戴政文 楊志新 歐陽(yáng)建軍 何偉

(湖北省中醫(yī)院 湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 湖北省中醫(yī)藥研究院骨科，湖北 武漢 430070)

骨關(guān)節(jié)炎是臨床常見的一種退行性關(guān)節(jié)疾病，目前骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制尚未闡明，已知蛋白聚糖減少可引起軟骨基質(zhì)合成及降解從而破壞軟骨組織，軟骨細(xì)胞損傷是促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生及發(fā)展的重要原因之一，因而闡明骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療具有重要作用〔1〕。環(huán)狀RNA(circRNA)廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，并可參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，circSERPINE2通過(guò)靶向miR-1271而預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎〔2〕。circRNA-9119通過(guò)miR-26a/PTEN軸可減輕白細(xì)胞介素(IL)-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷〔3〕。circRNA-UBE2G1通過(guò)miR-373/HIF-1α軸調(diào)控脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎〔4〕。circ_0057421在骨關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá)上調(diào)，但關(guān)于其作用機(jī)制尚未闡明〔5〕。靶基因預(yù)測(cè)顯示miR-576-5p與circ_0057421存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-576-5p骨關(guān)節(jié)炎組織中表達(dá)下調(diào)〔6〕。但circ_0057421/miR-576-5p對(duì)軟骨細(xì)胞損傷的作用機(jī)制尚未可知。因此，本研究采用碘乙酸鈉(MIA)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞建立骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷模型，探討circ_0057421/miR-576-5p對(duì)MIA誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡、骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)志物及氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 2017年3月至2019年2月于湖北省中醫(yī)院收治的30例骨關(guān)節(jié)炎的患者，其中男18例，女12例，年齡53～62歲，平均(58.63±6.39)歲，患者符合國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)且均為Ⅰ級(jí)損傷。排除標(biāo)準(zhǔn)：化膿性關(guān)節(jié)炎患者。隨機(jī)收集湖北省中醫(yī)院急診外科收治的30例緊急創(chuàng)傷性截肢患者的正常軟骨標(biāo)本，其中男20例，女10例，年齡50～65歲，平均(55.35±5.59)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。

人軟骨細(xì)胞CHON-001(ATCC細(xì)胞庫(kù))；MIA(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；RNA提取試劑、凋亡檢測(cè)試劑(美國(guó)Sigma公司)；反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR檢測(cè)試劑(大連寶生物公司)；丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑(南京建成生物工程研究所)；兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；兔抗人膠原蛋白(Collagen)Ⅱ抗體(美國(guó)Abcam公司)；兔抗人性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)9抗體(廣州佰匯生物科技有限公司)；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)1、MMP13抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(武漢艾美捷科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于含4 μmol/L MIA的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h〔7〕，記為MIA組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞記為NC組。si-con、si-circ_0057421、miR-con、miR-576-5p mimics、si-circ_0057421與anti-miR-con、si-circ_0057421與anti-miR-576-5p轉(zhuǎn)染入軟骨細(xì)胞后加入含4 μmol /L MIA的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，分別記為si-con組、si-circ_0057421組、miR-con組、miR-576-5p組、si-circ_0057421+ anti-miR-con組、si-circ_0057421+ anti-miR-576-5p組。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)circ_0057421、miR-576-5p的表達(dá)水平 采用Trizol法提取正常軟骨組織、骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞組織及各組軟骨細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度與純度后置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。反轉(zhuǎn)錄體系：5×gDNA緩沖液2 μl，10×King RT緩沖液2 μl，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μl，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μl，RNA(2 μg)，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：42℃ 15 min，95℃ 3 min。cDNA稀釋20倍后進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)程序及反應(yīng)條件均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 各組軟骨細(xì)胞中加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，依次分別加入5 μl膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)、5 μl碘化丙啶(PI)，室溫振蕩孵育10 min后應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4檢測(cè)MDA、LDH、SOD、GSH-Px的含量 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)MDA、LDH、SOD、GSH-Px的含量。

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)circ_0057421與miR-576-5p的靶向關(guān)系 Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)顯示circ_0057421與miR-576-5p存在靶向關(guān)系，將結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)分別克隆至pmirGLO載體得到野生型載體WT-circ_0057421、突變型載體MUT-circ_0057421，miR-con、miR-576-5p mimics分別與WT-circ_0057421、MUT-circ_0057421共轉(zhuǎn)染入軟骨細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞并檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.6Western印跡檢測(cè)Bcl-2、CollagenⅡ、SOX9、Bax、MMP1、MMP13蛋白表達(dá) 各組軟骨細(xì)胞中加入 RIPA裂解液(500 μl)提取細(xì)胞總蛋白后加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，沸水煮10 min后蛋白變性，取40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫孵育2 h后加入一抗稀釋液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，使用TBST洗滌后加入二抗稀釋液(1∶2 000)后室溫孵育1 h，滴加ECL后顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1circ_0057421和miR-576-5p在骨關(guān)節(jié)炎組織中的表達(dá) 與正常軟骨組織比較，骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中circ_0057421表達(dá)水平明顯升高，miR-576-5p表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見表1。與NC組比較，MIA組circ_0057421表達(dá)水平明顯升高，miR-576-5p表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見表2。

表1 circ_0057421和miR-576-5p在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織和 細(xì)胞中的表達(dá)

表2 circ_0057421和miR-576-5p在骨關(guān)節(jié)炎 軟骨細(xì)胞中的表達(dá)

2.2敲低circ_0057421對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡、骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)志物及氧化應(yīng)激的影響 與si-con組比較，si-circ_0057421組MDA、LDH含量明顯降低，SOD、GSH-Px含量明顯升高，凋亡率明顯降低，Bcl-2、CollagenⅡ、SOX9蛋白水平明顯升高，Bax、MMP1、MMP13蛋白水平明顯降低(P<0.01，P<0.001)，見圖1、圖2、表3。

2.3circ_0057421與miR-576-5p相互作用 Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)顯示circ_0057421與miR-576-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。miR-576-5p過(guò)表達(dá)可降低野生型載體WT-circ_0057421的熒光素酶活性(P<0.05)，而對(duì)突變型載體MUT-circ_0057421的熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)，見表4。

圖1 敲低circ-8057421對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響

1，2：si-con組、si-circ_0057421組圖2 敲低circ_8057421對(duì)骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)志物相關(guān) 蛋白表達(dá)的影響

表3 敲低circ_0057421對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)志物相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 circ_0057421與miR-576-5p存在互補(bǔ)核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.4circ_0057421調(diào)控miR-576-5p在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞系中的表達(dá) 與pcDNA組比較，pcDNA-circ_0057421組circ_0057421表達(dá)水平明顯升高，miR-576-5p表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與si-con組比較，si-circ_0057421組circ_0057421表達(dá)水平明顯降低，miR-576-5p表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見表5。

2.5miR-576-5p過(guò)表達(dá)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡、骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)志物及氧化應(yīng)激的影響 與miR-con組比較，miR-576-5p組MDA、LDH含量明顯降低，SOD、GSH-Px含量明顯升高，凋亡率明顯降低，Bcl-2、CollagenⅡ、SOX9蛋白水平明顯升高，Bax、MMP1、MMP13蛋白水平明顯降低(P<0.01,P<0.001)，見表6、圖4、5。

表5 circ_0057421調(diào)控miR-576-5p在骨關(guān)節(jié)炎軟骨 細(xì)胞系中的表達(dá)

表6 miR-576-5p過(guò)表達(dá)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)志物相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4 miR-576-5p過(guò)表達(dá)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響

圖5 miR-576-5p過(guò)表達(dá)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)志物 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.6敲低miR-576-5p逆轉(zhuǎn)抑制circ_0057421對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡、骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)志物及氧化應(yīng)激的影響 與si-circ_0057421+ anti-miR-con組比較，si-circ_0057421+ anti-miR-576-5p組MDA、LDH含量明顯升高，SOD、GSH-Px含量明顯降低，凋亡率明顯升高，Bcl-2、CollagenⅡ、SOX9蛋白水平明顯降低，Bax、MMP1、MMP13蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見圖6、表7、圖7。

1，2:si-circ_0057421+anti-miR-con組、si-circ_0057421+ anti-miR-576-5p組,圖7同圖6 敲低miR-576-5p逆轉(zhuǎn)抑制circ_0057421對(duì) 骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)志物相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表7 敲低miR-576-5p逆轉(zhuǎn)抑制circ_0057421對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、骨關(guān)節(jié)炎標(biāo)志物相關(guān) 蛋白表達(dá)的影響

圖7 敲低miR-576-5p逆轉(zhuǎn)抑制circ_0057421對(duì) 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

細(xì)胞外基質(zhì)損傷是促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的重要原因之一，circRNA在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷中可發(fā)揮重要調(diào)控作用，并可能作為診斷及治療的潛在靶點(diǎn)，circ_0005105上調(diào)miR-26a，上調(diào)NAMPT表達(dá)并促進(jìn)軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)降解〔8〕。circ_0045714通過(guò)調(diào)控miR-193b/IGF1R而調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的合成〔9〕。circPSM3通過(guò)靶向miRNA-296-5p抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖和分化〔10〕。circTMBIM6通過(guò)miR-27a/MMP13軸促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞胞外基質(zhì)降解〔11〕。但仍有部分circRNA在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制尚未闡明。

circ_0057421在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制尚未闡明。本研究結(jié)果提示，circ_0057421在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。氧化應(yīng)激可參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展過(guò)程，SOD、GSH-Px屬于抗氧化酶，其可清除氧自由基，MDA屬于脂膜氧化的產(chǎn)物，軟骨細(xì)胞損傷時(shí)LDH的活性明顯升高〔12,13〕。本研究結(jié)果提示，敲低circ_0057421可抑制MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激可引起細(xì)胞凋亡，Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白，其水平升高可激活線粒體途徑從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔14〕。本研究結(jié)果提示，敲低circ_0057421可抑制MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。MMP1、MMP13與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷密切相關(guān)，CollagenⅡ、SOX9等表達(dá)水平降低是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)受損的重要原因〔15,16〕。本研究結(jié)果提示，敲低circ_0057421能夠通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶分泌及促進(jìn)CollagenⅡ、SOX9合成從而增強(qiáng)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)。

本研究證實(shí)，circ_0057421能夠充當(dāng)miR-576-5p的海綿分子，并可負(fù)向調(diào)控miR-576-5p的表達(dá)及活性。miR-576-5p在食道癌、子癇前期中表達(dá)異常并可參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔17，18〕。本研究結(jié)果提示，circ_0057421可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控miR-576-5p而參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過(guò)程。同時(shí)，本研究結(jié)果提示抑制miR-576-5p可明顯逆轉(zhuǎn)敲低circ_0057421對(duì)MIA誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激的作用。