAO組比較，***P<0.001圖3 Western blot檢測大鼠缺血側(cè)皮層AQP-4蛋白的表達

3 討 論

缺血性腦血管病約占全部腦血管病的75%，而腦水腫是缺血性腦血管病常見的病理環(huán)節(jié)之一。腦水腫的發(fā)展是分階段的，細胞毒性水腫表現(xiàn)為急性損傷后數(shù)分鐘，而血管源性水腫則發(fā)生在缺血性卒中損傷后數(shù)小時，主要由于血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞而引起。

近年來，水通道被認為是腦水腫與水通透有關(guān)的重要介質(zhì)。已知的水通道有14個，但只有AQP 1、AQP4、AQP9和AQP11在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達。其中，AQP4是星形膠質(zhì)細胞表達的主要水通道蛋白，是腦水腫形成和清除的主要參與者[6]。AQP4可介導(dǎo)水跨膜的雙向運動,參與血漿滲透壓的調(diào)節(jié)、血腦屏障的發(fā)育和功能維系,并兼有細胞外滲透壓感受器的功能,對維持腦內(nèi)水平衡至關(guān)重要[7]。

Aoki等[8]通過免疫組織化學(xué)雙標法檢測AQP4的表達，研究表明，在缺血性腦卒中發(fā)生后，AQP4在腦組織中表達水平顯著升高，且在缺血中周圍較中心高。王秀輝[9]等應(yīng)用Werstrn Blot法檢MCAO模型腦組織中的AQP4水平，結(jié)果顯示，缺血側(cè)腦組織中AQP4表達水平隨時間的推移呈上升趨勢，在24 h時達到最高峰，48 h時AQP4表達稍有下降。實驗發(fā)現(xiàn)[10]，敲除AQP4基因的小鼠在腦缺血和水中毒期間，星形膠質(zhì)細胞腫脹減少，腦水腫程度減輕，其神經(jīng)功能缺損程度也隨之變小。

銀杏內(nèi)酯及白果內(nèi)酯是目前研究較多的銀杏葉制劑中最為有效的腦保護劑。銀杏內(nèi)酯主要作用為抗血小板、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能、抗興奮毒性[11]及抗細胞凋亡[12]等作用；白果內(nèi)酯主要有抗炎[13]、抗興奮毒性[14]、調(diào)節(jié)能量代謝[15]等作用。上述兩種物質(zhì)均易通過血腦屏障。

本研究通過制備大鼠MCAO模型并給予不同濃度銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯進行干預(yù)，從體內(nèi)實驗的角度探討銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯可能的作用機制。實驗結(jié)果表明，腦缺血再灌注過程中，AQP4蛋白水平的增高有可能引起星形膠質(zhì)細胞對水的通透性增加，從而造成細胞損傷，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀。銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯可以通過顯著降低缺血側(cè)AQP4蛋白的表達，減輕腦水腫程度，保護神經(jīng)元細胞，改善大鼠神經(jīng)功能損害,這可能為臨床預(yù)防和治療腦水腫及腦梗死提供新的靶點。