周 艷，趙存朝，楊舒雯，陶 亮，田 洋

（1.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 大理 671003；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650500；3.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650031）

辣木（Moringa oleifera Lam） 為辣木科辣木屬植物，是一種具有獨特經(jīng)濟價值的熱帶植物[1]，2012 年，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會將辣木葉批準(zhǔn)為新食品原料[2]。研究表明，辣木葉含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素，以及鉀、鈣、鐵等礦質(zhì)元素，黃酮、酚類、有機酸等多種活性物質(zhì)[3]。根據(jù)國內(nèi)外的研究文獻報道，辣木葉干粉中鈣含量高達2 500～3 000 mg/100 g，比同量牛乳中鈣含量高約4 倍[4]。同時，辣木具有調(diào)節(jié)血壓、降血糖、抗氧化、抑菌消炎、抗癌及增強免疫等生理功效[5-6]，可開發(fā)成辣木保健飲料、乳飲料、畜禽飼料和魚飼料等。

鈣作為一種極其重要的常量元素，占人體體重的1.2%～1.5%，在機體的物質(zhì)代謝及生命的維持過程中發(fā)揮著重要作用[7]。鈣是中國居民缺乏嚴(yán)重程度排名第一的營養(yǎng)素，目前市場上的鈣營養(yǎng)強化劑可以分為3 類：無機鈣營養(yǎng)強化劑、有機鈣營養(yǎng)強化劑和生物鈣營養(yǎng)強化劑。碳酸鈣、氧化鈣均呈堿性，必須在胃中與大量胃酸反應(yīng)生成離子鈣后才能被吸收[8]，有機鈣營養(yǎng)強化劑溶解性好，對胃腸刺激性小，衛(wèi)生安全性高，但普遍存在著含鈣量低和有不同程度毒副作用等缺點。生物鈣以氨基酸鰲合鈣和肽鰲合鈣為代表，主要產(chǎn)品有甘氨酸鰲合鈣、膠原多肽鰲合鈣等，能以整體形式被小腸吸收，吸收率高，補鈣的同時還補充了蛋白質(zhì)和氨基酸，一舉兩得[9]。沈延等人[10]利用米曲霉生長代謝所產(chǎn)生的蛋白酶水解蝦皮中的蛋白質(zhì)，產(chǎn)生促鈣吸收的肽、氨基酸，并與蝦皮發(fā)酵過程中產(chǎn)生的游離鈣離子螯合成肽鈣螯合物。結(jié)果表明，直接發(fā)酵產(chǎn)生的游離鈣與水解生成的肽螯合成肽鈣，肽鈣得率達到0.625%±0.01%。

近年來，隨著生活水平和健康意識的提高，補充鈣元素的植物飲料備受消費者歡迎[11]，但是，目前以植物為原料開發(fā)的鈣產(chǎn)品較少。主要原因是植物中的鈣含量較少，同時由于植酸、草酸的存在，與鈣離子結(jié)合影響人體對鈣的吸收。通過發(fā)酵的方式可有效降低植物中植酸、草酸，釋放鈣離子，同時發(fā)酵可產(chǎn)生大量小分子多肽、氨基酸和多糖，其可與鈣離子結(jié)合，形成利于人體吸收的小分子螯合鈣。因此，以辣木葉原料，利用發(fā)酵技術(shù)提取辣木葉中的天然有機鈣并與辣木多肽鰲合形成辣木肽鈣鰲合物。以辣木葉提取物為主要原料，香橙粉、麥芽糊精、糖粉、酸味劑等為輔料，進行辣木高鈣固體飲料配方研究，研制一種富含辣木天然有機鈣的固體飲料，人體易吸收的補鈣產(chǎn)品。為辣木葉深加工產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木葉粉，云南天佑科技開發(fā)有限公司提供；天然橙粉，恒德堂植物原料提取廠提供；麥芽糊精，山東宏騰生物科技有限公司提供；冰乙酸、硼酸、乙醇胺、8 - 羥基喹啉、氫氧化鉀，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

菌種：嗜酸菌乳桿菌（CICC 20710）、釀酒酵母（CICC 31393）、羅伊氏乳桿菌（CICC 6226），中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，余姚市紀(jì)銘稱重校驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋，廣州標(biāo)際包裝設(shè)備有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；落地式離心機，上海東華高壓均質(zhì)機廠產(chǎn)品；SP-1500 型實驗型噴霧干燥機，上海輝展實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；凱氏定氮儀，上海祎鴻分析儀器有限公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀，Moleculart Devices 公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 辣木有機鈣制備

將辣木葉粉與去離子水混合，料液比為1∶15（g∶mL），于121 ℃下滅菌15 min，冷卻至40 ℃，無菌條件下按菌種體積1∶2∶1 接種嗜酸菌乳桿菌、酵母菌和羅伊氏乳桿菌，總接種量為辣木液體積的8.0%，于37 ℃下發(fā)酵72 h，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min 離心20 min，上清液在進風(fēng)溫度為175 ℃、進料速度為700 mL/h 的條件下噴霧干燥，得到的辣木葉提取物在密封干燥環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 工藝設(shè)計

（1） 工藝流程。原料處理→殺菌→發(fā)酵→離心（以轉(zhuǎn)速4 500 r/min 離心25 min） 上清液噴霧干燥→輔料（調(diào)配） →混勻→造粒→過篩（60 目） →干燥→成品。

（2） 操作要點。①粉碎。將天然橙粉、蔗糖、麥芽糊精、檸檬酸、蘋果酸、蔗糖等輔料分別過100 目篩。②混合。將輔料分別稱量后與一定量辣木葉提取物混合均勻，利用打粉機充分混勻。③造粒。噴灑適量水，置于混合機中攪拌5 min，制成濕料進行造粒。將造好粒的物料通過60 目的分樣篩, 收集通過篩網(wǎng)的產(chǎn)品。④干燥。將物料置于50 ℃的干燥箱中干燥1～3 h，直至產(chǎn)品水分小于5%。⑤包裝。每袋裝8±2 g 為宜, 以方便消費者食用。

1.3.3 固體飲料配方研究

（1） 單因素試驗。以固體飲料的感官評分為評價指標(biāo)，分別對天然橙粉添加量（0，10%，20%，30%，40%）、蔗糖添加量（5%，10%，15%，20%，25%）、酸味劑（檸檬酸與蘋果酸的配比為2∶5） 添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%） 進行單因素試驗。以感官評分及溶解度為評價指標(biāo)確定麥芽糊精添加量（5%，10%，15%，20%，25%）。

（2） 響應(yīng)面優(yōu)化。在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-behnken 的中心組合試驗設(shè)計原理，以天然橙粉添加量（A）、麥芽糊精添加量（B）、酸味劑添加量（C） 及蔗糖添加量（D） 為自變量，以溶解后的感官評分為指標(biāo)，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗的因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗的因素與水平設(shè)計 / %

1.3.4 感官評定

參考GB/T 15682—2008 的方法，選擇年齡在20～45 歲的10 名男性和10 名女性。取10 g 固體飲料于無色透明玻璃杯中加入60 ℃純凈水100 mL，然后先觀察色澤和聞氣味，在進行品嘗判斷出產(chǎn)品色澤、氣味、口感及組織狀態(tài)并給出評分。根據(jù)每個評價員的評分結(jié)果計算平均值，個別品評誤差大的可舍棄，舍棄后重新計算平均值[12]。最后評分的平均值，作為固體飲料的食用品質(zhì)感官評價結(jié)果。

辣木高鈣固體飲料的感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 辣木高鈣固體飲料的感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.5 理化指標(biāo)測定

（1） 固體飲料的溶解性測定。采用離心沉淀法，精密稱取10.0 g 辣木高鈣固體飲料于50 mL 燒杯中，加入100 mL 蒸餾水，然后以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心30 min，棄去上清液，將沉淀物用GB 5009.3—2010直接干燥法干燥后稱質(zhì)量得m。固體飲料的溶解度根據(jù)下式計算。

式中： S——固體飲料的溶解性，%；

m——稱量沉淀的總質(zhì)量，g；

B——固體飲料的含水量，%。

（2） 固體飲料的吸濕性測定。將底部含有飽和氯化鈉溶液的干燥器放置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中24 h，此時干燥器內(nèi)的相對濕度為75%。將調(diào)配好的固體飲料放置于鼓風(fēng)干燥箱中，于105 ℃下干燥2 h 至衡質(zhì)量。稱取2 g 已衡質(zhì)量的固體飲料粉末于平板上，放置于干燥器中。每隔24 h 取出，稱其質(zhì)量，直至吸濕平衡為止。以相對濕度75%吸濕平衡時的吸濕百分率表示吸濕性。吸濕率的計算公式為：

式中：m1——吸濕前質(zhì)量，g；

m2——吸濕后質(zhì)量，g。

（3） 鈣鰲合率的測定。稱取0.1 g 辣木葉提取物，加20 mmol/L 的Tris-HCl（pH 值7.2） 溶液5 mL，用漩渦振蕩器混合均勻，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心10 min，上清液中加入無水乙醇30 mL 靜置沉淀，再以轉(zhuǎn)速10 000 r/min 離心10 min，沉淀50 ℃下烘干并稱量，采用鄰甲酚酞絡(luò)合比色法[13]測定沉淀中鈣含量及樣品中的鈣含量。

（4） 其他理化指標(biāo)測定。按照GB 5009.3—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中水分的測定》測定水分含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007，SPSS 19.0 對試驗數(shù)據(jù)進行整理和制圖，采用Expert Design 8.0.6 統(tǒng)計軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體飲料配方的確定

利用微生物發(fā)酵制備辣木有機鈣，經(jīng)噴霧干燥制備的辣木葉提取物食用口感較差。分別添加天然橙粉、麥芽糊精、酸味劑、蔗糖，以調(diào)節(jié)產(chǎn)品風(fēng)味和口感。

輔料添加量對固體飲料感官評分及溶解度的影響見圖1。

天然橙粉是由新鮮香橙干燥后粉碎制得的，添加到飲料中可使其具有香橙特有的風(fēng)味，改善飲料口感。固體飲料的感官評分隨天然橙粉添加量的增加而升高，添加量30%時平均感官評分值最大為78.5 分，但超過40%時開始下降飲料的口感越來越差，苦澀味突出。橙粉添加量過低辣木葉提取物的苦澀味和辣味突顯出來使得固體飲料香氣變淡，影響產(chǎn)品的口感，因此確定天然橙粉添加量為30%。

蘋果酸是一種低熱量添加劑，其酸度較檸檬酸強，但味道較柔和，代謝上有利于氨基酸吸收，不積累脂肪，被生物界和營養(yǎng)界譽為“最理想的食品酸味劑[14]。檸檬酸是酸性的護色劑，可以抑制酶促褐變的發(fā)生[15]，且對抗氧化劑具有增效作用。將檸檬酸與蘋果酸配合使用，調(diào)節(jié)糖的甜度和辣木本身帶有的辛辣味。由圖1 可知，隨著酸味劑添加量的增加感官評分先增大后減?。划?dāng)酸味劑添加量為2.5%時其平均感官評分最高，達到85.25 分。這可能由于檸檬酸增加了酸度，使糖酸比失調(diào)，導(dǎo)致感官評分下降。因此，酸味劑添加量最宜為2.5%。

蔗糖作為甜味料，對固體飲料的口感和組織狀態(tài)有著重要影響。當(dāng)蔗糖添加量較少時，甜味不明顯，如果蔗糖添加量過多，會增加產(chǎn)品黏度，降低口感。由圖1 可知，產(chǎn)品感官品質(zhì)隨蔗糖添加量變化的趨勢，蔗糖最佳添加量應(yīng)為20%。

圖1 輔料添加量對固體飲料感官評分及溶解度的影響

固體飲料主要輔料需要有即溶性、口感佳等特性，麥芽糊精甜度低、無異味、溶解性好、增稠性強[16]。在飲料、液態(tài)奶、冷飲中麥芽糊精可作為重要配料，能提高產(chǎn)品溶解性，增加黏稠感和實物感，同時還具有一定的乳化作用，對食品飲料的泡沫有良好的穩(wěn)定作用[17]。當(dāng)添加量為15%時，固體飲料溶解性最佳，溶解時不產(chǎn)生泡沫，液體澄清透明，口感醇厚感官評分達到78.45 分；當(dāng)添加量為20%時，溶解度下降。因此，確定麥芽糊精添加量為15%。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面分析方案及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

2.2.2 回歸方程的建立及方差分析

回歸模型的方差分析和失擬性分析見表4。

表4 回歸模型的方差分析和失擬性分析

利用Design Expert 8.0.6 軟件對響應(yīng)面進行分析，建立辣木高鈣固體飲料感官評分：天然橙粉添加量（A）、麥芽糊精添加量（B）、酸味劑添加量（C）、蔗糖添加量（D） 的二次方程模型為：

Y=91.57-1.43A+0.083B-1.77C-0.88D-0.45AB+1.75AC-2.76AD-0.37BC+0.88BD+2.13CD-3.52A2-3.15B2-4.10C2-2.20D2.

由表4 可知，F(xiàn)=12.9，p＜0.000 1＜0.01，所以該試驗所選模型具有高度的顯著性，失擬性檢驗F=1.99，p=0.377 3＞0.05，失擬項不顯著，說明模型可以接受，即表明所選固體飲料感官評分二次回歸模型可用于預(yù)測設(shè)定的參數(shù)。R2=0.928 0，R2adj=0.856 1說明該模型能夠解釋92.8%的試驗數(shù)據(jù)變異性，擬合度較好。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗誤差小，能夠準(zhǔn)確分析和預(yù)測辣木高鈣固體飲料的感官評分，試驗操作可信度高。

2.2.3 配方參數(shù)優(yōu)化和模型驗證

經(jīng)過響應(yīng)面回歸分析得到最佳參數(shù)為天然橙粉添加量29.4%，麥芽糊精添加量15.07%，酸味劑添加量2.34%，蔗糖添加量18.85%，在此優(yōu)化條件下固體飲料的感官評分為92.08 分。在此最優(yōu)條件下進行驗證試驗，重復(fù)3 次，配制的產(chǎn)品實際感官評分為89.8 分。

2.3 辣木葉有機鈣的鰲合率

有機微量元素的螯合率，即螯合態(tài)元素的比例，研究有機微量元素螯合物產(chǎn)品的螯合率和絡(luò)合強度與其在動物體內(nèi)吸收代謝具有直接的相關(guān)性[18]。螯合率測定在衡量產(chǎn)品品質(zhì)、改進生產(chǎn)工藝、研究微量元素作用機理等方面均有重要意義。

可溶性鈣及可溶性鈣結(jié)合量見圖2。

圖2 可溶性鈣及可溶性鈣結(jié)合量

通過測定辣木葉提取物中可溶解性鈣及鰲合態(tài)鈣含量，計算得到辣木高鈣粉中鈣的螯合率為47.69%，表明肽- 鈣螯合物品質(zhì)較好，且具有較好的螯合效果。近年來，蛋白質(zhì)、肽促進鈣吸收的效果被人們廣泛關(guān)注[19]，蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物（如氨基酸、多肽等）與鈣的鰲合物穩(wěn)定性好，是一種最接近自然界的鹽的存在形式，在體內(nèi)溶解性好，不易與植酸、草酸等有機酸結(jié)合而形成沉淀，從而阻止小腸內(nèi)的鈣發(fā)生沉淀，具有較好的促進鈣吸收的能力，且鰲合鈣能以整體的形式被小腸吸收，吸收率高，吸收速度快[20]。

2.4 固體飲料理化指標(biāo)

辣木高鈣固體飲料理化指標(biāo)見表5。

表5 辣木高鈣固體飲料理化指標(biāo)/%

由表5 可知，辣木高鈣固體飲料的水分含量符合《固體飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》對水分的要求，鈣含量為0.41%，溶解度為90.24%、吸濕度為85.27%。

3 結(jié)論

以微生物發(fā)酵辣木葉制備辣木葉提取物，其中有機鈣的螯合率為47.69%。通過響應(yīng)面分析法確定辣木高鈣固體飲料最佳配方為天然橙粉添加量29.4%，麥芽糊精添加15.07%，酸味劑添加量2.34%，蔗糖添加量18.85%。在此條件下產(chǎn)品感官評分為89.8 分。辣木高鈣固體飲料鈣含量為0.41%，水分含量為4.72%，溶解度為90.24%，吸濕性為85.27%。

產(chǎn)品為麥黃色，粉末狀，無結(jié)塊，均勻一致、細膩、無雜質(zhì)。液態(tài)色澤為黃棕色，均勻一致，無雜質(zhì)澄清透明有光澤，氣味為香橙味，口感酸甜適中，香甜可口。辣木高鈣固體飲料的研究為天然蛋白肽- 鈣螯合物的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)，提高辣木葉附加值。