張中起，梁邦平，王俊濤，高保民，劉 艷，王秋玲

(菏澤市農業(yè)科學院大豆研究所，山東菏澤 274000)

肌動蛋白細胞骨架(actin cytoskeleton)在真核生物的細胞穩(wěn)態(tài)、生長發(fā)育、信號感知和細胞免疫等過程中具有重要的作用，而肌動蛋白結合蛋白(actin-binding proteins，簡稱ABPs)直接參與肌動蛋白細胞骨架的動態(tài)重排調控[1-8]。絨毛蛋白(villin，VLN)是最重要的肌動蛋白結合蛋白之一，參與肌動蛋白絲的解聚和組裝，具有成核、成帽和切割等功能[9-11]。明確大豆中VLN家族蛋白的特征特性、系統(tǒng)進化和表達特征等對于大豆育種和功能基因組學的研究具有重要意義。VLN蛋白通常具有6個凝溶膠蛋白(gelsolin，GEL)結構域[12]和1個C端可以與肌動蛋白結合的絨毛蛋白頭部(villin headpiece，VHP)結構域[13]，但也有報道顯示，棉花GhVLN6和GhVLN13蛋白缺少C端VHP結構域[14]。百合絨毛蛋白P-135-ABP具有G-actin結合活性，并以Ca2+敏感的方式加速肌動蛋白的聚合和解聚[15]。擬南芥VLN基因家族共有5個成員，所有VLN基因在不同組織中均有表達，但它們的功能有所差異[13]。擬南芥AtVLN1以不依賴Ca2+的方式結合和捆綁F-肌動蛋白，沒有成核、成帽和切割活性，但它可以穩(wěn)定肌動蛋白絲免受肌動蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor，簡稱ADF)介導的解聚[16]。轉錄因子GLABRA2介導的AtVLN1通路在根毛生長對滲透脅迫的反應中發(fā)揮重要作用[17]。擬南芥AtVLN2和AtVLN3通過肌動蛋白絲的捆綁成束在厚壁組織發(fā)育中發(fā)揮冗余作用[18]。擬南芥atvln2-atvln3雙突變植株的葉、莖、長角果和根發(fā)生扭曲，肌動蛋白細胞骨架的顯微鏡分析結果表明，細肌動蛋白絲束更豐富，而粗肌動蛋白絲束幾乎不存在[19]。擬南芥AtVLN3是一種依賴Ca2+調節(jié)的絨毛蛋白，能夠在AtVLN1存在的情況下切斷肌動蛋白絲并促進捆綁周轉[20]。擬南芥AtVLN4通過以Ca2+依賴性方式調節(jié)肌動蛋白參與根毛生長[21]。轉錄組測序分析顯示隨著擬南芥花粉萌發(fā)和花粉管生長AtVLNs基因表達葉發(fā)生著變化[22-23]。擬南芥AtVLN5是肌動蛋白絲穩(wěn)定性和周轉的主要調節(jié)因子，在花粉萌發(fā)和花粉管生長中起著不可或缺的作用[24-25]。OsVLN2通過影響水稻微絲動力學和生長素極性運輸調節(jié)植物形態(tài)結構[26-27]。GhVLN4通過調節(jié)肌動蛋白組織參與細胞伸長[28]，利用病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)技術沉默GhVLN4棉花對大麗輪枝菌的抗性降低，而過表達GhVLN4擬南芥對大麗輪枝菌、鹽脅迫和干旱的抗性提高[29]。目前，對于植物VLN基因家族及其成員的研究主要集中在擬南芥、水稻等植物中，而大豆VLN基因家族及其成員功能的研究鮮有報道。本研究以國產大豆中黃13黃金版參考基因組為基礎，利用生物信息學的方法對大豆VLN基因家族的序列特征特性、系統(tǒng)進化、表達模式等進行詳細的分析，初步探究大豆VLNs基因的功能，旨在為深入研究大豆VLN基因家族及其成員基因功能提供數(shù)據參考。

1 材料與方法

1.1 大豆VLN基因家族成員鑒定

國產大豆中黃13的高質量黃金版參考基因組Gmax_ZH13_v2.0序列和注釋文件[30-31]下載于在線數(shù)據庫SoyBase[32-33](https：//soybase.org/)；植物VLN蛋白的GEL結構域和VHP結構域的隱馬爾可夫模型文件PF00626和PF02209下載自在線數(shù)據庫Pfam[34-35](https：//pfam.xfam.org/)；利用隱馬爾可夫模型(HMM)[36]軟件包以PF00626和PF02209為探針搜索大豆基因組，獲得候選VLNs蛋白；利用在線網站NCBI-CDD[37-38](https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和SMART[39-40](http：//smart.embl-heidelberg.de/)鑒定候選的大豆VLNs蛋白，保留同時含有6個GEL結構域和VHP結構域的蛋白，最終確定為大豆VLNs蛋白。

1.2 大豆VLN家族蛋白理化性質預測

利用在線網站PDB[41](https：//www.rcsb.org/)分析大豆VLNs蛋白的三級結構；利用在線網站ExPASy[42](https：//web.expasy.org/compute_pi/)計算大豆VLNs蛋白的序列長度、分子量和理論等電點；利用在線網站Plant-mPLoc 2.0[43](http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)預測大豆VLNs蛋白的亞細胞定位。

1.3 大豆VLN基因家族序列特征分析

利用在線網站MG2C[44](http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)繪制大豆VLNs基因的染色體定位圖；利用在線網站GSDS 2.0[45](http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析大豆VLNs基因的基因結構；利用在線網站MEME[46](http：//meme-suite.org/tools/meme)分析大豆VLNs蛋白的保守基序；利用在線網站PlantCARE[47](http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/search_CARE.html)分析大豆VLNs基因上游1 500 bp的啟動子序列。

1.4 大豆VLNs蛋白系統(tǒng)進化分析

利用MEGA 11[48]軟件構建大豆、擬南芥、棉花和水稻4個物種的VLNs蛋白系統(tǒng)進化樹；利用TBtools軟件包的One Step MCScanX程序[49]分析大豆及大豆與棉花、擬南芥和水稻VLNs基因的共線性。

1.5 大豆VLNs基因的表達模式和互作網絡

通過GSA數(shù)據庫[50](https：//ngdc.cncb.ac.cn/gsa/)下載并分析中黃13的27個組織的轉錄組測序數(shù)據(GSA編號：CRA001810，項目編號：PRJCA000902)及基因表達數(shù)據；利用TBtools軟件包的HeatMap程序[49]繪制大豆VLNs基因的組織表達熱圖；利用在線網站STRING 11.5(https：//cn.string-db.org/)分析大豆VLNs蛋白的互作網絡。

2 結果與分析

2.1 大豆VLN家族的鑒定和結構域分析

本研究從大豆基因組中共鑒定到8個VLN基因(圖1、表1)，根據大豆VLNs基因的基因編號將其按順序編號為GmVLN1～GmVLN8。蛋白結構域和三級結構分析結果(圖1)表明，每個VLN蛋白均含有6個保守的GEL結構域和1個VHP結構域；大豆VLNs蛋白三級結構主要由α螺旋和β折疊構成，α螺旋數(shù)量較β折疊多。

2.2 大豆VLN家族蛋白理化性質

由表1可知，大豆VLN家族蛋白長度介于 885～984個氨基酸之間，平均為954個氨基酸；理論等電點介于5.52～5.94之間，平均為5.68；蛋白質分子量最大為108.56 ku，最小為99.41 ku，平均為106.09 ku；亞細胞定位預測結果均定位于細胞質。

表1 大豆VLN家族蛋白理化性質

2.3 大豆VLN基因家族染色體定位

大豆VLN基因家族定位于8條染色體(圖2)，GmVLN1～GmVLN8分別定位于2號、3號、8號、9號、10號、15號、18號和19號染色體，其中GmVLN1、GmVLN2、GmVLN3和GmVLN8分布在染色體的短臂端，GmVLN4、GmVLN5、GmVLN6和GmVLN7分布在染色體的長臂端。

2.4 大豆VLN基因家族基因結構

大豆VLN基因家族具有相對保守的基因結構，由圖3可知，大豆VLNs基因的基因組序列長度較長，最短的在13 000 bp以上，最長近21 000 bp，外顯子和內含子數(shù)量較多，外顯子數(shù)量平均20多個；除GmVLN4外，進化樹中聚類在同一組的VLNs基因具有相似的基因結構特征。

2.5 大豆VLN家族保守基序

通過在線網站MEME分析大豆VLN家族蛋白的保守基序，分析結果見圖4，大豆VLN家族蛋白共包含10個特異性的保守基序，除保守基序9的氨基酸長度較短外，其他9個保守基序的氨基酸長度相對接近；處于進化樹末端分枝的VLNs蛋白具有類似的保守基序分布特征，其中基序9、基序10的分布位置較為緊湊，基序3、基序5的分布位置較為緊湊，而基序6分布在蛋白的末端。

2.6 大豆VLN基因家族啟動子元件

由大豆VLN基因家族的基因啟動子區(qū)順勢調控的元件數(shù)量分布見圖5，大豆VLNs基因的啟動區(qū)主要含有基因轉錄必須的CAAT-box和TATA-box元件、光響應元件、植物激素響應元件、非生物脅迫響應元件和生物脅迫響應元件。其中GmVLN4具有最多的光響應元件，有14個，GmVLN7具有最多的赤霉素響應元件，具有茉莉酸響應元件和生長素響應元件的VLNs基因較少，除GmVLN2以外均具有水楊酸響應元件，GmVLN4具有最多的脫落酸響應元件，僅3個大豆VLNs基因具有乙烯響應元件；6個大豆VLNs基因具有創(chuàng)傷響應元件；大豆VLNs具有數(shù)量較多的干旱脅迫響應元件，低溫脅迫響應元件和高溫脅迫響應元件數(shù)量相對較少；除GmVLN1和GmVLN5以外均具有生物脅迫響應元件。

2.7 大豆、擬南芥、棉花和水稻VLN家族系統(tǒng)進化樹

由大豆、擬南芥、棉花和水稻VLN家族蛋白構成的系統(tǒng)進化樹聚類結果見圖6，可將4個物種的VLN家族蛋白分為3個組，每組均含有4個物種的VLNs蛋白；第Ⅰ組包含的VLNs蛋白數(shù)量最少，為6個，其中有大豆GmVLN3和GmVLN7；第Ⅱ組包含11個VLNs蛋白，其中棉花VLNs蛋白數(shù)量最多，為4個，大豆VLNs蛋白2個，分別為GmVLN4和GmVLN6；第Ⅲ組包含的VLNs蛋白數(shù)量最多，為15個，其中棉花VLNs蛋白數(shù)量最多，為8個，大豆VLNs蛋白4個，分別為GmVLN1、GmVLN2、GmVLN5、GmVLN8。大豆VLNs蛋白分布在進化樹末端相鄰的分枝，遺傳距離上大豆VLNs蛋白與棉花VLNs蛋白最近，與擬南芥次之，與水稻稍遠。

2.8 大豆VLN基因家族復制事件和共線性

對大豆、棉花和擬南芥的VLNs基因進行基因復制和共線性關系聯(lián)合分析，由表2、圖7-B可知，大豆VLN基因家族間共有4對旁系同源基因對，包括GmVLN1-GmVLN2、GmVLN1-GmVLN5、GmVLN2-GmVLN5和GmVLN3-GmVLN7；由表2、圖7-C可知，大豆與陸地棉VLN基因家族間共有9對直系同源基因對，大豆與擬南芥VLN基因家族間共有8對直系同源基因對，而大豆與水稻VLN基因家族間未鑒定到直系同源基因對。

大豆VLNs旁系同源基因對的非同義替換率(non-synonymous substitution，簡稱Ka)與同義替換率(synonymous substitution，簡稱Ks)的比值見表2，大豆VLNs基因在進化過程中經歷了不同的選擇壓力水平；大豆4對VLNs旁系同源基因對的Ka/Ks介于0.21～0.28之間，均小于1，蛋白序列相似度介于88%～97%之間，表明大豆VLNs基因主要受到純化選擇壓力，基因家族成員數(shù)量主要以片段復制的形式擴張，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)復制事件的發(fā)生。

2.9 大豆VLN基因家族組織表達模式

為初步探究大豆VLN基因家族的功能，利用大豆品種中黃13在不同生育期的27個組織的轉錄組測序數(shù)據，分析了VLN基因家族的組織表達特征。由圖8可知，大豆VLNs基因具有組織表達和時空表達特異性，依據表達特征將大豆VLN基因家族分為2組：第1組包含GmVLN2、GmVLN7和GmVLN8，該組基因表達量相對較低，在27個組織中未出現(xiàn)突出的組織優(yōu)勢表達特征。第2組包含GmVLN1、GmVLN3、GmVLN4、GmVLN5和GmVLN6，其中在根和莖中優(yōu)勢表達的基因有GmVLN3、GmVLN5和GmVLN6；在花中優(yōu)勢表達的基因有GmVLN1和GmVLN5；在莢皮和豆莢中優(yōu)勢表達的基因較多，主要有GmVLN1、GmVLN3、GmVLN4、GmVLN5和GmVLN6。大豆VLN基因家族多樣化和特異性的組織表達特征暗示著其功能的潛在多樣性和復雜性。

2.10 大豆VLNs蛋白互作網絡

利用STRING網站預測并構建了大豆VLNs蛋白互作網絡，由圖9可知，大豆VLNs蛋白間存在互作關系，其中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，簡稱PI3K)LOC547983處于蛋白互作的核心位置，與膜增殖有關；Obg-like ATPase 1在蛋白互作網絡中葉具有一定的協(xié)調作用；GmVLN4和GmVLN8相互作用處于蛋白互作網絡的獨立區(qū)域，由包含HP結構域的蛋白作為中間媒介與其他大豆VLNs蛋白建立互作聯(lián)系。

3 討論

VLN基因在植物的生長發(fā)育和脅迫響應過程中發(fā)揮著重要的作用。在擬南芥、棉花和百合等作物中，VLN基因的功能大多與生長發(fā)育、非生物脅迫和生物脅迫有關。關于VLN基因家族在大豆中的研究并不多。本研究首次從大豆全基因組水平鑒定到8個VLN家族基因，屬于擬南芥和水稻的5個VLNs基因[13，27]，而少于棉花的14個VLNs基因[14]，VLN家族基因數(shù)量的差異可能與物種基因組大小和基因組復制有一定的關系。

通過生物信息學的方法分析了大豆VLNs基因的特征特性，根據8個GmVLNs基因染色體上的分布將其命名為GmVLN1～GmVLN8。大豆VLNs蛋白均具有8個GEL結構域和1個VHP基因結構，分子量和理論等電點有一定的差異，但亞細胞定位均在細胞質，這一預測結果與棉花GhVLN4定位于細胞質(細胞骨架)相符合[28]，說明大豆VLNs蛋白可能也與細胞骨架構建有一定的關系?；蚪Y構分析發(fā)現(xiàn)，大豆VLN家族基因的內含子和外顯子數(shù)量較多，平均有20個，且基因序列較長，這一特征與前人有關擬南芥、水稻和棉花VLN家族的基因結構研究結果相符合，表明VLNs基因在物種間具有一定的保守性。大豆VLN家族蛋白均含有10個相同的保守基序，表明家族成員間具有一定的結構相似性。大豆VLN家族基因啟動子元件分析結果表明，除含有與基因轉錄必須的CAAT-box和TATA-box元件以及生長發(fā)育必須的光響應元件以外，不同家族成員還含有大量的植物激素響應元件、非生物脅迫響應元件和生物脅迫響應元件，其中VLNs基因具有較多數(shù)量的赤霉素響應元件、水楊酸響應元件和脫落酸響應元件，但茉莉酸響應元件、乙烯響應元件和生長素響應元件的數(shù)量較少；此外大豆VLNs基因具有數(shù)量較多的傷害響應元件和干旱脅迫響應元件，但低溫脅迫響應元件和熱脅迫響應元件數(shù)量相對較少。

由系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果可知，大豆VLN家族蛋白分為3個組，成員間分布在進化樹末端相鄰的分枝，遺傳距離上與棉花VLNs蛋白最近，與擬南芥次之，與水稻最遠。基因復制和共線性分析結果表明，大豆VLN基因家族間共有4對旁系同源基因對，大豆與陸地棉和擬南芥VLN基因家族間均有直系同源基因對，但大豆與水稻VLN基因家族間沒有鑒定到直系同源基因對，分析結果也與物種進化樹和VLN家族蛋白進化樹的結果相呼應。大豆4對VLNs旁系同源基因對的Ka/Ks計算結果表明，大豆VLNs基因主要受到純化選擇壓力，基因家族成員數(shù)量主要以片段復制的形式擴張，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)復制事件的發(fā)生。

本研究對大豆VLN家族基因的組織表達模式進行了詳細分析，初步探究了大豆VLNs基因可能參與生長發(fā)育的功能。依據表達特征將大豆VLN基因家族分為2組，其中在根、莖、花、莢和種子中均發(fā)現(xiàn)了特異性表達的GmVLNs基因，表明大豆VLN家族基因在功能具有多樣性和復雜性。大豆VLN家族蛋白互作網絡表明成員間可能存在互作關系，其中磷脂酰肌醇3-激酶處于蛋白互作的核心位置連接著大多數(shù)的VLN蛋白。

4 結論

本研究從大豆中共鑒定到8個VLNs基因，分別定位于8條染色體，并將其命名為GmVLN1～GmVLN8。大豆VLN家族蛋白的分子量和理論等電點有一定的差異但亞細胞定位均在細胞質。大豆VLN家族基因的外顯子和內含子數(shù)量較多，啟動子區(qū)具有數(shù)量較多的CAAT-box和TATA-box元件以及生長發(fā)育必須的光響應元件，此外部分VLNs基因還含有大量的植物激素響應元件、非生物脅迫響應元件和生物脅迫響應元件。大豆VLN基因家族間共有4對旁系同源基因對，主要受到純化選擇壓力，與棉花VLNs蛋白遺傳距離上較近。部分大豆VLNs基因在根、莖、花、莢和種子中特異性表達。大豆VLN家族蛋白互作網絡表明成員間可能存在互作關系。本研究為深入表征大豆VLN基因家族成員的功能以及表達互作調控機制提供了重要理論數(shù)據。