黎江溪，張世梅，王玉鑫，趙躍

（ 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，云南 大理 671000 ）

自人類基因組成功測(cè)序以來(lái)，基因編輯技術(shù)的問世為解析生物體的基因信息和功能提供了巨大的便利。常見的基因編輯技術(shù)有三種：其中最早的是鋅指核酸酶（zinc finger nucleases, ZFNs）技術(shù)，由ZFN二聚體通過DNA結(jié)合域（鋅指結(jié)構(gòu)域）識(shí)別雙鏈DNA上的靶位點(diǎn)，及FokI（核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域）行使切割功能［1］。另一種是轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator like effector nucleases, TALENs）技術(shù)，該技術(shù)的工作原理與ZFNs類似。而規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly inter spaced short palindromic repeats, CRISPR/Cas9）是最新發(fā)現(xiàn)的。CRISPR/Cas9系統(tǒng)與ZFNs、TALENs相比有著操作簡(jiǎn)單、識(shí)別位點(diǎn)多樣化、成功率高、花費(fèi)低、周期短、毒性低等優(yōu)點(diǎn)。這三種基因組編輯工具都可以切割DNA雙鏈，作為進(jìn)一步探索疾病病理生理學(xué)的理想工具而廣泛用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域［2］。

在心臟病學(xué)領(lǐng)域，與已知基因相關(guān)的疾病已得到充分研究。心臟病變常表現(xiàn)出一系列的心電功能障礙，患者最終可能出現(xiàn)進(jìn)行性心力衰竭或心臟性死亡。在所有年齡段，遺傳性心臟病都是與人類疾病相關(guān)發(fā)病率和死亡率的主要原因，且病變除心臟移植手術(shù)外無(wú)其它徹底治療方法，這給全球造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。一直以來(lái)，人們?nèi)狈ο鄬?duì)可靠的心臟疾病模型［3］，如今，在CRISPR/Cas9技術(shù)偶聯(lián)下，針對(duì)相應(yīng)的遺傳性心臟病的體內(nèi)外模型相繼問世。此外，對(duì)于遺傳性疾病，CRISPR/Cas9在基于分子的干預(yù)領(lǐng)域（如抑制DNA或DNA上的遺傳缺陷表達(dá)）取得了巨大的成功，在RNA水平也衍生了成熟的療法，如基因組編輯、外顯子跳躍、等位基因特異性沉默、RNA轉(zhuǎn)拼、基因替代療法等。因而，CRISPR/Cas9技術(shù)將引領(lǐng)人們對(duì)遺傳性心臟病的探索走向新未來(lái)。

1 CRISPR/Cas9基因技術(shù)

根據(jù)核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割機(jī)制分類，CRISPR/Cas9系統(tǒng)為IIA型系統(tǒng)［4］，組成最為簡(jiǎn)單，且準(zhǔn)確、快捷、高效、成本低，最受人們矚目。

1.1 CRISPR/Cas9的發(fā)現(xiàn)

CRISPR/Cas系統(tǒng)是存在于多數(shù)古生菌和細(xì)菌中的獲得性免疫系統(tǒng)。最早于1987年，日本科學(xué)家ISHINO等［5］在大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列。2002年，JANSEN等［6］正式將其命明為CRISPR，還以Cas來(lái)命名相關(guān)的核酸酶。2005年MOJICA和POURCEL等［7-8］發(fā)現(xiàn)CRISPR的間隔序列（spacer）和宿主菌的染色體之外的遺傳物質(zhì)高度同源，并猜測(cè)其對(duì)外源遺傳物質(zhì)有免疫作用。之后，MAKAROVA等［9］猜想CRISPR/Cas系統(tǒng)可能是細(xì)菌的適應(yīng)性防御系統(tǒng)。2007年，研究人員證明了嗜熱鏈球菌中的CRISPR/Cas系統(tǒng)是針對(duì)溶血性噬菌體的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，推測(cè)Cas9可能是干擾所需的唯一蛋白質(zhì)［10］。2008年，科研人員在表皮葡萄球菌和大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)成熟的CRISPR RNAs（crRNAs）可以與Cas9蛋白形成復(fù)合體，該復(fù)合體能干擾噬菌體的增殖，為CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)［11］。2012年，有研究表明tracrRNA對(duì)于Cas9核酸酶復(fù)合物具有重要功能，且由crRNA和tracrRNA融合成的sgRNA依舊會(huì)介導(dǎo)Cas9復(fù)合體發(fā)揮功能［12］。2013年，張峰等［13］建立了由CRISPR、tracrRNA和Cas9組成的基因調(diào)控系統(tǒng)，首次建立了小鼠疾病模型。2016年，SUZUKI等［14］通過CRISPR技術(shù)將DNA片段插入非分裂細(xì)胞中，在細(xì)胞治療等方面引起巨大反響。2020年10月，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)被授予共同開發(fā)CRISPR基因編輯工具的法國(guó)微生物學(xué)家Emmanuelle和美國(guó)生物化學(xué)家Jennifer。短短30余年，CRISPR系統(tǒng)在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域都得到了迅猛發(fā)展，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)被人們認(rèn)為是改造得最成功的基因編輯工具。

1.2 CRISPR/Cas9的組成及原理機(jī)制

CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由三部分組成，短RNA分子、指導(dǎo)RNA（gRNA）及有核酸酶活性的Cas9蛋白組成的核糖核蛋白復(fù)合物［15］（見圖1）。規(guī)范的CRISPR/Cas9系統(tǒng)充當(dāng)位點(diǎn)特異性核酸酶，對(duì)由gRNA決定的底物DNA序列進(jìn)行靶向。在CRISPR/Cas9中，指定DNA靶標(biāo)的部分不是蛋白質(zhì)本身，而是單向?qū)NA（sgRNA）分子，能夠直接設(shè)計(jì)和合成大?。?6］。Cas9蛋白的使用避免了其他DNA結(jié)合蛋白［例如鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（TALE）］每次都需要根據(jù)不同的靶DNA序列的需求重新設(shè)計(jì)的弊端。sgRNA Cas9的切割需要sgRNA（間隔序列）和protospacer（靶DNA序列）之間的序列互補(bǔ)，以及在其3'端存在合適的原間隔子序列（PAM），即CRISPR/Cas9的識(shí)別依賴于crRNA或sgRNA上的20個(gè)堿基的向?qū)蛄信c目的DNA以及PAM切割位點(diǎn)的特異性［17］（見圖2）。CRISPR/Cas9系統(tǒng)源自原核生物中適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，PAM序列的存在使該系統(tǒng)能夠區(qū)分自身和非自身的DNA靶標(biāo)［18］。當(dāng)外源性遺傳物質(zhì)入侵時(shí)，該系統(tǒng)的蛋白-RNA復(fù)合物首先與引導(dǎo)RNA的堿基配對(duì)定位在目標(biāo)DNA序列上，然后在RNA指定的基因座上產(chǎn)生天然的dsDNA斷裂（DSB）。為了響應(yīng)DSB，細(xì)胞DNA修復(fù)則會(huì)通過非同源末端連接（NHEJ）致使DNA切割位點(diǎn)的隨機(jī)插入或缺失。若存在同源DNA模板，切割位點(diǎn)周圍的DNA就可以通過同源指導(dǎo)修復(fù)（HDR）來(lái)替換。在此過程中，HDR與NHEJ相互競(jìng)爭(zhēng)，而插入缺失標(biāo)記比基因置換更為豐富［19］。科研人員在使用CRISPR/Cas9時(shí)通常首先設(shè)計(jì)一小段特異性RNA序列（single guide RNA,sgRNA）與Cas9和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子形成的融合蛋白組成復(fù)合體，然后使復(fù)合體中的sgRNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)序列與目的基因結(jié)合，之后Cas9 sgRNA復(fù)合物作為支架將效應(yīng)分子募集到相應(yīng)靶標(biāo)從而激活基因轉(zhuǎn)錄或因空間位阻阻止RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合及抑制轉(zhuǎn)錄延伸，最終Cas9利用內(nèi)切酶活性對(duì)目標(biāo)DNA序列進(jìn)行切割［20］。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成成分

圖2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的識(shí)別原理

1.3 CRISPR/Cas9的局限及改進(jìn)方法

CRISPR/Cas9作為高效的基因編輯技術(shù)，存在著一些尚待解決的問題，如備受關(guān)注的脫靶效應(yīng)、遞送系統(tǒng)等，如何提高基因編輯的準(zhǔn)確率及效率仍是科研人員關(guān)注的話題。

1.3.1 CRISPR/Cas9的局限 ①CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)CRISPR/Cas9進(jìn)行基因組編輯會(huì)產(chǎn)生DSB，從而引起易錯(cuò)的非同源末端連接DNA修復(fù)途徑，導(dǎo)致脫靶。脫靶效應(yīng)可分為三種類型［21-22］，第一種包括其他PAM（5'-NGG-3'）上具有取代或錯(cuò)配的區(qū)域；第二種涉及其他PAM上包含插入和/或缺失的區(qū)域；第三種是切割具有不同PAM位點(diǎn)的序列。目前已有多種防止脫靶斷裂的方法，包括雙切口法，F(xiàn)okI-dCas9融合蛋白法和截短sgRNA法等［23］。②CRISPR/Ca9切割位點(diǎn)的偏移和低精確修復(fù)比例CRISPR/Ca9系統(tǒng)進(jìn)行精確編輯時(shí)，會(huì)引入一段外源DNA進(jìn)行同源修復(fù)，但由于Cas9蛋白切割位點(diǎn)可能會(huì)產(chǎn)生偏移，且修復(fù)系統(tǒng)外源與DNA同源修復(fù)缺乏響應(yīng)，使得精確修復(fù)比例變低［24］。sgRNA的長(zhǎng)度和靶標(biāo)的位置也會(huì)對(duì)CRISPR/Ca9系統(tǒng)的精確性產(chǎn)生影響［25］。③PAM序列的嚴(yán)格依賴性Cas9蛋白與PAM結(jié)合對(duì)靶標(biāo)序列進(jìn)行識(shí)別時(shí)，一定程度上PAM可以限制CRISPR/Ca9系統(tǒng)對(duì)靶點(diǎn)的選擇。PAM的有限性導(dǎo)致CRISPR/Ca9系統(tǒng)不能在全基因組的任意位點(diǎn)進(jìn)行特異性切割［26］。④傳遞系統(tǒng)中的載體問題CRISPR/Ca9系統(tǒng)的運(yùn)輸主要是物理遞送及病毒遞送。物理遞送包括顯微注射、電穿孔等，常面臨遞送容量、藥理問題等［26］。病毒載體則可能引發(fā)插入誘變、免疫原性及致癌作用等相關(guān)問題。其中，腺相關(guān)病毒（AAV）是CRISPR/Cas9組件遞送的常用的選擇，但AAV能容納的貨物體積較?。?7］。⑤Cas9蛋白導(dǎo)致的宿主細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)CRISPR/Ca9系統(tǒng)能引發(fā)靶細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)，當(dāng)成分在體內(nèi)傳遞，宿主的免疫系統(tǒng)便會(huì)發(fā)生排斥［28］。與其它病毒相比，AAV的免疫原性差，能觸發(fā)免疫系統(tǒng)的各個(gè)組成部分。此外大多數(shù)人已經(jīng)接觸過腺病毒，會(huì)導(dǎo)致預(yù)先存在的適應(yīng)性反應(yīng)，這使得免疫排斥反應(yīng)更為復(fù)雜［29］。

1.3.2 CRISPR/Cas9的改進(jìn)方法 ①sgRNA的設(shè)計(jì)sgRNA與靶基因特異性結(jié)合，對(duì)于Cas9執(zhí)行靶向切割功能的效率有較大影響。對(duì)于sgRNA，取決于物種基因組的大小，可能存在較多相似的序列，這些相似的序列斷裂可能導(dǎo)致惡性腫瘤甚至死亡［30］。有關(guān)CRISPR/Cas9初步靶向的研究表明，并非gRNA中的每個(gè)核苷酸堿基都需要與靶DNA序列互補(bǔ)才能影響Cas9核酸酶活性。目前人們通常將crRNA和tracrRNA結(jié)合成一條單獨(dú)sgRNA，在早期，執(zhí)行引導(dǎo)功能的RNA是雙引導(dǎo)RNA（dual guide RNA），其中crRNA和tracrRNA分別各自表達(dá)［31］。但 sgRNA與 Cas9形成的 Cas9-sgRNA復(fù)合物比雙引導(dǎo)RNA與Cas9形成的Cas9-crRNA-tracrRNA復(fù)合物速度更快，使得用sgRNA進(jìn)行基因編輯時(shí)效率會(huì)更高。②CRISPR/Ca9運(yùn)載體的選取安全高效的運(yùn)輸載體也是CRISPR/Ca9有效應(yīng)用的重要部分。將攜帶的DNA序列傳遞到靶細(xì)胞時(shí)可采用非病毒技術(shù)，例如電穿孔，脂轉(zhuǎn)染和顯微注射［32］。顯微注射進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移被看作是金標(biāo)準(zhǔn)，傳遞效率約為100%［33］。該方法的優(yōu)點(diǎn)是效率高及對(duì)傳遞大小的限制小，缺點(diǎn)是只能在體外或離體貨物中使用。近年來(lái)，科研人員測(cè)試了基于納米粒子的創(chuàng)新傳輸系統(tǒng)，該系統(tǒng)能提供CRISPR/Cas9構(gòu)建體且最大限度地發(fā)揮相應(yīng)功效［34-35］。③CRISPR/Cas9基因靶向效率在HDR修復(fù)過程中需質(zhì)?；騿捂湽押塑账嶙鳛樾迯?fù)過程中的模板。目前HDR模板能夠被病毒或非病毒載體安全地運(yùn)送到細(xì)胞核［36］。有研究表明［37］，HDR 模板末端添加的截短的Cas9目標(biāo)序列（tCTS）與Cas9核糖核蛋白（RNP）相互作用，可使模板快速穿梭至細(xì)胞核，HDR效率提高約2～4倍。此外，用聚谷氨酸將Cas9 RNP穩(wěn)定納米顆粒，編輯效率提高約兩倍且毒性小能凍干保存。結(jié)合這兩種改進(jìn)，即使減少HDR模板劑量，也能提高基因靶向效率。

2 CRISPR/Cas9在遺傳性心臟病中的應(yīng)用

大多數(shù)遺傳性心臟疾病，如：冠心?。–HD）、肥厚型心肌?。℉CM）、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD），由單個(gè)基因或多個(gè)突變基因引發(fā)，某些神經(jīng)肌肉疾病也具有心臟疾病的特征［38-39］。盡管這些疾病具有很大的異質(zhì)性，但許多研究小組已成功鑒定出與心臟病相關(guān)的基因，這些信息能被基因組編輯技術(shù)所利用。CRISPR/Cas9技術(shù)相比其它兩種編輯技術(shù)有著突出的優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于基因的敲除或敲入標(biāo)記、大片段刪除及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，常作為探索與遺傳性心臟疾病機(jī)制及治療的重要工具。

2.1 體內(nèi)外模型中的應(yīng)用

2.1.1 體外模型 人類胚胎干細(xì)胞（hESC）的出現(xiàn)和適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)使它們成為研究特殊疾病和機(jī)制的有效工具，CRISPR/Cas9技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)等基因集的生成，在比較疾病相關(guān)和健康的同基因hPSCCM的集合時(shí)，將突變對(duì)心臟疾病進(jìn)展的影響分離［40］。在CRISPR/Cas9技術(shù)幫助下，針對(duì)遺傳心臟疾病的優(yōu)秀模型相繼問世。JAFFRé等［41］對(duì)患者來(lái)源的心肌細(xì)胞運(yùn)用CRISPR/Cas9產(chǎn)生的等基因?qū)φ読PSC來(lái)源的心肌細(xì)胞成功建立Noonan綜合征的HCM模型。LI等［42］使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除H9（hESC）細(xì)胞系上的MLP（橫紋肌相關(guān)蛋白）產(chǎn)生相應(yīng)的缺陷型，該缺陷型后發(fā)展為HCM。Roche等［43］利用 CRISPR/Cas9 在人類誘導(dǎo)的hiPSC-CMs引入了Brugada綜合征（BrS）突變，作為一種獨(dú)立于患者的遺傳背景，揭示了鈉通道失活引發(fā)BrS的機(jī)制。

此外，CRISPR/Cas9技術(shù)常用于研究各種基因或蛋白質(zhì)在遺傳性心臟疾病機(jī)制中的作用。CHANG等［44］利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了兩種FHL2基因敲除胚胎干細(xì)胞系，可用于DCM的機(jī)制研究及藥物篩選。CEHOLSKI等［45］通過構(gòu)建PLN突變hiPSC-CM細(xì)胞系，證實(shí)了該突變可導(dǎo)致心肌細(xì)胞對(duì)β受體激動(dòng)劑反應(yīng)遲緩。LI等［46］使用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)建RAD（糖尿病相關(guān)蛋白）缺陷型人類胚胎干細(xì)胞系證明了細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高和鈣調(diào)節(jié)異常是RAD缺乏導(dǎo)致心臟肥大的核心機(jī)制。XIE等［47］利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)產(chǎn)生了有關(guān)TOF（法洛四聯(lián)癥）的hESC，揭示了TOF罕見突變通過HB-EGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞衍生的心肌肥大。ANG等［48］將 iPSC和CRISPR/Cas9技術(shù)相結(jié)合，在體外建立了與GATA4基因突變相關(guān)的先天性心臟病模型，來(lái)探討該基因突變所導(dǎo)致的發(fā)病機(jī)制。MARCZENKE［49］利用 CRISPR/Cas9 與房顫相關(guān)的KCNA5基因，首次闡明了K+離子通道在心房hiPSC心肌細(xì)胞中的作用。

不僅如此，CRISPR/Cas9技術(shù)也增進(jìn)人們對(duì)遺傳性心臟病病理生理的理解。BHAGWAN等［50］利用CRISPR/Cas9切口酶靶向hiPSC中的基因座且引入遺傳編碼的鈣指示劑，使得hPSC-CMs能夠進(jìn)行實(shí)時(shí) Ca2+成像。CEHOLSKI等［51］用 CRISPR/Cas9將R9C PLN（引起DCM的心臟蛋白）突變的內(nèi)源位點(diǎn)插入沒有心血管疾病的人誘導(dǎo)hiPSC系，顯示出鈍化的β激動(dòng)劑反應(yīng)和有缺陷的鈣處理，助于更好地了解人類心肌細(xì)胞中遺傳性DCM的病理特征。SMITH等［52］利用CRISPR/Cas9技術(shù)在誘導(dǎo)的hPSC上引入某種突變產(chǎn)生了概括了許多疾病表型（異常收縮、Ca2+敏感、心律失常和肥大信號(hào)）的心肌病模型。WANG等［53］使用患者來(lái)源的hiPSC，運(yùn)用CRISPR/Cas9和組織工程技術(shù)，在組織構(gòu)建體中復(fù)制了巴氏綜合征心肌病的病理生理學(xué)。GUO等［54］開發(fā)了基于CRISPR/Cas9-AAV9的體細(xì)胞誘變的CASAAV平臺(tái)，通過該平臺(tái)分析并解剖心肌細(xì)胞。

2.1.2 體內(nèi)模型 由于衍生的心肌細(xì)胞應(yīng)用上顯示出有限的成熟度且物種來(lái)源不同，導(dǎo)致hPSCCM疾病模型無(wú)法概括多細(xì)胞完整心臟系統(tǒng)的生理復(fù)雜性，例如，代謝變化及細(xì)胞外基質(zhì)改變［55］。近年來(lái)一些研究將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用到動(dòng)物疾病模型的構(gòu)建中，避免了傳統(tǒng)的建模耗時(shí)長(zhǎng)，效率低以及定位不精準(zhǔn)等問題。其中，小鼠是最早且比較成熟的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。NAKAMURA等［56］使用CRISPR/Cas9相關(guān)DNA的血管內(nèi)遞送轉(zhuǎn)染小鼠胎兒細(xì)胞證明了小鼠胎兒心臟中基因組序列的突變確實(shí)是通過靜脈內(nèi)導(dǎo)入并轉(zhuǎn)染胚胎心臟細(xì)胞并隨后表達(dá)Cas9和gRNA誘導(dǎo)的。JOHANSEN 等［57］使用 CRISPR/Cas9和 AAV9介導(dǎo)的短鏈RNA產(chǎn)生了心肌細(xì)胞特異性Cas9小鼠，并證明Cas9表達(dá)不影響心臟功能或基因表達(dá)。LIU等［58］利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在小鼠中驗(yàn)證了引發(fā)發(fā)育不良的左心綜合征（HLHS）的雙基因，表明HLHS可以通過組合方式遺傳產(chǎn)生，從而為冠心病的復(fù)雜遺傳學(xué)提供了新的范例。ALANKARAGE 等［59］通過創(chuàng)建 CRISPR/Cas9 基因編輯的小鼠模型對(duì)從患有先天性心臟?。–HD）的患者中鑒定出的新型錯(cuò)義變異體進(jìn)行功能分析，揭示了多個(gè)先天性異常對(duì)CHD的影響。

隨著基因編輯技術(shù)的不斷進(jìn)步，CRISPR/Cas9產(chǎn)生了許多除小鼠以外的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。CHEN等［60］使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)生成的gtpbp3敲除斑馬魚，演示了gtpbp3敲除后異常的線粒體tRNA代謝，研究了Gtpbp3對(duì)線粒體生物發(fā)生和心臟功能的影響。LIANG等［61］通過CRISPR/Cas9技術(shù)在斑馬魚模型中進(jìn)一步分析了異位癥候群（HS）候選基因的功能，揭示了可能具有不同分子機(jī)制的三個(gè)潛在的HS致病基因。SASAGAWA等［62］使用CRISPR/Cas9敲除了斑馬魚中的GSTK1，發(fā)現(xiàn)在GSTK1基因敲除的斑馬魚中GSTK1的下調(diào)可能是各種病因的HCM的共同機(jī)制。SUI等［63］則通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功產(chǎn)生了有關(guān)DMD的兔模型。YU等［64］也利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功產(chǎn)生DMD的豬模型。DENIZ等［65］將CRISPR/Cas9系統(tǒng)和微型成像模態(tài)光學(xué)相干斷層掃描相結(jié)合，對(duì)非洲爪蟾等發(fā)育系統(tǒng)強(qiáng)大的生物的心臟發(fā)育進(jìn)行不同基因的分析。

2.2 基因治療中的應(yīng)用

遺傳性心臟病采用基因治療可以實(shí)現(xiàn)永久糾正，該思想最早由Clyde Keeler于1947年提出［66］。目前，全球已批準(zhǔn)2300多項(xiàng)基因編輯臨床試驗(yàn)，這些臨床實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)遺傳性疾病。而下一代測(cè)序、生物信息學(xué)分析、臨床發(fā)現(xiàn)和基礎(chǔ)研究正在不斷發(fā)現(xiàn)與心臟疾病有關(guān)的新基因，也為基因組編輯提供了新的治療靶點(diǎn)。精確的基因組編輯技術(shù)使人類的種系突變得以糾正，盡管備受爭(zhēng)議，一項(xiàng)研究在CRISPR/Cas9基礎(chǔ)上將攜帶男性患者的雜合MYBPC3突變的精子，對(duì)健康女性的卵母細(xì)胞進(jìn)行授精，發(fā)現(xiàn)攜帶HCM突變的人類胚胎中進(jìn)行高保真基因修復(fù)是可行的，該技術(shù)還消除了鑲嵌現(xiàn)象［67］。PRONDZYNSKI等［68］評(píng)價(jià) MYBPC3反式剪接和基因置換作為人iPSC衍生心肌細(xì)胞的治療選擇，報(bào)告了來(lái)自健康供體和攜帶MYBPC3截短突變的HCM患者在hiPSC-CM中使用HCM的兩種基因療法的主要可行性。

由于疾病的遺傳性和缺乏有效的療法，DMD是種系基因組編輯的有吸引力的候選疾病。BENGTSSON等［69］利用CRISPR/Cas9技術(shù)開發(fā)了多種方法來(lái)改善患有DMD的小鼠模型的病理生理，表明AAV介導(dǎo)的肌肉特異性基因編輯在DMD的治療中具有重要的潛力。MATA等［70］則通過CRISPR/Cas9技術(shù)矯正了DMD基因在狗疾病模型中的突變，并在該方法中提高了HDR介導(dǎo)的基因修復(fù)率。

不僅如此，一些不常見的遺傳性心臟疾病在治療中也成功應(yīng)用了CRISPR/Cas9技術(shù)。KANEKO等［71］通過CRISPR/Cas9進(jìn)行種系基因組編輯，以敲除嚴(yán)重心力衰竭小鼠模型中的PLN基因，結(jié)果表明被敲除的小鼠存活時(shí)間更長(zhǎng)。XIE等［72］通過實(shí)驗(yàn)表明體內(nèi)CRISPR/Cas9基因組編輯是通過選擇性破壞致病突變來(lái)治療PRKAG2心臟綜合征和其他主要遺傳性心臟病的有效工具，且結(jié)合多種測(cè)序分析，在樣品的任何測(cè)試位點(diǎn)均未檢測(cè)到脫靶和插入缺失。ZENG等［73］為馬凡氏綜合征基因治療的技術(shù)可行性提供了原理證明，他們利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)人細(xì)胞和雜合子胚胎的堿基編輯實(shí)現(xiàn)了馬凡氏綜合征病原性FBN1突變的校正。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可在細(xì)胞和生物個(gè)體水平中實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基的編輯，是最具有應(yīng)用前景的基因編輯技術(shù)。盡管CRISPR/Cas9技術(shù)廣泛用于基因的敲除或敲入標(biāo)記、大片段刪除及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，成為了探索與遺傳性疾病病理機(jī)制的重要工具。但由于CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)還存在一些問題需要我們?nèi)ソ鉀Q，如脫靶效應(yīng)能導(dǎo)致未敲除目的基因，反而破壞了其他基因，最終造成癌癥的發(fā)生及一些毒副作用。因此，CRISPR/Cas9技術(shù)在遺傳疾病領(lǐng)域的臨床應(yīng)用還面臨一定的挑戰(zhàn)。但通過科學(xué)家的努力，CRISPR/Cas9技術(shù)正在不斷的被改進(jìn)和優(yōu)化，未來(lái)對(duì)遺傳性心臟疾病的機(jī)制研究及臨床治療中將得到廣泛的應(yīng)用，最終攻克遺傳性心臟病的治療難題，為更多的遺傳性疾病患者帶來(lái)福音。