李月水,于橋愛,唐柳生,廖家吉,李世立★
(1.廣西壯族自治區(qū)胸科醫(yī)院,廣西 柳州 545005 ;2.柳州市婦幼保健院,廣西 柳州 545001)
目前,結(jié)核病的確診主要依賴于病原學(xué)和分子生物學(xué)檢測,分枝桿菌培養(yǎng)陽性可作為診斷結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染和非結(jié)核分枝桿菌(NTM)感染的重要依據(jù)。有研究指出,在我國有部分肺結(jié)核患者得不到病原學(xué)診斷,只能根據(jù)臨床癥狀被認(rèn)定為疑診對(duì)象,這對(duì)于控制結(jié)核病的傳播是一大阻礙[1]。當(dāng)人體感染結(jié)核分枝桿菌后,體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)特異性效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞。致敏的T 淋巴細(xì)胞在體外再次受到結(jié)核分枝桿菌特異抗原的刺激時(shí),會(huì)分泌并釋放IFN-γ。本文對(duì)2022年1 月—6 月到我院就診且痰標(biāo)本分枝桿菌培養(yǎng)陽性患者檢測的血液雙因子(IFN-γ 和IL-2)結(jié)果進(jìn)行回顧性分析,現(xiàn)報(bào)道如下。
收集2022 年1 月—6 月到我院就診且痰標(biāo)本經(jīng)分枝桿菌培養(yǎng)分離出結(jié)核分枝桿菌的患者456 例(MTB 組)和非結(jié)核分枝桿菌感染患者75 例(NTM 組)為研究對(duì)象。MTB 組:男338 例,女118 例;年齡13 ~91 歲,平均54.8 歲。NTM 組:男46 例,女29例;年齡18 ~88 歲,平均60.9 歲。
雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測試劑盒由廣州迪澳醫(yī)療科技有限公司提供,羅氏培養(yǎng)基、抗酸染液和鑒定培養(yǎng)基(TCH 和PNB)由珠海貝索公司提供,pH 6.8的磷酸鹽緩沖液和 6% 的 NaOH 消化液等相關(guān)試劑均為本室按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》配制[2],培養(yǎng)箱由上海智誠有限公司提供。
1.3.1 血液前處理 1)采集4 ~6mL 的肝素抗凝全血,稀釋于4mL 1640 培養(yǎng)基中,再傾斜45°緩緩加入提前準(zhǔn)備的4mL 的淋巴分離液離心管中,1000g 離心20 分鐘。2)離心分離出PBMC 細(xì)胞如云霧狀,隨后吸取云霧狀細(xì)胞層到另一支重新準(zhǔn)備的15mL 離心管中,并提前加入1640 培養(yǎng)基至8mL,隨后混勻。離心機(jī)600g 離心7 分鐘。3)棄上清液并混勻沉淀,加1640 培養(yǎng)基至6mL 混勻,350g 離心7 分鐘。4)棄上清液并加500μL AIM-V 培養(yǎng)基配置適宜濃度的細(xì)胞懸液。5)每一例標(biāo)本設(shè)置3 孔分別為:陰性對(duì)照孔N,刺激蛋白孔T,陽性對(duì)照孔P;提前:N 孔加50μL AIM-V,T 孔加50μL 刺激蛋白,P 孔加50μL 陽性刺激物;每個(gè)孔加入100μL 細(xì)胞懸液,以37°及適宜濕度的5% 二氧化碳培養(yǎng)箱孵育16 ~20 小時(shí)。
1.3.2 ELASA 酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn) 取出培養(yǎng)好的樣本,吸取上清液利用雙抗夾心法進(jìn)行ELISA 檢測,得到原始OD 值,再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入該試劑盒的判讀軟件中進(jìn)行判讀。IFN-γ 的T-N(刺激蛋白的刺激值減去陰性對(duì)照的差值)≥7pg/mL 為陽性;IL-2 的T-N ≥20為陽性;IFN-γ 的T-N <7pg/mL,P-N( 陽性刺激物的刺激值減去陰性對(duì)照的差值) ≥35pg/mL 為陰性;IL-2 的T-N <20,P-N ≥130pg/mL 為陰性。
1.3.3 分枝桿菌培養(yǎng) 先用消化液將患者痰液進(jìn)行消化15min 后加緩沖液中和,3000r/min 離心30min 后取沉淀0.2mL 接種于羅氏培養(yǎng)基中, 斜放 24 小時(shí)后置于 37℃的孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng),陽性后經(jīng)萋尼氏染色確定為抗酸桿菌再用鑒定培養(yǎng)基(TCH 和PNB)進(jìn)行初步菌種鑒定,TCH 培養(yǎng)基有菌生長或無菌生長而PNB 培養(yǎng)基無菌生長判斷為結(jié)核分枝桿菌,TCH培養(yǎng)基和PNB 培養(yǎng)基均有菌生長判斷為非結(jié)核分枝桿菌。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株為H37RV。
采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示,組間比較采用χ2 檢驗(yàn);以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同方法檢測結(jié)果的一致性用kappa 檢驗(yàn)判別,kappa ≥0.75 表示具有高度一致性,kappa ≥0.4 且<0.75 表示具有較好一致性,kappa <0.4 表示具有較差一致性。
MTB 組 中 檢 測 出IFN-γ+、IL-2+ 雙 陽 性234例、IFN-γ+、IL-2- 單陽性160 例、IFN-γ-、IL-2+單陽性5 例、IFN-γ-、IL-2- 雙陰性57 例,陽性占比87.5%(399/456);NTM 組中檢測出IFN-γ+、IL-2+ 雙陽性22 例、IFN-γ+、IL-2- 單陽性15 例、IFN-γ-、IL-2+ 單陽性1 例、IFN-γ-、IL-2- 雙陰性37 例,陽性占比50.7%(38/75)。雙因子(IFN-γ和IL-2)檢測結(jié)果與分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果的一致率為81.3%(436/531)。MTB 組與NTM 組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=59.98,P<0.01)。詳見附表。
256 例IFN-γ+、IL-2+ 雙陽性患者中,有結(jié)核分枝桿菌感染234 例,占90.6% ;175 例IFN-γ+、IL-2- 單陽性患者中,有結(jié)核分枝桿菌感染160 例,占91.3% ;6 例IFN-γ-、IL-2+ 單陽性患者中,有結(jié)核分枝桿菌感染5 例,占83.3% ;94 例IFN-γ-、IL-2- 雙陰性患者中,有結(jié)核分枝桿菌感染57 例,占60.6%(399/437)。以分枝桿菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn),雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測法診斷結(jié)核分枝桿菌感染的特異度為50.7%, 敏感度為87.5%,陽性預(yù)期值為91.3%,陰性預(yù)期值為39.4%;kappa 檢驗(yàn),K=0.33,兩者具有較差一致性。詳見附表。
附表雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測與痰標(biāo)本分枝桿菌培養(yǎng)陽性結(jié)果的比較
肺結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌感染肺部引起的疾病。大多數(shù)結(jié)核分枝桿菌存在于肺部病灶壞死組織中,患者痰液中含有一定量的結(jié)核分枝桿菌,通過痰液分枝桿菌培養(yǎng)可以診斷患者是否患有結(jié)核病。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染人體后,人體主要依靠細(xì)胞免疫清除結(jié)核分枝桿菌,機(jī)體CD4+輔助性T1 淋巴細(xì)胞(Thl 細(xì)胞) 與CD8+細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL 細(xì)胞)是主要的效應(yīng)細(xì)胞。由CD4+Thl 細(xì)胞產(chǎn)生的Thl 細(xì)胞因子是抗結(jié)核感染的重要因子,其中γ-干擾素(IFN-γ)與白細(xì)胞介素(IL)-2 是兩種典型的Thl 細(xì)胞因子,在結(jié)核分枝桿菌感染后這兩種細(xì)胞因子的水平會(huì)有所變化[3-5]。本研究顯示雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測診斷結(jié)核分枝桿菌感染的陽性預(yù)期值為91.3%,敏感度為87.5%,說明大多數(shù)情況下通過IL-2 與IFN-γ 的檢測可以反映由結(jié)核分枝桿菌致敏后的Thl 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平,從而輔助診斷肺結(jié)核。
IFN-γ 是重要的細(xì)胞免疫因子, 可增強(qiáng)宿主抵御結(jié)核分枝桿菌感染的能力, 具有促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖、激活單核巨噬細(xì)胞、改善細(xì)胞免疫功能等作用[6-7]。IL-2 則是免疫調(diào)節(jié)因子,可以促進(jìn)T 細(xì)胞增殖、促進(jìn)B 細(xì)胞分泌抗體等,其免疫調(diào)節(jié)作用屬于免疫細(xì)胞增殖與應(yīng)答調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)[8]。但單個(gè)因子IFN-γ 或IL-2 檢測,無法區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和潛伏感染,其陽性結(jié)果對(duì)臨床診斷結(jié)核病的幫助不大,更多的意義在于陰性排除,但其特異度有限,在排查過程中,也易出現(xiàn)假陽性情況,臨床需要更好的免疫手段來進(jìn)行結(jié)核病的輔助診斷。本研究顯示雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測的相關(guān)特異度僅為50.7%, 這印證了此觀點(diǎn)。雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測技術(shù)是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞與融合蛋白SAT6-CFP10-Rv1985c 在細(xì)胞培養(yǎng)板上共培養(yǎng),結(jié)核病患者體內(nèi)的結(jié)核特異性 T 細(xì)胞由于記憶反應(yīng)而分泌IFN-γ 和IL-2 因子,再利用酶聯(lián)免疫吸附法,檢測培養(yǎng)上清中的IFN-γ 和IL-2 的濃度,來判斷其是否存在結(jié)核分枝桿菌特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。如果雙陽性:IFN-γ+、IL-2+,表明樣本中存在針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng),警示可能存在活動(dòng)性結(jié)核病。如果單陽性:IFN-γ+、IL-2-/IL-2+、IFN-γ-,表明樣本中存在針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng),提示結(jié)核感染。本研究MTB 組中檢測出IFN-γ+、IL-2+ 雙陽性234 例、IFN-γ+、IL-2- 單陽性160 例、IFN-γ-、IL-2+ 單陽性5 例,說明在456 例分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陽性的患者中,有51.3%(234/456)的患者通過雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測結(jié)果得到活動(dòng)性結(jié)核病警示,有87.5%(399/456)的患者得到結(jié)核感染提示。
當(dāng)樣本被污染、實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)或堪薩斯分枝桿菌、海氏分枝桿菌和蘇爾加分枝桿菌等存在交叉反應(yīng)時(shí),檢驗(yàn)結(jié)果可能出現(xiàn)假陽性。文中75 例分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為NTM 的患者中,有50.7% 的患者出現(xiàn)雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測陽性〔其中IFN-γ+、IL-2+ 雙陽性22 例、IFN-γ+、IL-2- 單陽性15 例、IFN-γ-、IL-2+ 單陽性1 例〕,相關(guān)陰性預(yù)期值僅為39.4%。有資料報(bào)道,宮頸病變、腫瘤與IFN-γ 和IL-2也呈一定的相關(guān)性[9-12]。因此,當(dāng)雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測陽性結(jié)果與臨床診斷不符時(shí),應(yīng)參照分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行鑒別診斷,不能將雙因子(IFN-γ和IL-2)檢測作為治療或其他臨床管理的唯一依據(jù),應(yīng)結(jié)合患者的臨床癥狀/ 體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果及治療反應(yīng)等情況綜合考慮[13-15]。
文中456 例分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陽性的患者中,有12.5%(57/456)的患者出現(xiàn)雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測陰性。原因可能是檢測者為陳舊性肺結(jié)核患者[16]、淋巴細(xì)胞功能異常[16]、實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)、免疫功能受損或者發(fā)生 Hook 效應(yīng)等,是否屬實(shí),需要進(jìn)一步的研究和探討。
通過雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測,解決了臨床過去存在的一些難以解決的難題,根據(jù)相關(guān)研究,特異性T 淋巴細(xì)胞分泌的IL-2 與IFN-γ 可以區(qū)分結(jié)核感染的不同階段,IL-2 能夠作為一種合適的生物標(biāo)記物用來區(qū)分結(jié)核感染患者的不同臨床階段[1,17]。“雙陽”結(jié)果能夠高度警示“活動(dòng)性結(jié)核”,提高活動(dòng)性結(jié)核和菌陰結(jié)核病的檢出率,提高非結(jié)核人群中的鑒別診斷特異性,有助于預(yù)測結(jié)核菌被激活為活動(dòng)性病變的風(fēng)險(xiǎn),但雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測容易出現(xiàn)假陰或假陽性結(jié)果,通過 kappa 檢驗(yàn),kappa值僅為0.33, 一致性較差。經(jīng)分析,kappa 值較低的主要原因是NTM 樣本檢測結(jié)果與臨床診斷不相符,本研究中將NTM 作為對(duì)照組,而雙因子檢測中對(duì)感染堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii),蘇爾加分枝桿菌(M.szulgai),海氏分枝桿菌 (M.marinum) ,戈登分枝桿菌(M.gordonae) 時(shí),可能存在交叉影響,直接導(dǎo)致部分NTM 的檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。
綜上,雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測結(jié)果陽性不能作為結(jié)核病確診證據(jù),應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)核病的醫(yī)學(xué)及診斷評(píng)估(如細(xì)菌抗酸染色涂片及培養(yǎng)、胸部X光等)。但雙因子(IFN-γ 和IL-2)檢測結(jié)果,一方面能夠很好地用于結(jié)核感染的排除,另外一方面,通過單陽向雙陽的變化,可以在一定程度上預(yù)測結(jié)核菌活動(dòng)性病變的風(fēng)險(xiǎn),還能為患者的治療過程提供監(jiān)控依據(jù)。