李月水，于橋愛，唐柳生，廖家吉，李世立★

（1.廣西壯族自治區(qū)胸科醫(yī)院，廣西 柳州 545005 ；2.柳州市婦幼保健院，廣西 柳州 545001）

目前，結(jié)核病的確診主要依賴于病原學(xué)和分子生物學(xué)檢測，分枝桿菌培養(yǎng)陽性可作為診斷結(jié)核分枝桿菌（MTB）感染和非結(jié)核分枝桿菌（NTM）感染的重要依據(jù)。有研究指出，在我國有部分肺結(jié)核患者得不到病原學(xué)診斷，只能根據(jù)臨床癥狀被認(rèn)定為疑診對(duì)象，這對(duì)于控制結(jié)核病的傳播是一大阻礙[1]。當(dāng)人體感染結(jié)核分枝桿菌后，體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)特異性效應(yīng)T 淋巴細(xì)胞。致敏的T 淋巴細(xì)胞在體外再次受到結(jié)核分枝桿菌特異抗原的刺激時(shí)，會(huì)分泌并釋放IFN-γ。本文對(duì)2022年1 月—6 月到我院就診且痰標(biāo)本分枝桿菌培養(yǎng)陽性患者檢測的血液雙因子（IFN-γ 和IL-2）結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2022 年1 月—6 月到我院就診且痰標(biāo)本經(jīng)分枝桿菌培養(yǎng)分離出結(jié)核分枝桿菌的患者456 例（MTB 組）和非結(jié)核分枝桿菌感染患者75 例（NTM 組）為研究對(duì)象。MTB 組：男338 例，女118 例；年齡13 ～91 歲，平均54.8 歲。NTM 組：男46 例，女29例；年齡18 ～88 歲，平均60.9 歲。

1.2 儀器與試劑

雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測試劑盒由廣州迪澳醫(yī)療科技有限公司提供，羅氏培養(yǎng)基、抗酸染液和鑒定培養(yǎng)基（TCH 和PNB）由珠海貝索公司提供，pH 6.8的磷酸鹽緩沖液和 6% 的 NaOH 消化液等相關(guān)試劑均為本室按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》配制[2]，培養(yǎng)箱由上海智誠有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 血液前處理 1）采集4 ～6mL 的肝素抗凝全血，稀釋于4mL 1640 培養(yǎng)基中，再傾斜45°緩緩加入提前準(zhǔn)備的4mL 的淋巴分離液離心管中，1000g 離心20 分鐘。2）離心分離出PBMC 細(xì)胞如云霧狀，隨后吸取云霧狀細(xì)胞層到另一支重新準(zhǔn)備的15mL 離心管中，并提前加入1640 培養(yǎng)基至8mL，隨后混勻。離心機(jī)600g 離心7 分鐘。3）棄上清液并混勻沉淀，加1640 培養(yǎng)基至6mL 混勻，350g 離心7 分鐘。4）棄上清液并加500μL AIM-V 培養(yǎng)基配置適宜濃度的細(xì)胞懸液。5）每一例標(biāo)本設(shè)置3 孔分別為:陰性對(duì)照孔N，刺激蛋白孔T，陽性對(duì)照孔P；提前:N 孔加50μL AIM-V，T 孔加50μL 刺激蛋白，P 孔加50μL 陽性刺激物；每個(gè)孔加入100μL 細(xì)胞懸液，以37°及適宜濕度的5% 二氧化碳培養(yǎng)箱孵育16 ～20 小時(shí)。

1.3.2 ELASA 酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn) 取出培養(yǎng)好的樣本，吸取上清液利用雙抗夾心法進(jìn)行ELISA 檢測，得到原始OD 值，再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入該試劑盒的判讀軟件中進(jìn)行判讀。IFN-γ 的T-N（刺激蛋白的刺激值減去陰性對(duì)照的差值）≥7pg/mL 為陽性；IL-2 的T-N ≥20為陽性；IFN-γ 的T-N ＜7pg/mL,P-N( 陽性刺激物的刺激值減去陰性對(duì)照的差值) ≥35pg/mL 為陰性；IL-2 的T-N ＜20，P-N ≥130pg/mL 為陰性。

1.3.3 分枝桿菌培養(yǎng) 先用消化液將患者痰液進(jìn)行消化15min 后加緩沖液中和,3000r/min 離心30min 后取沉淀0.2mL 接種于羅氏培養(yǎng)基中, 斜放 24 小時(shí)后置于 37℃的孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)，陽性后經(jīng)萋尼氏染色確定為抗酸桿菌再用鑒定培養(yǎng)基（TCH 和PNB）進(jìn)行初步菌種鑒定，TCH 培養(yǎng)基有菌生長或無菌生長而PNB 培養(yǎng)基無菌生長判斷為結(jié)核分枝桿菌，TCH培養(yǎng)基和PNB 培養(yǎng)基均有菌生長判斷為非結(jié)核分枝桿菌。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株為H37RV。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2 檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同方法檢測結(jié)果的一致性用kappa 檢驗(yàn)判別，kappa ≥0.75 表示具有高度一致性，kappa ≥0.4 且＜0.75 表示具有較好一致性，kappa ＜0.4 表示具有較差一致性。

2 結(jié)果

MTB 組 中 檢 測 出IFN-γ+、IL-2+ 雙 陽 性234例、IFN-γ+、IL-2- 單陽性160 例、IFN-γ-、IL-2+單陽性5 例、IFN-γ-、IL-2- 雙陰性57 例，陽性占比87.5%（399/456）；NTM 組中檢測出IFN-γ+、IL-2+ 雙陽性22 例、IFN-γ+、IL-2- 單陽性15 例、IFN-γ-、IL-2+ 單陽性1 例、IFN-γ-、IL-2- 雙陰性37 例，陽性占比50.7%（38/75）。雙因子（IFN-γ和IL-2）檢測結(jié)果與分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果的一致率為81.3%（436/531）。MTB 組與NTM 組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=59.98，P＜0.01)。詳見附表。

256 例IFN-γ+、IL-2+ 雙陽性患者中，有結(jié)核分枝桿菌感染234 例，占90.6% ；175 例IFN-γ+、IL-2- 單陽性患者中，有結(jié)核分枝桿菌感染160 例，占91.3% ；6 例IFN-γ-、IL-2+ 單陽性患者中，有結(jié)核分枝桿菌感染5 例，占83.3% ；94 例IFN-γ-、IL-2- 雙陰性患者中，有結(jié)核分枝桿菌感染57 例，占60.6%（399/437）。以分枝桿菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測法診斷結(jié)核分枝桿菌感染的特異度為50.7%, 敏感度為87.5%，陽性預(yù)期值為91.3%，陰性預(yù)期值為39.4%；kappa 檢驗(yàn)，K=0.33，兩者具有較差一致性。詳見附表。

附表雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測與痰標(biāo)本分枝桿菌培養(yǎng)陽性結(jié)果的比較

3 討論

肺結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌感染肺部引起的疾病。大多數(shù)結(jié)核分枝桿菌存在于肺部病灶壞死組織中，患者痰液中含有一定量的結(jié)核分枝桿菌，通過痰液分枝桿菌培養(yǎng)可以診斷患者是否患有結(jié)核病。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染人體后，人體主要依靠細(xì)胞免疫清除結(jié)核分枝桿菌，機(jī)體CD4+輔助性T1 淋巴細(xì)胞(Thl 細(xì)胞) 與CD8+細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL 細(xì)胞)是主要的效應(yīng)細(xì)胞。由CD4+Thl 細(xì)胞產(chǎn)生的Thl 細(xì)胞因子是抗結(jié)核感染的重要因子，其中γ-干擾素(IFN-γ)與白細(xì)胞介素(IL)-2 是兩種典型的Thl 細(xì)胞因子，在結(jié)核分枝桿菌感染后這兩種細(xì)胞因子的水平會(huì)有所變化[3-5]。本研究顯示雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測診斷結(jié)核分枝桿菌感染的陽性預(yù)期值為91.3%，敏感度為87.5%，說明大多數(shù)情況下通過IL-2 與IFN-γ 的檢測可以反映由結(jié)核分枝桿菌致敏后的Thl 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平，從而輔助診斷肺結(jié)核。

IFN-γ 是重要的細(xì)胞免疫因子, 可增強(qiáng)宿主抵御結(jié)核分枝桿菌感染的能力, 具有促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖、激活單核巨噬細(xì)胞、改善細(xì)胞免疫功能等作用[6-7]。IL-2 則是免疫調(diào)節(jié)因子，可以促進(jìn)T 細(xì)胞增殖、促進(jìn)B 細(xì)胞分泌抗體等，其免疫調(diào)節(jié)作用屬于免疫細(xì)胞增殖與應(yīng)答調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)[8]。但單個(gè)因子IFN-γ 或IL-2 檢測，無法區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和潛伏感染，其陽性結(jié)果對(duì)臨床診斷結(jié)核病的幫助不大，更多的意義在于陰性排除，但其特異度有限，在排查過程中，也易出現(xiàn)假陽性情況，臨床需要更好的免疫手段來進(jìn)行結(jié)核病的輔助診斷。本研究顯示雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測的相關(guān)特異度僅為50.7%, 這印證了此觀點(diǎn)。雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測技術(shù)是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞與融合蛋白SAT6-CFP10-Rv1985c 在細(xì)胞培養(yǎng)板上共培養(yǎng)，結(jié)核病患者體內(nèi)的結(jié)核特異性 T 細(xì)胞由于記憶反應(yīng)而分泌IFN-γ 和IL-2 因子，再利用酶聯(lián)免疫吸附法，檢測培養(yǎng)上清中的IFN-γ 和IL-2 的濃度，來判斷其是否存在結(jié)核分枝桿菌特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。如果雙陽性：IFN-γ+、IL-2+，表明樣本中存在針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，警示可能存在活動(dòng)性結(jié)核病。如果單陽性：IFN-γ+、IL-2-/IL-2+、IFN-γ-，表明樣本中存在針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，提示結(jié)核感染。本研究MTB 組中檢測出IFN-γ+、IL-2+ 雙陽性234 例、IFN-γ+、IL-2- 單陽性160 例、IFN-γ-、IL-2+ 單陽性5 例，說明在456 例分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陽性的患者中，有51.3%（234/456）的患者通過雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測結(jié)果得到活動(dòng)性結(jié)核病警示，有87.5%（399/456）的患者得到結(jié)核感染提示。

當(dāng)樣本被污染、實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)或堪薩斯分枝桿菌、海氏分枝桿菌和蘇爾加分枝桿菌等存在交叉反應(yīng)時(shí)，檢驗(yàn)結(jié)果可能出現(xiàn)假陽性。文中75 例分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為NTM 的患者中，有50.7% 的患者出現(xiàn)雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測陽性〔其中IFN-γ+、IL-2+ 雙陽性22 例、IFN-γ+、IL-2- 單陽性15 例、IFN-γ-、IL-2+ 單陽性1 例〕，相關(guān)陰性預(yù)期值僅為39.4%。有資料報(bào)道，宮頸病變、腫瘤與IFN-γ 和IL-2也呈一定的相關(guān)性[9-12]。因此，當(dāng)雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測陽性結(jié)果與臨床診斷不符時(shí)，應(yīng)參照分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行鑒別診斷，不能將雙因子（IFN-γ和IL-2）檢測作為治療或其他臨床管理的唯一依據(jù)，應(yīng)結(jié)合患者的臨床癥狀/ 體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果及治療反應(yīng)等情況綜合考慮[13-15]。

文中456 例分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌陽性的患者中，有12.5%（57/456）的患者出現(xiàn)雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測陰性。原因可能是檢測者為陳舊性肺結(jié)核患者[16]、淋巴細(xì)胞功能異常[16]、實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)、免疫功能受損或者發(fā)生 Hook 效應(yīng)等，是否屬實(shí)，需要進(jìn)一步的研究和探討。

通過雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測，解決了臨床過去存在的一些難以解決的難題，根據(jù)相關(guān)研究，特異性T 淋巴細(xì)胞分泌的IL-2 與IFN-γ 可以區(qū)分結(jié)核感染的不同階段，IL-2 能夠作為一種合適的生物標(biāo)記物用來區(qū)分結(jié)核感染患者的不同臨床階段[1，17]。“雙陽”結(jié)果能夠高度警示“活動(dòng)性結(jié)核”，提高活動(dòng)性結(jié)核和菌陰結(jié)核病的檢出率，提高非結(jié)核人群中的鑒別診斷特異性，有助于預(yù)測結(jié)核菌被激活為活動(dòng)性病變的風(fēng)險(xiǎn)，但雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測容易出現(xiàn)假陰或假陽性結(jié)果，通過 kappa 檢驗(yàn)，kappa值僅為0.33， 一致性較差。經(jīng)分析，kappa 值較低的主要原因是NTM 樣本檢測結(jié)果與臨床診斷不相符，本研究中將NTM 作為對(duì)照組，而雙因子檢測中對(duì)感染堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)，蘇爾加分枝桿菌(M.szulgai)，海氏分枝桿菌 (M.marinum) ，戈登分枝桿菌(M.gordonae) 時(shí)，可能存在交叉影響，直接導(dǎo)致部分NTM 的檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

綜上，雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測結(jié)果陽性不能作為結(jié)核病確診證據(jù)，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)核病的醫(yī)學(xué)及診斷評(píng)估（如細(xì)菌抗酸染色涂片及培養(yǎng)、胸部X光等）。但雙因子（IFN-γ 和IL-2）檢測結(jié)果，一方面能夠很好地用于結(jié)核感染的排除，另外一方面，通過單陽向雙陽的變化，可以在一定程度上預(yù)測結(jié)核菌活動(dòng)性病變的風(fēng)險(xiǎn)，還能為患者的治療過程提供監(jiān)控依據(jù)。