林司杭 周文斌

暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 深圳市人民醫(yī)院甲乳外科，廣東深圳 518020

BRCA1/2基因突變可以導(dǎo)致乳腺癌、卵巢癌等風(fēng)險(xiǎn)增加。BRCA1和BRCA2突變攜帶者患乳腺癌累積風(fēng)險(xiǎn)分別為72%和69%，對(duì)側(cè)乳腺癌累積發(fā)病率分別高達(dá)83%和62%；15%～22%的卵巢癌由BRCA1/2基因突變導(dǎo)致，且終身危險(xiǎn)度由1%～2%升至60%～70%；BRCA1/2突變攜帶者的一級(jí)親屬患前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)是正常人群1.7倍；故BRCA1/2基因檢測(cè)對(duì)癌癥的早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)后等有重要意義[1]。

目前攜有BRCA突變癌癥患者可從鉑類藥物及腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑等獲益。研究表明鉑類藥物可延長(zhǎng)BRCA突變攜帶者的無進(jìn)展生存期。攜帶BRCA1/2胚系突變的三陰性乳腺癌患者對(duì)鉑類藥物較敏感，而對(duì)紫杉醇類藥物有抗性。在Ⅲ期試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)BRCA1/2胚系突變的三陰性乳腺癌患者對(duì)鉑類藥物客觀反應(yīng)率及無進(jìn)展生存期均高于紫杉醇。2018年1月美國(guó)批準(zhǔn)奧拉帕尼（Olaparib）治療攜帶BRCA突變的人表皮生長(zhǎng)因子受體2（epidermal growth factor receptor 2，HER-2）陰性的轉(zhuǎn)移性乳腺癌。Ⅲ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)奧拉帕尼組可降低攜有BRCA1/2突變的轉(zhuǎn)移性激素受體陽性或三陰性乳腺癌患者42%的疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)、延長(zhǎng)無進(jìn)展生存期約2.8個(gè)月[2-3]。

BRCA1/2基因檢測(cè)技術(shù)歷經(jīng)了低通量的第一代測(cè)序、高通量二代測(cè)序，再到如今單分子第三代測(cè)序。三代測(cè)序在不同時(shí)代背景下開發(fā)出來，有各自優(yōu)缺點(diǎn)。第一代測(cè)序盡管有成本高、低通量、應(yīng)用局限等缺點(diǎn)，但目前仍為基因檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。二代測(cè)序則彌補(bǔ)一代測(cè)序的不足，具備測(cè)序速度快、通量高等優(yōu)勢(shì)。但也存在短讀長(zhǎng)的技術(shù)短板。三代測(cè)序最大特點(diǎn)是能單分子測(cè)序，具有讀長(zhǎng)變長(zhǎng)、測(cè)序時(shí)間減少等優(yōu)勢(shì)。且不需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這能有效避免PCR偏好性導(dǎo)致的錯(cuò)誤測(cè)序[4-5]。

對(duì)于BRCA突變陽性患者，由于國(guó)內(nèi)外人群特征、醫(yī)療水平、臨床指南不同等原因，導(dǎo)致BRCA1/2基因檢測(cè)應(yīng)用有所差異。筆者將綜合闡述當(dāng)前BRCA基因應(yīng)用的最新進(jìn)展，從而可以更好地為精準(zhǔn)醫(yī)療服務(wù)。

1 BRCA1/2變異測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷程

在過去的20年內(nèi)，每一代基因測(cè)序在規(guī)模、通量等都有了極大的發(fā)展。1975年Frederick Sanger發(fā)明的“雙脫氧鏈終止法”及Walter Gilbert在1977年提出的“化學(xué)測(cè)序法”，意味著第一代測(cè)序出現(xiàn)。

一代測(cè)序存在通量低、成本較高等問題，無法滿足當(dāng)前分子生物學(xué)等對(duì)于高通量、高效率、高產(chǎn)出的測(cè)序需求，從而衍生出如今的二代測(cè)序。2005年Roche公司推出以焦磷酸合成測(cè)序法為原理的454平臺(tái)，其利用乳膠系統(tǒng)對(duì)DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，避免了傳統(tǒng)方法的煩瑣步驟，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模并行測(cè)序。Life Technologies公司在2008年推出的半導(dǎo)體測(cè)序很快在外國(guó)測(cè)序市場(chǎng)響應(yīng)，ABI公司SOLiD測(cè)序受其影響逐漸沒落。華大基因作為中國(guó)本地測(cè)序公司，在2014年發(fā)明了二代測(cè)序儀器—BGISEQ-1000型號(hào)，其優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在大規(guī)模DNA測(cè)序和小RNA分析，但轉(zhuǎn)錄組分析的性能仍需進(jìn)一步完善[6-8]。

2010年前后，可滿足長(zhǎng)讀長(zhǎng)和快速測(cè)序的三代測(cè)序平臺(tái)開始興起。2008年Helicos Bioscience公司發(fā)明的Heliscope測(cè)序平臺(tái)以單分子測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)；同年，ONT公司推出新型納米孔單分子測(cè)序儀器，因?yàn)闄C(jī)器還不穩(wěn)定，還需反復(fù)檢測(cè)，故還不能投入市場(chǎng)；Pacific Bioscience測(cè)序平臺(tái)2009年發(fā)明的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)可以對(duì)特定的模板進(jìn)行檢測(cè)，滿足實(shí)時(shí)測(cè)序的需求[9]。

2 BRCA1/2一代基因測(cè)序平臺(tái)原理和優(yōu)缺點(diǎn)

Sanger測(cè)序法，又稱第一代測(cè)序技術(shù)，釆用直接測(cè)序的方法對(duì)各堿基熒光標(biāo)記進(jìn)行DNA序列分析，方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果直觀。至今仍作為各基因突變檢測(cè)方法的金標(biāo)準(zhǔn)。一代測(cè)序檢測(cè)片段最長(zhǎng)可達(dá)800～1000 bp，且有很高精確度，可達(dá)99.999%。一代測(cè)序由于對(duì)于長(zhǎng)片段基因操作上較難實(shí)現(xiàn)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、消耗大量成本等問題，限制了其廣泛應(yīng)用。

3 BRCA1/2二代基因測(cè)序平臺(tái)原理和優(yōu)缺點(diǎn)

下一代測(cè)序技術(shù)即二代測(cè)序，是當(dāng)前適合BRCA基因變異的檢測(cè)技術(shù)。二代測(cè)序可未知序列時(shí)，對(duì)DNA片段進(jìn)行測(cè)序；可同時(shí)檢測(cè)多基因來指導(dǎo)腫瘤的早期預(yù)防及給予患者更加精準(zhǔn)的個(gè)體化治療。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)外二代測(cè)序平臺(tái)參差不齊，有各自優(yōu)劣勢(shì)，在臨床及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)有不可替代的地位[10-11]。

3.1 Roche/454測(cè)序平臺(tái)

Roche公司推出以邊合成邊測(cè)序技術(shù)為原理的454焦磷酸測(cè)序，是當(dāng)前第一臺(tái)較為穩(wěn)定的測(cè)序平臺(tái)，其主要采用焦磷酸測(cè)序法。該項(xiàng)測(cè)序技術(shù)的測(cè)序原理大致為將模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，與相應(yīng)的引物、DNA聚合酶等共同孵育進(jìn)行酶促反應(yīng)。在酶促反應(yīng)中，會(huì)釋放出焦磷酸基團(tuán)和產(chǎn)生光信號(hào)，然后被電荷耦合元件光學(xué)系統(tǒng)捕捉并讀取DNA序列信息。該平臺(tái)精確度較高、耗時(shí)間較短和效率高。由于測(cè)序成本較高，限制了其在市場(chǎng)的普及。

3.2 Life/SOLiD測(cè)序平臺(tái)

SOLiD平臺(tái)原理為連接法和雙堿基編碼。在測(cè)序過程更換引物及替代了之前的聚合酶連接反應(yīng)，雙堿基編碼對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤進(jìn)行校正，來提高測(cè)序的精準(zhǔn)度。與GS FLX測(cè)序相像，在PCR擴(kuò)增和構(gòu)建文庫(kù)上，都用磁珠接頭來檢測(cè)DNA序列。不一樣的方面是SOLiD平臺(tái)的磁珠比GS FLX小得多。當(dāng)前SOLiD系統(tǒng)稱其測(cè)序準(zhǔn)確度大于99.94%[12]。

3.3 Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)

Ion Torrent的核心技術(shù)為半導(dǎo)體技術(shù)。測(cè)序大致是將DNA鏈錨定在半導(dǎo)體芯片的微孔上，然后加入堿基，過程會(huì)釋放出氫離子。通過對(duì)H+的檢測(cè)，實(shí)時(shí)判讀堿基。Ion Torrent平臺(tái)可測(cè)定DNA片段的合成，減少了CCD掃描等操作，從而耗時(shí)短。檢測(cè)H+可以大大提高堿基判讀精準(zhǔn)性，同時(shí)測(cè)序成本較低；其劣勢(shì)為讀長(zhǎng)較短及測(cè)序準(zhǔn)確率不高[13]。

3.4 華大基因CG平臺(tái)

CG平臺(tái)測(cè)序原理為DNA納米芯片技術(shù)，測(cè)序大致為將DNA納米球錨定在芯片上，然后通過探針錨定分子連接技術(shù)來檢測(cè)DNA序列。CG平臺(tái)推出的從頭拼接技術(shù)，能夠檢測(cè)等位基因雜合子突變，其靈敏性高；為降低探針和酶的濃度，平臺(tái)利用的是組合探針錨定連接法技術(shù)。其優(yōu)勢(shì)為可一次性讀取數(shù)個(gè)堿基，減少耗時(shí)。每次檢測(cè)都不因前一次測(cè)序結(jié)果影響，所以不會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤累積。但讀長(zhǎng)較短是其不可避免的短板。

3.5 不同二代測(cè)序平臺(tái)的比較分析

不同二代測(cè)序平臺(tái)各有特點(diǎn)，在通量、讀長(zhǎng)、準(zhǔn)確率及成本等各有表現(xiàn)。羅氏454作為最早測(cè)序儀，讀長(zhǎng)較長(zhǎng)，運(yùn)行較快。但成本較高、錯(cuò)誤率也較高；SOLiD測(cè)序儀用于外顯子和基因突變測(cè)序，測(cè)序準(zhǔn)確率較高，然而讀長(zhǎng)較短，運(yùn)行較慢，目前已淡出市場(chǎng)；Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)準(zhǔn)確率較高，測(cè)序成本低，但讀長(zhǎng)較短。若單個(gè)堿基出現(xiàn)得多則產(chǎn)生許多的H+，使pH值降低，導(dǎo)致測(cè)序不精確；華大基因CG平臺(tái)堿基讀取完全獨(dú)立，可降低錯(cuò)誤率，且價(jià)格低，不足之處為讀長(zhǎng)較短。

4 BRCA1/2三代基因測(cè)序平臺(tái)原理和優(yōu)缺點(diǎn)

2008年，三代測(cè)序技術(shù)誕生。彌補(bǔ)了第二代短讀長(zhǎng)，無法完整解析復(fù)雜重復(fù)序列的短板。三代測(cè)序不需要依賴PCR技術(shù)，測(cè)序壓縮至數(shù)小時(shí)內(nèi)。其最大特點(diǎn)為單分子測(cè)序技術(shù)。但目前仍處于技術(shù)發(fā)展期，其堿基識(shí)別準(zhǔn)確度仍有較高錯(cuò)誤率且成本較高，限制其大規(guī)模應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)外占主流的三代測(cè)序平臺(tái)有SMRT測(cè)序、納米孔SMS測(cè)序平臺(tái)、SMS測(cè)序平臺(tái)及SFRET測(cè)序平臺(tái)[14-15]。

4.1 Heliscope測(cè)序平臺(tái)

Helicos Bioscience公司的單分子測(cè)序平臺(tái)，其推出市場(chǎng)上第一個(gè)三代測(cè)序儀，主要原理為邊合成邊測(cè)序（sequencing by synthesis，SBS）技術(shù)，測(cè)序步驟大致為：①將DNA大片段剪成小片段后加尾；②含接頭的文庫(kù)通過末端尾巴固定在探針完成裝載；③延伸DNA模板鏈，并釋放熒光信號(hào)；④電荷耦合元件收集光學(xué)信號(hào)。其避免了擴(kuò)增時(shí)引入錯(cuò)配堿基以及擴(kuò)增偏好性[16]。但存在短讀長(zhǎng)的技術(shù)短板，且設(shè)備要求較高。目前尚未得到廣泛的應(yīng)用。

4.2 SMRT測(cè)序平臺(tái)

SMRT測(cè)序是目前使用率較高的技術(shù)。零級(jí)波導(dǎo)的納米結(jié)構(gòu)和dNTP熒光標(biāo)記為其檢測(cè)基礎(chǔ)。在構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，模板與引物結(jié)合，將熒光標(biāo)記的dNTP加入微反應(yīng)器延伸DNA模板鏈，設(shè)備收集熒光信號(hào)和測(cè)序。該平臺(tái)在讀長(zhǎng)上實(shí)現(xiàn)了較大的突破，讀長(zhǎng)能達(dá)到30 kb。且對(duì)GC重復(fù)區(qū)、堿基修飾區(qū)保持高識(shí)別精確率。其短板為過分依賴單分子釋放的熒光信號(hào)，從而檢測(cè)精確率較低，僅為87.5%。

4.3 納米孔SMS平臺(tái)

2014年，英國(guó)ONT公司推出MinION測(cè)序平臺(tái)，測(cè)序大致步驟：①馬達(dá)蛋白與接頭連接在待測(cè)模板一端；②帶有接頭的DNA及混合物加載至流動(dòng)池；③馬達(dá)蛋白將雙鏈DNA解旋為單鏈通過納米孔；④不同堿基產(chǎn)生不同電信號(hào)，由傳導(dǎo)電子元件等處理和確定堿基信息。

4.4 FRET測(cè)序平臺(tái)

FRET平臺(tái)測(cè)序大致過程為標(biāo)記的脫氧核苷酸分子隨著測(cè)序引物延長(zhǎng)會(huì)釋放熒光信號(hào)，由熒光收集設(shè)備收集和測(cè)序。該平臺(tái)測(cè)序時(shí)長(zhǎng)較短，且讀長(zhǎng)較長(zhǎng)。測(cè)序準(zhǔn)確率相對(duì)于其他三代測(cè)序平臺(tái)較高。由于該儀器缺乏具體的應(yīng)用參數(shù)，目前尚未得到廣泛應(yīng)用[17]。

4.5 不同三代測(cè)序平臺(tái)的比較分析

由于各三代測(cè)序平臺(tái)建數(shù)據(jù)庫(kù)和儀器原理等存在差異，導(dǎo)致通量、讀長(zhǎng)、測(cè)序準(zhǔn)確率以及成本等有差異。當(dāng)前三代測(cè)序共存特點(diǎn)為不依賴PCR構(gòu)建文庫(kù)、成本低、讀長(zhǎng)長(zhǎng)及耗時(shí)短；Heliscope測(cè)序?yàn)榈谝粋€(gè)商品化的平臺(tái)，其技術(shù)短板為短讀長(zhǎng)，且測(cè)序過程中信號(hào)較弱容易產(chǎn)生測(cè)序誤差，導(dǎo)致準(zhǔn)確率降低，從而限制其應(yīng)用；MinION測(cè)序平臺(tái)讀長(zhǎng)長(zhǎng)、檢測(cè)周期較短為其優(yōu)勢(shì)，但該測(cè)序儀器錯(cuò)誤率較高，準(zhǔn)確率僅65%～88%，目前該測(cè)序平臺(tái)尚未得到廣泛的應(yīng)用。納米孔SMS平臺(tái)由傳導(dǎo)電子元件等處理和確定堿基信息，讀長(zhǎng)可達(dá)10 kb。由于堿基前進(jìn)速度具有隨機(jī)性，間隔太短時(shí)堿基識(shí)別易錯(cuò)失，導(dǎo)致較高錯(cuò)誤率，準(zhǔn)確率僅為65%～88%，限制了其應(yīng)用。FRET測(cè)序平臺(tái)耗時(shí)短，且檢測(cè)精確率較其他平臺(tái)較高，缺乏具體應(yīng)用參數(shù)，故應(yīng)用范圍極少[18]。

5 各代測(cè)序平臺(tái)比較

三代測(cè)序技術(shù)在不同時(shí)代開發(fā)出來，有各自優(yōu)缺點(diǎn)。相比二、三代測(cè)序，一代測(cè)序釆用直接測(cè)序，操作簡(jiǎn)易，且有極高的精確度，可達(dá)99.999%。目前仍作為各基因突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，可驗(yàn)證其他檢測(cè)篩查出來的變異。然而，對(duì)于長(zhǎng)片段基因，操作上較難實(shí)現(xiàn)，消耗大量時(shí)間和成本。

相比一代測(cè)序，NGS方法測(cè)序通量更高、應(yīng)用領(lǐng)域更廣，能檢測(cè)BRCA基因的全部外顯子，能完成各種突變類型的分析。但有不少問題，譬如，PCR一定程度提高假陽性率，且具有測(cè)序偏好性。其次，目前很多機(jī)構(gòu)開展NGS檢測(cè)，但檢測(cè)服務(wù)良莠不齊，質(zhì)量難以保證。

三代測(cè)序最大特點(diǎn)是單分子測(cè)序，相比前兩代測(cè)序，改善有：①讀長(zhǎng)變長(zhǎng)；②測(cè)序流程簡(jiǎn)化，測(cè)序時(shí)間短；③避免PCR造成的擴(kuò)增偏好；④可測(cè)定堿基修飾情況。其短板為檢測(cè)錯(cuò)誤率較高、技術(shù)不成熟，且分析數(shù)據(jù)過分依賴軟件處理[19]。

6 國(guó)內(nèi)外BRCA1/2基因檢測(cè)比較

①相比于美國(guó)、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家，目前國(guó)內(nèi)BRCA1/2基因檢測(cè)比例非常低，就乳腺癌患者來說，檢測(cè)比例不超過10%，大部分集中于大醫(yī)院，而中小醫(yī)院基本沒有做，部分中小醫(yī)院醫(yī)生甚至不知道其意義，以及不知如何提供遺傳咨詢和預(yù)防措施；②目前國(guó)內(nèi)尚無中國(guó)人群的突變數(shù)據(jù)庫(kù)，國(guó)內(nèi)醫(yī)院或者外部檢測(cè)機(jī)構(gòu)評(píng)估BRCA1/2基因是否突變，主要參考國(guó)外的大樣本數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)，而非國(guó)內(nèi)人群的突變數(shù)據(jù)庫(kù)。由于國(guó)內(nèi)外人群的差異，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性尚待商榷；③國(guó)內(nèi)醫(yī)院很少BRCA1/2基因檢測(cè)。大部分為外部檢測(cè)公司承包，檢測(cè)水平參差不齊，尚無質(zhì)控部門對(duì)結(jié)果進(jìn)行把關(guān)，故結(jié)果穩(wěn)定性不足；④國(guó)內(nèi)不管醫(yī)院還是外部檢測(cè)公司，測(cè)序平臺(tái)、變體解釋等方面存在巨大差異，差異可以歸因于國(guó)內(nèi)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室缺乏標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的檢測(cè)指南[20]。

7 目前BRCA1/2基因檢測(cè)的現(xiàn)狀及存在的問題

目前基因檢測(cè)存有不少的局限與弊端。①對(duì)BRCA1/2的認(rèn)識(shí)不夠透徹，如5%的BRCA突變基因類型為未知變異，與疾病的關(guān)系也未知，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)論不確定；②國(guó)內(nèi)外指南對(duì)BRCA突變的解讀不一致，導(dǎo)致部分結(jié)論存在爭(zhēng)議；③國(guó)內(nèi)BRCA1/2基因檢測(cè)采用不同方法，可能導(dǎo)致結(jié)果不一致；④由于腫瘤具有異質(zhì)性，譬如不同腫瘤細(xì)胞之間的基因突變譜不同等，故每一次結(jié)論可能存在差異[21]。

8 BRCA1/2基因突變攜帶者預(yù)防性措施

癌癥患者通過BRCA1/2基因檢測(cè)確定攜有BRCA基因突變。目前這些患者可以通過保乳治療、預(yù)防性乳房切除手術(shù)及預(yù)防性雙側(cè)輸卵管卵巢切除術(shù)等來改善預(yù)后。國(guó)內(nèi)專家認(rèn)為保乳術(shù)后同側(cè)殘余乳腺組織和對(duì)側(cè)乳腺組織仍有較高的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，在術(shù)后給予充分輔助治療及隨訪的前提下可進(jìn)行保乳手術(shù)[22]。

BRCA1、BRCA2和非BRCA1/2致病變異攜帶者患對(duì)側(cè)乳腺癌的年平均風(fēng)險(xiǎn)分別為4.0%、2.9%和1.9%。國(guó)內(nèi)專家認(rèn)為如果組織學(xué)分級(jí)、細(xì)胞增殖指數(shù)較高，且激素受體表達(dá)陰性，可以考慮對(duì)側(cè)乳房預(yù)防性切除手術(shù)來提高患者預(yù)后[23]。

國(guó)內(nèi)外專家一致認(rèn)為預(yù)防性雙側(cè)乳腺切除術(shù)可以有效降低BRCA突變基因攜帶者乳腺癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。由于我國(guó)患者群體BRCA基因突變數(shù)據(jù)不夠完善、接受程度有限以及存在手術(shù)相關(guān)并發(fā)癥的原因，在進(jìn)行全面多學(xué)科評(píng)估，包括乳房檢查、雙側(cè)鉬靶和MRI檢查等前提下，可以考慮此術(shù)式[24]。

攜有BRCA1/2致病基因的乳腺癌患者行預(yù)防性雙側(cè)輸卵管卵巢切除術(shù)可將健康突變攜帶者患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)降低到1%～2%，總病死率降低到25%，提高總體存活率。絕經(jīng)前婦女行預(yù)防性雙側(cè)輸卵管卵巢切除術(shù)可以降低50%的乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)患對(duì)側(cè)乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)可以降低30%～50%[25]。

9 總結(jié)

隨著當(dāng)前技術(shù)的進(jìn)展，BRCA1/2檢測(cè)越來越多在臨床應(yīng)用，在指導(dǎo)臨床實(shí)踐、進(jìn)行遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、抉擇治療方案和判斷預(yù)后中起決策性作用。相信未來隨著對(duì)BRCA1/2基因突變的認(rèn)知加深及檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步完善，BRCA基因檢測(cè)結(jié)果的判定會(huì)越來越準(zhǔn)確，可以更好地為精準(zhǔn)醫(yī)療服務(wù)。