萬(wàn)人靜 李瓊 周新成 李論 李甜甜 周俊飛 李莎 彭海 章偉雄 方治偉

摘??要：MNP（multiple?nucleotide?polymorphism，?MNP）是隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)。靶向測(cè)序基因型技術(shù)（genotyping?by?target?sequencing，?GBTS）在一個(gè)擴(kuò)增子內(nèi)僅擴(kuò)增一個(gè)SNP位點(diǎn)，MNP基于GBTS可在一個(gè)擴(kuò)增子內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)SNP位點(diǎn)。該技術(shù)具有成本低、檢測(cè)效率高、應(yīng)用靈活、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，MNP標(biāo)記可用于育種過(guò)程的鑒定。為了建立快速、精準(zhǔn)、高效的木薯品種鑒定方法，篩選適用于木薯品種鑒定的MNP分子標(biāo)記，本研究在全基因組范圍內(nèi)篩選高多態(tài)性區(qū)域并設(shè)計(jì)引物，最終在全基因范圍內(nèi)獲得623個(gè)木薯MNP標(biāo)記位點(diǎn)，并利用28個(gè)木薯品種對(duì)木薯MNP標(biāo)記進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，MNP標(biāo)記分型重現(xiàn)性高達(dá)100%。MNP標(biāo)記位點(diǎn)在28個(gè)木薯品種中檢出（4.07±1.68）種等位基因型，最多具有12種等位基因型。對(duì)所有木薯品種進(jìn)行兩兩比較時(shí)，99.47%（376/378）的品種對(duì)間的差異大于46%，比例在0.3%～81.0%之間，均值為71.78%。相較于SNP，MNP具有更好的品種區(qū)分能力。綜上所述，本研究所開(kāi)發(fā)的木薯MNP分子標(biāo)記具有較高的重現(xiàn)性、多態(tài)性和品種區(qū)分能力，可廣泛用于木薯的種質(zhì)資源多樣性、新品種培育及品種鑒定等研究。

關(guān)鍵詞：木薯；分子標(biāo)記；MNP；品種鑒定中圖分類號(hào)：S667.9??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Application?of?Cassava?MNP?Markers?in?Variety?Identification

WAN?Renjing1，2，?LI?Qiong3，?ZHOU?Xincheng4，?LI?Lun1，2，?LI?Tiantian1，2，?ZHOU?Junfei1，2，?LI?Sha5，6，?PENG?Hai1，2，?ZHANG?Weixiong2，7，?FANG?Zhiwei1，2*

1.?School?of?Life?Science，?Jianghan?University，?Wuhan，?Hubei?430056，?China;?2.?Institute?for?Systems?Biology，?Jianghan?University，?Wuhan，?Hubei?430056，?China;?3.?Tropical?Crops?Genetic?Resources?Institute，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences，?Haikou，?Hainan?571101，?China;?4.?Institute?of?Tropical?Bioscience?and?Biotechnology，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences，?Haikou，?Hainan?571101，?China;?5.?Hubei?Key?Laboratory?of?Three?Gorges?Project?for?Conservation?of?Fishes，?Yichang，?Hubei?443100，?China;?6.?Chinese?Sturgeon?Research?Institute，?China?Three?Gorges?Corporation，?Yichang，?Hubei?443100，?China;?7.?Faculty?of?Health?and?Social?Sciences，?The?Hong?Kong?Polytechnic?University，?Hong?Kong?100872，?China

Abstract：?MNP?（multiple?nucleotide?polymorphism，?MNP）?is?a?new?molecular?marker?technology?emerged?with?the?development?of?molecular?marker?technology.?While?genotyping?by?target?sequencing?（GBTS）?amplifies?only?one?SNP?site?in?one?amplicon，?MNP?can?amplify?multiple?SNP?sites?simultaneously?in?one?amplicon?based?on?GBTS.?This?technology?has?the?features?of?low?cost，?high?detection?efficiency，?flexible?application?and?wide?adaptability，?Compared?with?SNP，?MNP?has?better?ability?to?differentiate?varieties.?In?order?to?establish?a?rapid，?accurate?and?efficient?method?for?cassava?variety?identification?and?to?screen?MNP?molecular?markers?suitable?for?cassava?variety?identification，?this?study?screened?highly?polymorphic?regions?and?designed?primers?in?the?whole?genome?range，?and?finally?obtained?623?cassava?MNP?marker?loci?in?the?whole?genome?range，?the?cassava?MNP?markers?were?evaluated?using?28?cassava?varieties.?The?results?showed?that?the?MNP?marker?typing?reproducibility?was?up?to?100%.?4.07±1.68?alleles?were?detected?in?28?cassava?varieties，?with?a?maximum?of?12?alleles.?When?all?cassava?varieties?were?compared?one?by?a?one，?99.47%?（376/378）?of?the?differences?between?pairs?were?greater?than?46%，?with?the?proportion?ranging?from?0.3%?to?81.0%，?with?a?mean?value?of?71.78%.?Meanwhile，?MNP?markers?can?be?used?for?identification?in?the?breeding?process.?In?conclusion，?the?cassava?MNP?molecular?markers?developed?in?this?study?have?high?reproducibility，?polymorphism?and?variety?differentiation?ability，?and?could?be?widely?used?for?research?on?germplasm?diversity，?new?variety?breeding?and?variety?identification?of?cassava.

Keywords：?cassava;?molecular?marker;?MNP;?variety?identification

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.007

木薯（Manihot?esculenta?Crantz）又名樹(shù)薯，為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot），在熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛栽植。木薯是全球三大薯類作物之一，也是第六大糧食作物，享有“淀粉之王”的盛譽(yù)[1]。木薯的用途非常廣泛，一方面木薯可作為優(yōu)質(zhì)雜糧，世界上有近8億人以木薯為糧食[2]；另一方面，木薯還可以被加工成不同的工業(yè)產(chǎn)品，例如淀粉和酒精[3]，是發(fā)展?jié)摿薮蟮哪茉粗参铩?/p>

木薯為異花授粉植物，基因型高度雜合[4]，倍性復(fù)雜，制約了傳統(tǒng)分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。在以往的研究中，應(yīng)用于木薯的分子標(biāo)記技術(shù)主要有相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related?amplified?polymorphism，?SRAP）[5-6]、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple?sequence?repeat，?SSR）[7-11]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified?fragment?length?polymorphism，?AFLP）[12-13]、目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（start?codon?targeted?polymorphism，?SCoT）[14]、單核苷酸多態(tài)性（single?nucleotide?polymorphism，?SNP）[8，15-16]。這些分子標(biāo)記技術(shù)在分子標(biāo)記的多態(tài)性、檢測(cè)的標(biāo)記數(shù)量以及檢測(cè)效率等一個(gè)或多個(gè)方面存在不足。如凝膠電泳是AFLP和SSR最常用的檢測(cè)方法，這種方法難以大規(guī)模、高通量地應(yīng)用于大量樣品的檢測(cè)和分型；雖然最近也有將高通量測(cè)序技術(shù)用于SSR的高通量檢測(cè)和分型的報(bào)道，但是受到DNA聚合酶滑脫的影響，SSR在雜交種和多倍體物種的準(zhǔn)確分型仍然是一個(gè)難點(diǎn)[17]。SNP是另一個(gè)目前最常用的分子標(biāo)記之一，由于SNP多是二態(tài)性的，因此單個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)多態(tài)性不高，需要檢測(cè)大量SNP位點(diǎn)彌補(bǔ)這一缺陷。目前主要檢測(cè)手段有高通量測(cè)序和芯片法2種，這2種方法在檢測(cè)成本和檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性上尚有待提高。一段基因組區(qū)域內(nèi)由多個(gè)SNP位點(diǎn)共同組合為一個(gè)標(biāo)記的新型分子標(biāo)記技術(shù)，即MNP標(biāo)記技術(shù)，提高了單分子標(biāo)記的多態(tài)性；利用擴(kuò)增子測(cè)序方法在提高測(cè)序深度的同時(shí)又降低測(cè)序成本，實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確性和效益的雙贏。該技術(shù)已形成國(guó)標(biāo)并用于水稻、玉米、棉花等16種作物的品種鑒定。目前尚沒(méi)有MNP標(biāo)記技術(shù)在木薯中的研究和報(bào)道。本研究在木薯全基因組范圍內(nèi)篩選MNP分子標(biāo)記位點(diǎn)，并利用收集到的28個(gè)木薯品種對(duì)開(kāi)發(fā)的木薯MNP標(biāo)記進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1??材料與方法

1.1??材料

供試的28份木薯栽培品種均來(lái)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，品種名稱以及編號(hào)見(jiàn)表1。

1.2??方法

1.2.1??MNP位點(diǎn)開(kāi)發(fā)??基于前期收集的241份木薯材料的SNP信息，在全基因組范圍內(nèi)篩選MNP標(biāo)記位點(diǎn)。首先通過(guò)Bowite?2軟件將241份木薯的全基因組數(shù)據(jù)比對(duì)到木薯的參考基因組Mes culenta_305_v6（下載地址為ftp：//cassavabase.org/?Manihot_v6.1/）上，比對(duì)參數(shù)全部采用默認(rèn)值。比對(duì)完成后，采用samtools?sort軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果排序并轉(zhuǎn)存為bam格式文件，通過(guò)“-@?6-m?2G”參數(shù)設(shè)定排序時(shí)使用6個(gè)線程，內(nèi)存指定用2?Gb。利用samtools?mpile軟件鑒定出所有的SNP位點(diǎn)，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)數(shù)值。獲得全部的SNP位點(diǎn)后，通過(guò)窗口平移的方式在全基因組范圍內(nèi)尋找候選的標(biāo)記位點(diǎn)。具體操作為：選定一個(gè)125?bp的基因組區(qū)域，統(tǒng)計(jì)該區(qū)域內(nèi)的SNP的數(shù)量，以及該區(qū)域?qū)?41份木薯的區(qū)分度（discriminative?power，DP）。區(qū)分度的計(jì)算方法為DP=n/N，n指所有材料兩兩比較時(shí)可以區(qū)分的樣品對(duì)數(shù)，N指的是比較的總樣品對(duì)數(shù)。若該區(qū)域含有≥3個(gè)SNP位點(diǎn)，且區(qū)分度>0.2，則該區(qū)域作為候選MNP標(biāo)記位點(diǎn)。然后向前滑動(dòng)20?bp，重新計(jì)算上述指標(biāo)。對(duì)所有獲得候選MNP標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行物種特異性檢查，保留物種特異性最好的作為最終的MNP標(biāo)記位點(diǎn)。MNP引物由石家莊博瑞迪生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2??基因組DNA的提取與純化??將每個(gè)品種進(jìn)行至少10個(gè)單株葉片混合取樣并用液氮充分研磨成粉末后采用CTAB法抽提基因組DNA。利用核酸定量?jī)xQubit檢測(cè)DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.2.3??多重PCR擴(kuò)增與文庫(kù)構(gòu)建??通過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增的方法構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)。第一輪為多重PCR擴(kuò)增，目的是富集目標(biāo)片段，其擴(kuò)增體系為：引物混合物4?μL（10?μmol/L），DNA模板（20～?200?ng）x?μL，GenoPlexs?3×T?Master?Mix?10?μL，ddH2O?（16–x）μL。PCR反應(yīng)程序：95?℃預(yù)變性5?min；95?℃變性20?s，60?℃退火延伸4?min，循環(huán)15次；72?℃最后延伸10?min，10?℃保溫結(jié)束反應(yīng)。使用磁珠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，方法參照說(shuō)明書(shū)。第二輪PCR目的對(duì)PCR產(chǎn)物添加測(cè)序接頭，其擴(kuò)增體系為：接頭引物F（5?μmol/L）2?μL，接頭引物R（5?μmol/L）2?μL，DNA模板（第一輪PCR純化產(chǎn)物）16?μL，GenoPlexs?3×T?Master?Mix?10?μL。PCR反應(yīng)程序：95?℃預(yù)變性3?min；95?℃?15?s，58?℃?15?s，70?℃?30?s，循環(huán)8次；72?℃最后延伸5?min，10?℃保溫結(jié)束反應(yīng)。用Qubit檢測(cè)文庫(kù)濃度，用瓊脂糖凝膠檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量。正常文庫(kù)濃度在10?ng/μL以上，且電泳條帶單一，大小在300?bp左右。采用NovaSeq?6000進(jìn)行雙末端測(cè)序，單端讀長(zhǎng)為150?bp，測(cè)序由諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.2.4??測(cè)序片段比對(duì)與MNP標(biāo)記分型??測(cè)序片段比對(duì)、MNP標(biāo)記分型與樣品間比較參見(jiàn)FANG等[18]的方法，其具體流程簡(jiǎn)述如下：對(duì)于每一個(gè)樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)，首先利用Bowtie?2（version?2.1.0）軟件將測(cè)序片段比對(duì)到參考基因組上。對(duì)于每個(gè)MNP位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)該位點(diǎn)上檢測(cè)到的所有等位基因型以及支持該等位基因型的測(cè)序片段數(shù)目，即該等位基因型的豐度。豐度最高的等位基因型是該位點(diǎn)的主等位基因型。若主等位基因型的豐度大于20，則認(rèn)為該位點(diǎn)成功檢出。與主等位基因型的豐度比值大于0.2的其他等位基因型均記為可信等位基因型。對(duì)于每一個(gè)MNP位點(diǎn)，若2個(gè)樣品間的等位基因型相同，則認(rèn)為這2個(gè)樣品在該MNP標(biāo)記位點(diǎn)無(wú)差異。若同一MNP標(biāo)記位點(diǎn)在2次重復(fù)中的分型結(jié)果無(wú)差異，則認(rèn)為該位點(diǎn)分型結(jié)果可重現(xiàn)。重現(xiàn)率R=m/M，m指不可重現(xiàn)的MNP標(biāo)記位點(diǎn)總數(shù)，M指重復(fù)間比較的MNP的標(biāo)記位點(diǎn)總數(shù)。準(zhǔn)確性A=1–（1–R）/2。采用perl腳本統(tǒng)計(jì)每個(gè)MNP位點(diǎn)的等位基因型數(shù)、群體內(nèi)雜合子所占比率（observed?heterozy gosity，?Ho）以及區(qū)分度。為了全面與SNP技術(shù)進(jìn)行比較，利用bcftools（Version?1.5）工具從測(cè)序數(shù)據(jù)中獲取每個(gè)樣品的SNP標(biāo)記分型結(jié)果。分別基于MNP和SNP分型結(jié)果，兩兩比較樣品間，統(tǒng)計(jì)共同檢出位點(diǎn)以及差異位點(diǎn)數(shù)（基因型存在差異的位點(diǎn)）。

2??結(jié)果與分析

2.1??木薯MNP位點(diǎn)篩選

利用已公布的241份木薯的SNP信息，成功設(shè)計(jì)出623個(gè)MNP標(biāo)記位點(diǎn)。如圖1A所示，所設(shè)計(jì)的位點(diǎn)均勻分布在18個(gè)染色體上（圖1A）。MNP標(biāo)記長(zhǎng)度范圍在186～274?bp之間（圖1B），絕大多數(shù)位點(diǎn)（427個(gè)）的長(zhǎng)度位于270～274?bp之間。每個(gè)MNP位點(diǎn)包含2～26個(gè)高頻SNP（MAF>5%，平均9.06個(gè)，圖1C）。

2.2??木薯MNP位點(diǎn)的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性分析

28個(gè)樣品的56個(gè)文庫(kù)共獲得11.5?Gb測(cè)序數(shù)據(jù)，獲得31?422個(gè)MNP標(biāo)記分型結(jié)果，平均每個(gè)MNP標(biāo)記有900.68倍的覆蓋深度。為了評(píng)估MNP標(biāo)記法在木薯中的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，分別比較了每份木薯樣品的重復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（表2）。共15?644個(gè)MNP標(biāo)記位點(diǎn)在2次重復(fù)中均檢出，其中可重現(xiàn)的位點(diǎn)15?644個(gè)，重現(xiàn)性為100%，分型準(zhǔn)確性為100%。

2.3??木薯MNP位點(diǎn)的多態(tài)性和品種區(qū)分能力

在28份木薯品種中，每個(gè)MNP標(biāo)記位點(diǎn)檢出的等位基因型數(shù)目在1～12之間，平均檢出（4.07±1.68）種等位基因型，其中237個(gè)位點(diǎn)含有5種以上等位基因型（圖2）。在本研究中，MNP位點(diǎn)的觀測(cè)雜合率（Ho）在0～96.43%之間，平均值為50.61%，較高的雜合率顯示本次檢測(cè)樣本的遺傳背景較為廣泛。

為了評(píng)估MNP標(biāo)記對(duì)木薯樣品的區(qū)分能力，將樣品進(jìn)行兩兩比較，統(tǒng)計(jì)兩兩樣品間分型結(jié)果有差異的MNP標(biāo)記位點(diǎn)比例，如圖3所示。在本次供試的28個(gè)品種中，任意2個(gè)品種間的差異位點(diǎn)比例在0.3%～81.0%之間（均值為71.78%），99.47%（376/378）的品種對(duì)間的差異大于46%；單個(gè)MNP標(biāo)記的平均區(qū)分度為0.68，其中5個(gè)位點(diǎn)（MSH0091、MSH0338、MSH0470、MSH0498和MSH0557）具有極高區(qū)分度，能將95%以上的樣本區(qū)分開(kāi)。

2.4??MNP標(biāo)記用于木薯育種過(guò)程鑒定

我國(guó)的木薯品種主要通過(guò)引進(jìn)國(guó)外品種或地方資源進(jìn)行雜交選育獲得。如木薯品種SC5是通過(guò)SC8013和ZM8625的雜交后代選育而成[19]。比較兩樣品的MNP分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SC5和SC8013共同檢出534個(gè)位點(diǎn)，其中532個(gè)位點(diǎn)（99.63%）具有相同的等位基因型，這與已知的品種培育過(guò)程一致。

2.5??基于SNP標(biāo)記的重現(xiàn)性和品種區(qū)分能力

為了比較SNP技術(shù)在本次供試木薯品種間的區(qū)分能力，從擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)中獲取每個(gè)樣品的SNP標(biāo)記分型結(jié)果，28個(gè)木薯品種共檢出6189個(gè)SNP位點(diǎn)；基于這些SNP位點(diǎn)比較重復(fù)實(shí)驗(yàn)中同一樣品分型結(jié)果的一致性，以及不同樣品間的差異位點(diǎn)比例。如圖4所示，相同樣品2次重復(fù)之間的差異可達(dá)2.23%～5.34%，整體分子標(biāo)記的重現(xiàn)率為96.53%；不同樣品的SNP差異位點(diǎn)比例在2.72%～50.05%之間，平均值為43.19%。

3??討論

本研究首次在木薯中進(jìn)行MNP分子標(biāo)記技術(shù)的開(kāi)發(fā)，獲得了623個(gè)MNP標(biāo)記位點(diǎn)。這些位點(diǎn)均勻分布在木薯的18條染色體上，因而理論上可以用于表征全基因組水平上的遺傳特征?；?8個(gè)木薯品種的評(píng)價(jià)結(jié)果表明，這批分子標(biāo)記位點(diǎn)具有較高的多態(tài)性和品種區(qū)分能力，且分型結(jié)果達(dá)到了100%重現(xiàn)，是非常理想的分子標(biāo)記技術(shù)。從多態(tài)性來(lái)看，單個(gè)MNP標(biāo)記最高有12種等位基因型，平均4.07個(gè)，這與目前已經(jīng)報(bào)道的小麥的單個(gè)SSR的等位基因型數(shù)量相當(dāng)[19-20]。從區(qū)分度看，平均每個(gè)MNP標(biāo)記位點(diǎn)可以區(qū)分68%的品種對(duì)，5個(gè)潛在的核心位點(diǎn)可以區(qū)分95%的品種對(duì)；整體來(lái)看，任意2個(gè)木薯品種間平均有71.78%的位點(diǎn)分型結(jié)果有差異，實(shí)現(xiàn)了品種間高度區(qū)分。相較而言，基于SNP標(biāo)記的分型，任意2個(gè)木薯品種間平均差異僅為43.19%。從重現(xiàn)性來(lái)看，MNP分子標(biāo)記技術(shù)的重現(xiàn)性達(dá)到了100%，遠(yuǎn)高于SSR和SNP的重現(xiàn)性[21-22]。由此可見(jiàn)，相較于傳統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)，MNP標(biāo)記技術(shù)在分子標(biāo)記的多態(tài)性、分型結(jié)果重現(xiàn)性以及品種區(qū)分能力等指標(biāo)表現(xiàn)出了良好的綜合性能。同時(shí)，采用多重PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序相結(jié)合的方法實(shí)現(xiàn)MNP標(biāo)記分型，提高了MNP標(biāo)記技術(shù)高通量、大規(guī)模的快速、準(zhǔn)確分型的能力，在提高測(cè)序深度的同時(shí)又降低測(cè)序成本，實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確性和效益的雙贏。

除了基礎(chǔ)理論研究外，遺傳分子標(biāo)記技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中也有大量的應(yīng)用場(chǎng)景，如對(duì)不同種質(zhì)資源和栽培品種的區(qū)分、對(duì)冒牌種子和侵權(quán)品種、實(shí)質(zhì)性派生品種的判定等。這些應(yīng)用場(chǎng)景往往與品種的管理和執(zhí)法相關(guān)，因此要求分子標(biāo)記技術(shù)必須具有極高的分型準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性以及檢測(cè)位點(diǎn)多、品種區(qū)分能力強(qiáng)。然而，對(duì)于木薯這種倍性復(fù)雜以及高度雜合的物種，傳統(tǒng)的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)難度大，可用的標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)量少，檢測(cè)的準(zhǔn)確性難以滿足應(yīng)用需求。本研究中開(kāi)發(fā)的MNP分子標(biāo)記技術(shù)有效解決了上述問(wèn)題，具備用于木薯品種真實(shí)性鑒定和實(shí)質(zhì)性派生品種鑒定的能力，可為木薯品種選育、打假與維權(quán)以及品種權(quán)保護(hù)提供重要技術(shù)支撐。

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