姚艷麗 吳嚴(yán) 李明偉 付瓊 劉勝輝 朱祝英 張秀梅

摘??要：水心病是一種菠蘿果實(shí)生理性病害，導(dǎo)致菠蘿果肉組織的細(xì)胞間隙充滿細(xì)胞液而呈現(xiàn)出水漬狀，嚴(yán)重影響果實(shí)的食用價(jià)值和商品價(jià)值。水心病已困擾菠蘿產(chǎn)業(yè)發(fā)展多年，但其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。為了探討菠蘿水心病的發(fā)病機(jī)理，本研究以菠蘿主栽品種巴厘為材料，采用石蠟切片的方法對(duì)菠蘿果實(shí)水心病發(fā)生過(guò)程及正常果和水心病果不同組織部位（花托、心皮、果序軸）進(jìn)行顯微觀察。結(jié)果顯示：菠蘿果肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)與水心病密切相關(guān)：正常果實(shí)果肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間隙明顯，維管束形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，韌皮部細(xì)胞排列緊密整齊，木質(zhì)部導(dǎo)管排列規(guī)則；而水心病果實(shí)果肉細(xì)胞受擠壓變形，細(xì)胞壁破裂導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，維管束形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，韌皮部擠壓變形，木質(zhì)部導(dǎo)管破壞形成一個(gè)空腔，隨著水心病的發(fā)病進(jìn)程加深，木質(zhì)部空腔越大。通過(guò)對(duì)正常果實(shí)和水心病果實(shí)不同組織部位的形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)不同組織部位水心病導(dǎo)致的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化基本一致，不同組織部位維管束形態(tài)結(jié)構(gòu)存在明顯差異，果序軸和花托部位的維管束符合單子葉植物維管束的典型特征，在每個(gè)維管束的外圍，有厚壁機(jī)械組織組成的維管束鞘所包圍。而在維管束兩端，厚壁細(xì)胞更多。維管束鞘的里面為初生韌皮部和初生木質(zhì)部，無(wú)束中形成層。而心皮部位的維管束結(jié)構(gòu)則為非典型結(jié)構(gòu)，大多數(shù)維管束外圍無(wú)維管束鞘包圍。不同組織部位以果序軸的維管組織最發(fā)達(dá)，其次是花托，心皮的維管束組織最不發(fā)達(dá)。此結(jié)果揭示了菠蘿水心病發(fā)生過(guò)程中的組織形態(tài)變化，可為水心病發(fā)生機(jī)理的深入研究提供參考。

關(guān)鍵詞：菠蘿；水心?。患?xì)胞結(jié)構(gòu)；石蠟切片；維管束中圖分類號(hào)：S667.9??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Analysis?and?Microscopic?Observation?of?Paraffin?Sections?of?Pineapple?Pulp?in?Watercore

YAO?Yanli1，2，3，4，?WU?Yan1，2，3，?LI?Mingwei1，2，3，?FU?Qiong1，2，3，?LIU?Shenghui1，2，3，?ZHU?Zhuying1，2，3，?ZHANG?Xiumei1，2，3*

1.?South?Subtropical?Crop?Research?Institute，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences，?Zhanjiang，?Guangdong?524013，?China;?2.?Key?Laboratory?of?Tropical?Fruit?Biology，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?Zhanjiang，?Guangdong?524013，?China;?3.?Key?Laboratory?of?Hainan?Province?for?Postharvest?Physiology?and?Technology?of?Tropical?Horticultural?Products，?Zhanjiang，?Guangdong?524013，?China;?4.?Zhanjiang?Experimental?Station，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences，?Zhanjiang，?Guangdong?524013，?China

Abstract：?Watercore?is?a?kind?of?physiological?disease?of?pineapple?fruit，?which?causes?the?intercellular?space?of?pineapple?pulp?tissue?to?be?filled?with?cell?fluid?and?appear?as?water-soaked，?which?seriously?affects?the?edible?value?and?commercial?value?of?the?fruit.?Watercore?has?troubled?the?development?of?pineapple?industry?for?many?years，?but?its?mechanism?is?not?clear.?In?order?to?explore?the?pathogenesis?of?watercore?in?pineapple，?this?study?took?the?main?pineapple?cultivar?Comte?de?paris?as?the?material，?the?paraffin?section?method?was?used?to?observe?the?process?of?watercore?in?pineapple?fruit?and?the?different?tissue?parts?of?normal?and?watercore?fruit?（flower?stock，?carpel，?fruit?sequence?axis）.?The?results?showed?that?the?cell?structure?of?pineapple?pulp?was?closely?related?to?watercore：?the?cell?structure?of?normal?fruit?pulp?was?complete，?the?cell?space?was?obvious，?the?vascular?bundle?was?intact，?the?phloem?cells?were?arranged?tightly?and?neatly，?and?the?xylem?ducts?were?arranged?regularly.?However，?fruit?flesh?cells?in?watercore?are?squeezed?and?deformed，?and?the?cell?wall?rupture?results?in?incomplete?cell?structure，?destruction?of?vascular?bundle?morphology，?extrusion?and?deformation?of?phloem，?and?destruction?of?xylem?ducts?to?form?a?cavity.?With?the?deepening?of?the?onset?process?of?watercore，?the?xylem?cavity?becomes?larger.?Through?the?morphological?observation?of?different?tissue?parts?of?normal?fruits?and?fruit?with?watercore，?it?was?found?that?the?changes?of?cell?structure?caused?by?watercore?in?different?tissue?parts?were?basically?the?same.?There?were?obvious?differences?in?vascular?bundle?morphology?and?structure?in?different?tissue?parts.?The?vascular?bundles?in?the?fruit?sequence?axis?and?receptacle?were?in?accordance?with?the?typical?characteristics?of?vascular?bundles?in?monocotyledons.?The?vascular?bundles?were?surrounded?by?a?sheath?composed?of?thick-walled?mechanical?tissue?at?the?periphery?of?each?vascular?bundle.?On?the?other?hand，?there?were?more?sachmatous?cells?at?both?ends?of?the?vascular?bundle.?The?inner?part?of?the?vascular?bundle?sheath?contains?primary?phloem?and?primary?xylem?without?the?middle?bundle?cambium.?The?vascular?bundle?structure?of?the?carpel?was?atypical，?and?most?of?the?vascular?bundles?were?not?surrounded?by?vascular?sheath.?Vascular?tissues?in?the?fruit?sequence?axis?were?the?most?developed，?followed?by?receptacle，?and?vascular?tissues?in?the?carpel?were?the?least?developed.?These?results?revealed?the?morphological?changes?of?pineapple?watercore?during?its?occurrence?and?provided?reference?for?further?research?on?the?mechanism?of?watercore.

Keywords：?pineapple;?watercore;?cell?structure;?paraffin?section;?vascular?bundle

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.017

菠蘿（Ananas?comosus）是熱帶和亞熱帶地區(qū)最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。菠蘿水心病是菠蘿采前普遍發(fā)生的一種生理性病害，主要表現(xiàn)為果肉細(xì)胞間隙充滿液體而呈現(xiàn)水浸狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)散發(fā)出酒糟味和惡臭味，導(dǎo)致品質(zhì)劣變，失去食用價(jià)值，嚴(yán)重地影響了果實(shí)的商品價(jià)值。水心病已成為決定菠蘿果實(shí)品質(zhì)的主要限制因子，也是影響我國(guó)菠蘿產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素。目前，對(duì)菠蘿水心病發(fā)生機(jī)制的研究主要集中在水心病的誘導(dǎo)因素及生理生化特征變化上，總的來(lái)說(shuō)，導(dǎo)致水心病發(fā)生的主要因素有5個(gè)：（1）異常溫度。菠蘿采前2～4周高溫或低溫脅迫，水心病顯著增加[1-2]。（2）植物激素。在菠蘿生產(chǎn)中，赤霉素（GA3）被廣泛用于增大果實(shí)大小。然而，外源施用GA3可使菠蘿水心病的發(fā)生率增加。（3）礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)缺乏。果實(shí)鈣含量低被認(rèn)為是造成水心病的重要原因?；ê髧娛┾}、硅肥可降低水心病的發(fā)生[3]。（4）糖代謝。在菠蘿果實(shí)發(fā)育后期，果肉中細(xì)胞壁蔗糖酶高活性增加卸載至果肉非原生質(zhì)體中的蔗糖，從而導(dǎo)致非原生質(zhì)體溶質(zhì)濃度增加（溶質(zhì)勢(shì)降低），水滲透進(jìn)非原生質(zhì)體而導(dǎo)致水心病的發(fā)生[4]。（5）冠芽。菠蘿采收前1～2個(gè)月去除冠芽，水心病發(fā)病率增加；冠芽越大，水心病越低[5]。但也有研究表明，去除冠芽對(duì)水心病的發(fā)生無(wú)顯著影響[6]?，F(xiàn)有研究表明，溫度、鈣、冠芽及糖積累與糖代謝酶活性與水心病的發(fā)生相關(guān)，類似的因素也已被證明與蘋(píng)果和梨的水心病發(fā)生有關(guān)[7-9]，但尚未得出統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，使得菠蘿水心病仍未得到有效控制，在很大程度上降低了菠蘿果實(shí)的商品價(jià)值。所以，探明菠蘿水心病發(fā)生的機(jī)制對(duì)于預(yù)測(cè)和防止水心病的發(fā)生具有重要理論和實(shí)際意義。本文對(duì)菠蘿水心病果實(shí)不同組織及其發(fā)病過(guò)程的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，以期明確水心病果實(shí)不同組織及發(fā)病過(guò)程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，為菠蘿水心病發(fā)生機(jī)理研究及有效防治提供理論依據(jù)。

1??材料與方法

1.1??材料

以菠蘿主栽品種巴厘為試驗(yàn)材料，于2022年3—5月在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所菠蘿種質(zhì)資源鑒定圃采集。于謝花后60?d開(kāi)始取樣，每7?d取樣1次，至果實(shí)成熟。挑選無(wú)機(jī)械損傷、大小基本一致、無(wú)病蟲(chóng)害的菠蘿果實(shí)9個(gè)，立即帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2??方法

沿果實(shí)縱徑切開(kāi)后觀察水心病的發(fā)病情況，分別選取胎座、花托和果芯3個(gè)部位（圖1），切成0.5?cm左右的小塊，立即用70%?FAA固定液固定（不少于組織10倍體積）。石蠟切片制作步驟如下：

（1）脫水。采用趙俊等[10]的方法并有所改進(jìn)，將固定好的果實(shí)樣品用梯度乙醇（50%、70%、80%、95%、100%）進(jìn)行脫水，每個(gè)梯度30?min。

（2）透明。脫水后的樣品采用二甲苯進(jìn)行透明處理，乙醇與二甲苯（體積比分別為3∶1，1∶1，1∶3）各級(jí)時(shí)間均為1.5?h→二甲苯（2次），每次1?h。

（3）浸蠟。二甲苯與石蠟（體積比1∶1）42?℃?1～2?d→二甲苯與石蠟（體積比1∶1）48?℃?2?h→二甲苯與石蠟（體積比1∶3）50?℃?2?h→石蠟（2次），60?℃，每次1?h。

（4）包埋。將浸蠟透明的果肉組織置于組織包埋機(jī)（Arcadia）中進(jìn)行包埋，包埋后材料自然冷卻。

（5）切片。將石蠟包埋好的果肉組織塊用Kd1508冷凍石蠟二用切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度為10?μm。

（6）脫蠟。采用二甲苯和乙醇的梯度溶液對(duì)切片進(jìn)行脫蠟處理。二甲苯2次（每次20?min）→乙醇和二甲苯（體積比1∶1）（2?min）→100%乙醇2次（每次2?min）→95%乙醇（1?min）→80%乙醇（1?min）→70%乙醇（1?min）→50%乙醇（1?min）→30%乙醇（1?min）→15%乙醇（1?min）→蒸餾水漂洗2次（每次1?min）。

（7）染色。脫蠟完成后，將載玻片放入0.5%甲苯胺藍(lán)溶液中染色0.5～1?h，然后反順序進(jìn)行脫蠟步驟即可。

（8）封片。采用加拿大樹(shù)膠封片，37～40?℃恒溫箱種過(guò)夜烘干。

（9）觀察。采用蔡司NIKON?80i生物顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察拍照，分析細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)變化。其中，P表示薄壁細(xì)胞，S表示厚壁細(xì)胞，Xy表示木質(zhì)部，Xd表示木質(zhì)部導(dǎo)管，Xc表示原生木質(zhì)部空腔，Ph表示韌皮部。

2??結(jié)果與分析

2.1??菠蘿水心病發(fā)病過(guò)程顯微觀察

石蠟切片觀察菠蘿果實(shí)花托部位細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，花托組織中維管束排列稀疏，在每個(gè)維管束的外圍，有厚壁機(jī)械組織組成的維管束鞘所包圍。而在維管束兩端，厚壁細(xì)胞更多。維管束鞘的里面為初生韌皮部和初生木質(zhì)部，無(wú)束中形成層，菠蘿果肉細(xì)胞的這種維管束特征屬于有限維管束，并符合單子葉植物維管束的典型特征。

如圖2所示，謝花后60?d果實(shí)發(fā)育正常，維管束形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，木質(zhì)部導(dǎo)管排列整齊，導(dǎo)管壁清晰可見(jiàn)，其周圍薄壁細(xì)胞細(xì)胞壁較平滑，細(xì)胞偏圓形，細(xì)胞間隙明顯（圖2A、圖2B）。謝花后67?d果實(shí)水心病發(fā)生在中部小果的果腔壁上（主要由心皮發(fā)育而來(lái)），花托部位無(wú)水心病發(fā)生，維管束形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，周圍薄壁細(xì)胞呈長(zhǎng)圓形，細(xì)胞間隙不明顯（圖2C、圖2D）。謝花后74?d果實(shí)水心病進(jìn)一步加深，整個(gè)果實(shí)小果的果腔壁上均有水心病的發(fā)生，花托部位有輕度水心病發(fā)生，維管束中木質(zhì)部導(dǎo)管遭到破壞，其四周的薄壁細(xì)胞互相分離，形成了一個(gè)氣隙或稱原生木質(zhì)部空腔（圖2E、圖2F）。謝花后81?d果實(shí)水心病進(jìn)一步加重，整個(gè)果肉均有水心病發(fā)生，維管束結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，木質(zhì)部腔隙增大，其周圍薄壁細(xì)胞中大部分細(xì)胞的細(xì)胞壁降解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整（圖2G、圖2H）。

2.2??水心病對(duì)菠蘿花托組織的細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)影響

分別選取正常果和水心病果同一位置的花托組織進(jìn)行切片觀察，結(jié)果顯示，正常果實(shí)花托組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間隙明顯，維管束形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，韌皮部細(xì)胞排列緊密整齊，僅在木質(zhì)部外側(cè)有分布，木質(zhì)部導(dǎo)管排列規(guī)則（圖3A、圖3B）。水心病果實(shí)花托組織果肉細(xì)胞變形，細(xì)胞壁出現(xiàn)解體，細(xì)胞自溶形成空洞。維管束形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，木質(zhì)部形成一個(gè)空腔（圖3C、圖3D）。

2.3??水心病對(duì)菠蘿心皮組織的細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)影響

石蠟切片觀察菠蘿正常果實(shí)和水心病果實(shí)同一位置心皮組織顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，水心病果實(shí)心皮組織與正常果實(shí)心皮組織的薄壁細(xì)胞形態(tài)基本一致，但正常組織中的薄壁細(xì)胞細(xì)胞間隙明顯，而水心病心皮組織中細(xì)胞間隙不明顯，這是由于細(xì)胞壁降解物質(zhì)在間隙暫時(shí)積累的緣故。正常果實(shí)中維管束形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，木質(zhì)部導(dǎo)管排列整齊，韌皮部在木質(zhì)部?jī)蓚?cè)均有分布，形成雙韌維管束（圖4A、圖4B）。水心病果實(shí)中維管束類型同正常果實(shí)中的一樣，也為雙韌維管束，但其韌皮部斷裂分散，木質(zhì)部具有空腔（圖4C、圖4D）。

2.4??水心病對(duì)菠蘿果序軸組織的細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)影響

石蠟切片觀察菠蘿正常果實(shí)和水心病果實(shí)果序軸組織顯微結(jié)構(gòu)，如圖5顯示，正常果實(shí)果序軸組織薄壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞壁平滑偏圓形，而水心病果實(shí)中薄壁細(xì)胞細(xì)胞壁幾乎全部解體，細(xì)胞自溶形成大片空洞。與花托和心皮組織中維管束相比，果序軸中的維管束發(fā)達(dá)且數(shù)量多。正常果實(shí)中維管束形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，韌皮部細(xì)胞排列緊密整齊，僅在木質(zhì)部外側(cè)有分布，木質(zhì)部導(dǎo)管排列規(guī)則，與花托組織中維管束形態(tài)基本一致（圖5A、圖5B）。水心病果實(shí)中韌皮部被擠壓變形，木質(zhì)部導(dǎo)管排列紊亂具有空腔，與花托和心皮中的結(jié)構(gòu)特征相似（圖5C、圖5D）。

3??討論

現(xiàn)有研究認(rèn)為水心病是一種由不利環(huán)境條件引發(fā)的生理失調(diào)，而不是由病原菌引起，但發(fā)病機(jī)理尚不清楚[11]。INOMATA等[12]研究表明，水心病的發(fā)生與果實(shí)成熟和成熟過(guò)程有很大關(guān)系，并伴隨糖積累和細(xì)胞壁成分的改變，例如果膠多糖，在許多水果的成熟和軟化過(guò)程中，已經(jīng)觀察到果膠多糖的溶解和解聚作用[13-15]。CHUN等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在日本梨水心病嚴(yán)重組織中CDTA-可溶性果膠和4%?KOH可溶性半纖維素多糖的分子質(zhì)量降解和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞。本研究發(fā)現(xiàn)，水心病菠蘿果實(shí)果肉細(xì)胞細(xì)胞壁降解，導(dǎo)致細(xì)胞溶液漏入細(xì)胞間隙，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，而正常果實(shí)果肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，與在日本梨上的研究結(jié)果基本一致。

果實(shí)內(nèi)物質(zhì)積累與其水分運(yùn)輸密切相關(guān)，水分循環(huán)帶動(dòng)著果實(shí)內(nèi)碳水化合物、礦質(zhì)元素等的積累。維管束是果實(shí)水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ?，其形態(tài)結(jié)構(gòu)直接影響著物質(zhì)的運(yùn)輸與積累，從而影響果實(shí)的發(fā)育和品質(zhì)形成[17]。有研究表明，果實(shí)維管束中木質(zhì)部結(jié)構(gòu)和功能的喪失導(dǎo)致木質(zhì)部運(yùn)輸速率下降[18]。對(duì)桃果實(shí)縫合線軟化與維管束形態(tài)結(jié)構(gòu)的關(guān)系研究表明，隨著桃果炭的發(fā)育，腺腔（空腔）不斷擴(kuò)大，腺腔內(nèi)含物含量也逐漸增多，且認(rèn)為腺腔可能起著多糖積累點(diǎn)的作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)菠蘿正常果實(shí)維管束形態(tài)結(jié)構(gòu)保持完整，無(wú)原生木質(zhì)部空腔，而水心病菠蘿果實(shí)中維管束形態(tài)結(jié)構(gòu)遭到破壞，木質(zhì)部導(dǎo)管解體而形成一個(gè)空腔，且隨著水心病發(fā)病程度的加深而增大，表明果實(shí)中輸導(dǎo)組織的改變導(dǎo)致物質(zhì)運(yùn)輸能力的改變，細(xì)胞代謝紊亂，從而導(dǎo)致水心病的發(fā)生。

4??結(jié)論

石蠟切片顯微結(jié)構(gòu)觀察表明，菠蘿水心病的發(fā)生與果肉細(xì)胞細(xì)胞壁破裂和維管束形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞密切相關(guān)。

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